東南景天內(nèi)生菌分離鑒定及其強(qiáng)化重金屬超積累效應(yīng)與機(jī)制

1、東南景天內(nèi)生菌分離鑒定及其強(qiáng)化重金屬超積累效應(yīng)與機(jī)制土壤重金屆污染是目前面臨的一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問題，由于采礦、冶金、金屆制造業(yè)排污，農(nóng)業(yè)和城市生活廢物的填埋和污水灌溉，導(dǎo)致土壤重金屆污染日益嚴(yán)重。植物修復(fù)是一種新型的、價(jià)格低廉并且可持續(xù)發(fā)展的原位修復(fù)技術(shù)。重金屆超積累植物是修復(fù)重金屆污染土壤、底泥和水體資源的良好材料。然而，大多數(shù)重金屆超積累植物都存在生物量小、生長速度緩慢、根系不發(fā)達(dá)以及根際土壤重金屆生物有效性低等限制其大規(guī)模修復(fù)應(yīng)用的因素。為了提高植物修復(fù)效率，一些促進(jìn)超積累植物生長及強(qiáng)化根際重金屆生物有效性的策略也在逐漸引起大家的關(guān)注。超積累生態(tài)型東南景天(SedumalfrediiHan

2、ce)是最初在浙7工省衢州市古老PbZn礦址上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)中國原生的Zn/Cd超積累植物，也能積累Pb,不僅是研究植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和超積累Zn/Cd機(jī)理的良好模式材料，也是提升植物修復(fù)重金屆污染技術(shù)的良好材料。盡管東南景天在生長速率和生物量上相比多數(shù)重金屆超積累植物要有些優(yōu)勢，但其修復(fù)土壤重金屆污染的效率還是受到生長慢、生物量小、適應(yīng)性弱和土壤重金屆可及性的限制，研發(fā)促進(jìn)東南景天生長和抗逆、提高東南景天生物量、提高東南景天對土壤重金屆可及性和吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、積累重金屆能力的微生物強(qiáng)化技術(shù)對于發(fā)揮東南景天修復(fù)重金屆污染的潛能，提高實(shí)際應(yīng)用的效率至關(guān)重要。本研究主要研究結(jié)果如下：1.用以1-氨基環(huán)丙烷-

3、1毯酸(ACC)為唯一氮源并添加Zn、Cd和/或Pb的多碳源無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基，從超積累植物東南景天原生地的植株和根際土壤中分離得到85個(gè)耐受重金屆的細(xì)菌菌株。對細(xì)菌16SrRNA基因(16SrDNA)序列的分析顯示所得細(xì)菌分別歸屆于變形菌門(55%)，放線菌門(27%)，厚壁菌門(11%)和擬桿菌門(7%)的20個(gè)屆，其中45個(gè)(53%)菌株可能分別代表8個(gè)屆的15-17個(gè)新種。從28個(gè)菌株中擴(kuò)增得到ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因(acdS)的片段，其中21個(gè)菌株在自由培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出ACC兌氨酶活性，另7個(gè)不表現(xiàn)ACCB氨酶活性的貪Cu菌屆菌株的acdS與其16SrDNA序列在系統(tǒng)發(fā)育上不符，可能在進(jìn)

4、化過程中通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得了acdS。所有菌株都不同程度地耐受Zn、Cd和/或P&從根際土壤，根和地上部分離到的菌株中能耐受較高濃度Zn、Cd或Pb的比例往往與原生境中該金屆的濃度正相關(guān)，顯示出原生地土壤和植株中高濃度的重金屆對細(xì)菌耐受重金屆的選擇作用和與東南景天聯(lián)合細(xì)菌對生境中重金屆的適應(yīng)性。大多數(shù)菌株能產(chǎn)生呵噪乙酸，嗜鐵素或溶磷，有促進(jìn)植物生長和提高土壤中重金屆可溶性的潛能。2.研究了從東南景天體內(nèi)分離的伯克氏菌屆9Burkholderia)的SaZR4,SaMRIC#肖氨醇單胞菌屆(Sphingomonas)的SaMRI引貪噬菌屆(Variovorax)的SaNRI四個(gè)菌株的內(nèi)

5、生特性、在根部的定殖模式及其強(qiáng)化植物提取重金屆的能力。激光掃描共聚焦顯微鏡的觀測結(jié)果表明菌株SaZR4,SaMRI密日SaNR俱有在植物根部形成生物被膜(biofilm)的能力,SaZR4和SaMRI匆以定殖在根內(nèi)部組織。SaMRI并東南景天體內(nèi)定殖的總量是最低的，對東南景天生長和提取重金屆的促進(jìn)作用也是最弱的。SaZR4顯著強(qiáng)化了東南景天對Zn的提取，但是對Cd的提取沒有顯著影響。SaMRI引SaNR何以在含有Zn或Cd的基質(zhì)中顯著促進(jìn)東南景天生長并提高了對Zn或Cd的提取。結(jié)果表明所用的四株特異內(nèi)生細(xì)菌能以不同的方式在植物體內(nèi)定殖、調(diào)控植物生長及提取和積累重金屆。SaMRI慶日SaNRI&

6、#174;株具有強(qiáng)化東南景天修復(fù)Zn和Cd污染土壤的應(yīng)用潛力。3.基于伯克氏菌屆的SaZR4,鞘氨醇單胞菌屆的SaMRI卻貪噬菌屆的SaNRI能促進(jìn)東南景天生長和吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)Zn和/或Cd的潛能,進(jìn)一步用它們接種在兩種重金屆復(fù)合污染土壤上生長的東南景天，檢驗(yàn)了內(nèi)生細(xì)菌對東南景天修復(fù)重金屆復(fù)合污染土壤的作用；基于東南景天的多年生特性，采用兩季收獲地上部和多次接種,檢驗(yàn)了內(nèi)生細(xì)菌應(yīng)用于強(qiáng)化多年生超積累植物連續(xù)提取重金屆的可行性。結(jié)果表明接種內(nèi)生細(xì)菌可以連續(xù)兩季顯著提高在兩種重金屆復(fù)合污染土壤上生長的東南景天地上部的生物量，提高東南景天對Zn和Cd的提取量，而且提高最后所收獲根部的生物量，提高了植物對

7、Pb和Cu的提取量，證實(shí)了連續(xù)接種內(nèi)生細(xì)菌結(jié)合多季收獲東南景天修復(fù)重金屆復(fù)合污染土壤的可行性。4.SaCS12®從在礦山原生境健康生長的東南景天體內(nèi)分離到的一株耐受多種重金屆并可以用人工培養(yǎng)基純培養(yǎng)的真菌。根據(jù)菌落形態(tài)、抱子形態(tài)和分子鑒定初步將其確定為尖抱鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。致病性檢測結(jié)果表明SaCS12對易發(fā)生枯萎病和根腐病的農(nóng)作物沒有致病性。通過溶液培養(yǎng)與土培盆栽試驗(yàn)研究了該真菌對東南景天的生長和吸收積累重金屆的影響。水培結(jié)果表明SaCSI珂以增加根長和表面積、促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，促進(jìn)了植物對營養(yǎng)元素的吸收和葉綠素的合成。顯微觀察結(jié)果表明SaCSI況進(jìn)了東南景

8、天根毛的發(fā)育，擴(kuò)大了根毛區(qū)在根系中的比例。SaCS1矛T以促進(jìn)東南景天在礦山土和水稻土兩種原始重金屆復(fù)合污染土壤上的生長，能夠強(qiáng)化東南景天對土壤中重金屆的活化，增加了植物對重金屆的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)。和不接種對照相比，接種植物對Zn、CdPb和Cu的植物修復(fù)效率在礦山土上分別增加了144、139、84和63%,在水稻土上分別增加了44、55、85和77%研究發(fā)現(xiàn)了一種可培養(yǎng)真菌而非菌根真菌強(qiáng)化超積累植物修復(fù)重金屆污染土壤的作用，發(fā)現(xiàn)了非致病尖抱鐮刀菌在植物修復(fù)重金屆中的應(yīng)用潛力。5.采用水培實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)比較了內(nèi)生真菌印度梨形抱(Piriformosporaindica)對兩種生態(tài)型東南景天生長、根系形態(tài)、

9、營養(yǎng)元素吸收及重金屆吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。在Zn或Cd處理下，超積累生態(tài)型比非超積累生態(tài)型具有更好的耐性以及吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)重金屆的能力。印度梨形抱能夠在兩種生態(tài)型東南景天根部定殖，促進(jìn)兩種生態(tài)型植物根系的生長發(fā)育，提高了植物體內(nèi)氮和磷含量，促進(jìn)了植物生長。印度梨形抱可以提高兩種生態(tài)型東南景天對Zn和Cd的耐性，但是對二者在吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)重金屆方面卻有不同的調(diào)控作用。印度梨形抱可以提高超積累生態(tài)型對Zn和Cd的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)，提高Zn和Cd在植物地上部的積累，地上部Zn和Cd積累量分別是不接種對照的1.17-1.75倍和1.83-2.21倍。而對非超積累生態(tài)型，在200MZn或10MCd處理水平下，非超積累生態(tài)型已經(jīng)表現(xiàn)出了重金屆蠹害癥狀。印度梨形抱可以通過降低非超積累生態(tài)型對Zn或Cd的吸收在一定程度上緩解重金屆的蠹害作用。研究表明印度梨形抱能強(qiáng)化超積累植物提取和積累重金屆，在植物修復(fù)重金屆污染中發(fā)揮作用，也能幫助非金屆積累植物耐受重金屆。研究發(fā)現(xiàn)與東南景天在原生境聯(lián)合生長的細(xì)菌具有豐富的多樣性和新穎的基因型，有些細(xì)菌能以不同的方式在