河八王分蘗基因NpD53克隆及其生物信息學(xué)分析.doc

河八王分蘗基因NpD53克隆及其生物信息學(xué)分析 摘要：目的克隆河八王Narengaporphyroa（Hance）Bor分蘗基因NpD53，并分析其序列特征，為甘蔗野生種分蘗的分子機理研究提供理論參考。方法以河八王為試驗材料，提取其葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過RACE（cDNA末端快增）技術(shù)擴增NpD53基因，并采用生物信息學(xué)方法對其核苷酸序列及編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果NpD53基因（GenBank登錄號MF593461）的中間序列長度760bp、5端序列長度1497bp、3端序列長度1233bp，拼接后其cDNA序列全長為2597bp，包含1個2037bp的開放閱讀框（ORF），編碼678個氨基酸，蛋白分子量75.02kD，等電點6.59，親水性平均數(shù)-0.506，表明其為親水性蛋白，位于細(xì)胞核內(nèi)（可信度94.1%）。NpD53基因編碼蛋白（NpD53）存在P-looRNTPase和ClpBD2-small超家族核心序列，含有4個非特異性位點，與其他物種的D53蛋白均具有相同的保守結(jié)構(gòu)域ClpBD2-small；其二級結(jié)構(gòu)僅有4種卷曲類型，以無規(guī)則卷曲最多，占42.77%，其次是-螺旋，占35.55%，延伸鏈和-轉(zhuǎn)角分別占15.34%和6.34%。NpD53蛋白的氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，河八王與禾本科物種（高粱和山羊草）的親緣關(guān)系較近，與海棗、油棕、芭蕉等物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)論河八王分蘗基因NpD53編碼蛋白與其他物種的D53蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，且具有2個I類clDATP酶的非特異性位點，推測NpD53為一種分子伴侶，與河八王自身的耐熱性相關(guān)。 關(guān)鍵詞：河八王；NpD53基因；克?。恍蛄蟹治?；RACE 0引言 研究意義河八王Narengaporphyroa（Hance）Bor是一個甘蔗野生種，具有分蘗力強、耐貧瘠、耐旱等優(yōu)良性狀（李楊瑞，xx）。甘蔗產(chǎn)量受單位面積有效莖數(shù)影響，而有效莖數(shù)由甘蔗的有效分蘗決定（李楊瑞，xx）?？梢姡痔Y是農(nóng)作物莖數(shù)和穗數(shù)的重要性狀因子，對作物產(chǎn)量有重要影響（呂愛麗等，xx），而DWARF53（D53）基因編碼的D53蛋白與獨腳金內(nèi)酯信號分子D14蛋白和D3蛋白互作形成D53-D14-SCFm蛋白復(fù)合體，D53蛋白作為獨腳金內(nèi)酯信號途徑的抑制子，參與植物分蘗（分枝）等生長發(fā)育過程（Zhouetal.，xx）。因此，研究河八王分蘗基因D53及其分子調(diào)控機理，利用轉(zhuǎn)基因或雜交等技術(shù)進(jìn)行甘蔗遺傳改良對提高甘蔗產(chǎn)量具有重要意義。前人研究進(jìn)展獨腳金內(nèi)酯是一種新型植物激素，屬萜類內(nèi)酯，可抑制植物分枝生長、促進(jìn)側(cè)根形成和誘導(dǎo)根毛伸長，從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育（Gomez-Roldaal.，xx；吳轉(zhuǎn)娣等，xx），D14蛋白、F-box蛋白和D53蛋白等參與其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（陳虞超等，xx）。已有研究發(fā)現(xiàn)，水稻的3種DWARF蛋白（D27、D17和D10）將反式B-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變成獨腳金內(nèi)酯的前體己內(nèi)酯（Alderetal.，xx），其他2種DWARF蛋白（D14和D3）在獨腳金內(nèi)酯的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用（Ishikawetal.，xx；Ariteetal.，xx）。其中D14蛋白屬于/-水解酶折疊家族，是獨腳金內(nèi)酯的受體（Aldereta1.，xx），D3蛋白是一個富集亮氨酸重復(fù)序列的F-box蛋白，參與獨腳金內(nèi)酯信號的接收（Zhaoetal.，xx）。D53蛋白是連接獨腳金內(nèi)酯信號接收和應(yīng)答的重要抑制因子，當(dāng)D53被降解，獨腳金內(nèi)酯抑制植物分蘗（分枝）；當(dāng)D53未被降解，則獨腳金內(nèi)酯受到抑制，促使植物多分蘗（分枝）（Jiangetal.，xx）。D53基因是水稻的顯性基因之一。Wei等（xx）構(gòu)建了水稻顯性矮稈突變體dwarf（d53），通過圖譜定位發(fā)現(xiàn)D53基因定位于11號染色體的斷臂上。Jiang等（xx）克隆獲得水稻的D53基因全長。本研究切入點目前，未見有關(guān)甘蔗野生種河八王分蘗基因的研究報道。擬解決的關(guān)鍵問題利用RACE（cDNA末端快增）技術(shù)克隆河八王D53基因（NpD53）全長，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為甘蔗野生種分蘗的分子調(diào)控機理研究提供理論參考。 1材料與方法 1.1試驗材料 供試材料為河八王，保育于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所。RNAprepPure植物總RNA提取試劑盒、DNaseIRebinant和SMARTerRACE5/3Kit購白天根生化科技（北京）有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2總RNA提取及cDNA合成 剪取約0.1g河八王幼嫩葉片，參照RNAprepPure植物總RNA提取試劑盒說明提取其總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，并參照SMARTerRACE5/3Kit說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 1.3NpD53基因克隆 1.3.1中間序列擴增參考水稻分蘗基因D53（GeneBank登錄號KF709434.1）設(shè)計其中問序列的擴增引物（表1），反應(yīng)體系（25.0uL）配置和擴增程序設(shè)置均參照2xESTaqMasterMix產(chǎn)品說明進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接至pMD19-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR驗證后，把含目的片段的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。 1.3.2兩端序列擴增以NpD53基因的中間序列為基礎(chǔ)，設(shè)計NpD53基因5與3端RACE特異性引物（表1），采用RACE技術(shù)克隆NpD53基因的5與3末端序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接至pMD19-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR驗證后，把含目的片段的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。對測序正確的5與3端序列進(jìn)行拼接，得到NpD53基因cDNA全長序列。 1.4生物信息學(xué)分析 利用ORFFinder找出NpD53基因的開放閱讀框（ORF）編碼區(qū)。將獲得的NpD53基因cDNA提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，利用BLASTI具對其編碼蛋白（NpD53）進(jìn)行氨基酸序列比對；基于NpD53蛋白的氨基酸序列與相似性較高的序列，利用MEGA6.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析河八王與其他物種之間的親緣關(guān)系。 利用ExPASyProteomicsServer在線軟件ProtParam預(yù)測NpD53蛋白的理化性質(zhì)；利用ProtScale預(yù)測NOD53蛋白的親/疏水性；利用NCBIBLAST-E具預(yù)測NpD53蛋白的結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA軟件預(yù)測NOD53蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用TMHMMServerv.2.0預(yù)測NpD53蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；利用在線軟件SWISSMODEL構(gòu)建NpD53蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型；利用Wolf-Sport在線軟件預(yù)測NpD53蛋白的亞細(xì)胞定位。 2結(jié)果與分析 2.1NpD53基因克隆結(jié)果 由圖1可知，總RNA的28S和18S條帶明亮、清晰、完整，無其他雜質(zhì)污染，說明提取的河八王幼嫩葉片總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)試驗。 PCR擴增NpD53基因，其測序結(jié)果顯示，NpD53基因的中間序列長度760bp，5端序列長度1497bp，3端序列長度1233bp，經(jīng)ContigExpress軟件拼接后，其cDNA序列全長為2597bp。 2.2NpD53基因同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將克隆獲得的NpD53基因cDNA序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸序列比對，結(jié)果顯示，該序列與高粱（Sorghumbicolor）（XIVl002441614.2）、玉米（ZeamarsL_）（KUl31574.1）和水稻（Orvzasativa）（KF709434.1）的D53基因核苷酸序列的同源性分別為95%、86%和77%，說明本研究克隆獲得的基因為河八王分蘗基因D53。利用ORFFinder找到NpD53基因的ORF編碼區(qū)（238-2364bp），長度為2037bp，編碼678個氨基酸，其中5非編碼區(qū)長度為237bp，3非編碼區(qū)長度為233bp（圖2）。 NpD53基因編碼蛋白（NOD53）與高粱（XP002441659.1）、山羊草（Aegilopstauschii）（XP0xx-8048.1）、小麥（Triticumaestivum）（ARB18226.1）和海棗（Phoenixdactylifera）（XP008805019.1）D53蛋白的氨基酸序列同源性分別為91%、63%、59%和39%。利用MEGA6.0進(jìn)行氨基酸多序列比對，結(jié)果（圖3）顯示，NpD53與禾本科物種具有較高的同源性，其中與高粱的2個D53蛋白同源性最高，分別為91%和85%，而與海棗、油棕（Elaeisguineensis）、芭蕉（Musaacuminatasubsp.malaensis）等物種的同源性僅30%-40%，說明河八王與海棗、油棕、芭蕉等物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與高粱的親緣關(guān)系較近。 2.3NOD53蛋白的理化性質(zhì)及親/疏水性預(yù)測結(jié)果 NpD53蛋白的理化性質(zhì)及親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白分子式為C3226H5162N96401034532，分子量為75.02kD，由678個氨基酸組成，其中包含負(fù)電荷氨基酸殘基86個和正電荷氨基酸殘基82個，絲氨酸含量最高，達(dá)13.0%；理論等電點（pI）為6.59，為酸性蛋白質(zhì)；親水性平均數(shù)為-0.506，有較多區(qū)段位于0分以下，以親水性為主（圖4），表明其為親水性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為54.83，半衰期約為30h，說明其為不穩(wěn)定蛋白。 2.4NOD53蛋白的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果 利用NCBIBLAST-E具預(yù)測NOD53蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖5）顯示，該蛋白存在P-loopNTPase和ClpBD2-small超家族核心序列，含有4個非特異性位點：ClpA、AAA2、ClpVl和ClDC。與圖3中的其他物種均具有相同的保守結(jié)構(gòu)域ClpBD2-small。 2.5NOD53蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)分析 NpD53蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（表2）顯示，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)僅有4種卷曲類型，其中無規(guī)則卷曲最多，占42.77%，其次是-螺旋，占35.55%，延伸鏈和-轉(zhuǎn)角分別占15.34%和6.34%。NpD53蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。NpD53蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖6所示，同源模型為MecA-ClpC復(fù)合物（3j3u.1），但同源性較低，僅19.3%。NpD53蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，可信度94.1%。 3討論 獨腳金內(nèi)酯屬類胡蘿卜素植物激素，Jiang等（xx）、Zhou等（xx）研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中D53蛋白為獨腳金內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制因子，Liu等（xx）發(fā)現(xiàn)D53基因在小麥分蘗和穗數(shù)上起一定的調(diào)控作用。本研究首次從河八王中克隆得到NpD53基因，可為后續(xù)河八王分蘗機制研究打下理論基礎(chǔ)。 應(yīng)用RACE技術(shù)可對mRNA末端進(jìn)行快速擴增，具有快速、穩(wěn)定和成功率高等優(yōu)點，是有效獲取cDNA全長的有效手段之一（唐克軒等，xx）。本研究采用RACE技術(shù)克隆獲得河八王NpD53基因，其具有完整的ORF，其編碼蛋白NpD53的氨基酸序列與其他物種的D53蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域clpBD2-small，與禾本科物種的同源性較高，其中與高梁的2個D53蛋白同源性最高，分別為91%和85%，而與海棗、油棕、芭蕉等物種的相似性僅30%-40%，說明不同物種問的D53蛋白可能有不同的結(jié)構(gòu)和功能。ClpB是HSP100/Clp蛋白家族的一員，與細(xì)胞的耐熱性緊密相關(guān)，可溶解熱脅迫下的蛋白聚集體，從而減少熱激對細(xì)胞產(chǎn)生的損害，其序列具有高度保守特性（Katiyar-Agarwaletal.，xx）。其中胞質(zhì)型HSPl01/ClpB蛋白是植物抗高溫必需的因子，推測HSPl01/ClpB轉(zhuǎn)基因水稻有較高的耐熱性（Katiyar-Agarwaletal.，xx；楊金瑩等，xx）。由此推測河八王中的ClpB也與植株的自身耐熱性有關(guān)。 已有研究證實，D53蛋白與I類ClpATP酶類有相似的結(jié)構(gòu)（Zhouetal.，xx），ClpATP酶是細(xì)菌中高度保守的調(diào)節(jié)亞基，是一種分子伴侶，其自身無水解活性，其中I類ClpATP酶類帶有2個不同的ATP結(jié)合區(qū)域（Freesetal.，xx）。本研究河八王NpD53蛋白序列中