試論化療藥順鉑對Wnt通路抑制因子的表達(dá)作用

1、試論化療藥順鉑對Wnt通路抑制因子的表達(dá)作用         【摘要】  目的 研究抗腫瘤藥順鉑（cisplatin,Pt）對Wnt通路抑制因子FrpHE（frizzled relatd protein）和 DKK1（dickkopf1）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法 培養(yǎng)人肝癌HepG2、Hep3B、人大腸癌Lovo和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，并分別加入5 mol/L Pt作用24 h,以RTPCR技術(shù)檢測FrpHE和DKK

2、1mRNA，以流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞中Wnt通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子catenin的表達(dá)。結(jié)果 順鉑作用24 h后,FrpHE mRNA表達(dá)水平在人肝癌細(xì)胞較對照組表達(dá)水平顯著增加(P0.001)。在人大腸癌細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，未見FrpHE mRNA表達(dá)。DKK1mRNA表達(dá)水平在加入Pt作用后的人肝癌細(xì)胞、人大腸癌細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞均較對照組表達(dá)水平顯著增加。catenin的陽性細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度與對照組相比均降低（P0.001）。結(jié)論 化療藥順鉑能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞FrpHE mRNA和人肝癌、腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞DKK1

3、 mRNA的表達(dá),抑制Wnt通路。  【關(guān)鍵詞】  FrpHE；DKK1；Wnt 通路；catenin Abstract:Objective To investigate the effects of antitumordrug cisplatin on the expression of secreted frizzledrelated protein (sFRP) and 

4、Dickkopf1（DKK1）, a Wnt pathway inhibitor. Methods Human Hep3B，HepG2，Lovo, and U251 cells were transfected with antitumordrug cisplatin, catenin expression was measured by fluorescenceactivated

5、60;cell sorting (FACS) and then wnt signaling pathway inhibitor FrpHE and DKK1 expression was detected by (RT)PCR. Results FrpHE mRNA in Hep3B and HepG2 cells was initial

6、ly potentiated by antitumordrug cisplatin after 24 h, no inhibitor FrpHE was expressed in Lovo and U251, DKK1 mRNA in Hep3B, HepG2, Lovo, and U251 cells was initiall

7、y potentiated by antitumordrug cisplatin after 24 h, catenin positive cells percent and fluorescence intensity were descent. Conclusion Antitumordrug cisplatin promotes mRNA expression 

8、of wnt signaling pathway inhibitor DKK1 and FrpHE, and Wnt pathway was inhibited.  Key words:FrpHE; DKK1; Wnt signaling pathway; catenin   Wnt信號通路是一條與腫瘤有密切關(guān)系的信號傳導(dǎo)通路，在許多腫瘤細(xì)胞中存在有Wnt信號的異常調(diào)控和過度表達(dá)。因此，

9、通過抑制Wnt通路的異?；罨赡苁侵委熌[瘤的一條新途徑。SFRP是一種分泌型糖蛋白，其與Wnt受體形成三聚體后，誘導(dǎo)快速的細(xì)胞內(nèi)吞，減少了細(xì)胞膜上的受體，它可能與受體競爭結(jié)合Wnt蛋白，直接與Wnt蛋白結(jié)合，由此阻斷了Wnt信號傳導(dǎo)通路2。DKK是一種分泌型糖蛋白，通過作用于卷曲蛋白和散亂蛋白拮抗Wnt信號傳導(dǎo)通路3。研究發(fā)現(xiàn)，外源性p53可通過誘導(dǎo)DKK、FrpHE抑制Wnt信號通路產(chǎn)生抗腫瘤的效果，Wnt信號通路很可能會作為抗腫瘤作用的一個(gè)靶點(diǎn)，但Wnt信號通路是否存在其它抗腫瘤藥物（如化療藥物）的作用靶點(diǎn)，這對于闡明化療藥在腫瘤發(fā)病中所起的作用以及在腫瘤治療中的應(yīng)用非常有意義。本研究選擇

10、了頗有代表性的常用化療藥順鉑，探討其對Wnt通路抑制因子表達(dá)的影響，以了解順鉑是否通過抑制劑介導(dǎo)Wnt通路。  1  材料與方法  1. 1  材料  兔抗人catenin抗體和羊抗兔IgGFITC 購自博士德公司；OptiMEM培養(yǎng)基購于Invitrogen公司；Trizol核酸蛋白分離液購自Gibco公司； AMV酶、dNTP Mixture、Taq酶、Oligo(dT)18為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。 Hep3B細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞，p53缺失， 第二軍醫(yī)大學(xué)趙

11、健博士惠贈； U251細(xì)胞：人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，p53突變，上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫提供；HepG2細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞,含野生型p53,南方醫(yī)科大學(xué)免疫教研室惠贈；Lovo細(xì)胞：人大腸癌細(xì)胞，含野生型p53,南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室惠贈。  1.2  細(xì)胞培養(yǎng)  分別加入復(fù)蘇培養(yǎng)的HepG2、Hep3B、U251和Lovo細(xì)胞生長于10%（）胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)于37  、5%CO2培養(yǎng)箱中。  1.3  流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞對 catenin表達(dá)的影響 

12、0;經(jīng)順鉑作用24 h后以胰酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2遍后以20 g/L多聚甲醛固定30 min，離心去上清后懸于PBS+0.1%Triton100+10%山羊血清的染色液中30 min，離心去上清后加入兔抗人catenin抗體后室溫孵育60 min，洗滌2次后加入羊抗兔IgGFITC室溫孵育30 min后洗2遍，過400目尼龍網(wǎng)，上機(jī)檢測1萬個(gè)腫瘤細(xì)胞，以陽性細(xì)胞率（%）和平均熒光量表示。  1.4  反轉(zhuǎn)錄PCR  分別收集經(jīng)順鉑作用24 h的細(xì)胞，按Trizol 

13、Reagent使用說明進(jìn)行抽提總RNA。GAPDH引物序列：上游引物5CACAGTCCATGCCATCACTGC3，下游引物5GGTCTACATGGCAACTGTGAG3（609 bp）；FrpHE引物序列：上游引物5CCGTGC TGCGCTTCTTCTTCTGTG3,下游引物5GCGGGA CTTGAGTTCGAGGGATGG3(461 bp); DKK1引物序列：上游引物5AGGCGTGCAAATCTGTCTCG3,下游引物5TGCATTTGGATAGCTGGTTTAGT3(502 bp)（所有引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合

14、成）。  1.5  RTPCR過程  按產(chǎn)品說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42  ，60 min。PCR條件為： 94   2 min熱啟動, 94   1 min變性，58   1 min退火，72   1 min延伸，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。  1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用

15、t檢驗(yàn)和2檢驗(yàn)，以P0.05為差異有顯著性。  2  結(jié) 果  2.1  順鉑對腫瘤細(xì)胞FrpHE mRNA表達(dá)的影響  人肝癌細(xì)胞加入順鉑作用24 h后，F(xiàn)rpHE mRNA的表達(dá)較未加藥物的腫瘤細(xì)胞（對照組）明顯增加（P0.05）,在人大腸癌細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，未見FrpHE mRNA表達(dá)，見圖1。            2.2  順鉑對腫瘤細(xì)胞D

16、KK1 mRNA表達(dá)的影響  見圖2，在人肝癌細(xì)胞、人大腸癌細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞加入順鉑作用24 h后DKK1mRNA表達(dá)均較各自對照組水平明顯增加（P0.05）。  Lane 1: 人肝癌細(xì)胞(野生型p53,對照組), Lane 2: 人肝癌細(xì)胞(野生型p53,加順鉑), Lane 3: 人大腸癌細(xì)胞(對照組),Lane 4: 人大腸癌細(xì)胞(加順鉑), Lane 5: 人肝癌細(xì)胞(p53缺失，對照組), Lane

17、 6: 人肝癌細(xì)胞(p53缺失，加順鉑), Lane 7:人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(對照組), Lane 8: 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(加順鉑)  Lane 1: 人肝癌細(xì)胞(野生型p53,對照組), Lane 2: 人肝癌細(xì)胞(野生型p53, 加順鉑), Lane 3: 人大腸癌細(xì)胞(對照組),Lane 4: 人大腸癌細(xì)胞(加順鉑), Lane 5: 人肝癌細(xì)胞(p53缺失，對照組),&#

18、160;Lane 6: 人肝癌細(xì)胞(p53缺失，加順鉑), Lane 7:人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(對照組), Lane 8: 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(加順鉑)  以上結(jié)果顯示，加入化療藥后在不同的腫瘤細(xì)胞中對Wnt通路抑制劑FrpHE mRNA和DKK1mRNA表達(dá)具有上調(diào)作用，為了進(jìn)一步觀察FrpHE和DKK1上調(diào)后是否對Wnt通路產(chǎn)生抑制作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了Wnt通路的關(guān)鍵因子catenin表達(dá)水平的變化。  2.3  人肝癌細(xì)胞HepG2、人大腸癌細(xì)胞Lovo、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

19、U251、人肝癌細(xì)胞Hep3B中加入順鉑后catenin的表達(dá)  如圖3、4、5、6所示，加藥24 h后，在腫瘤細(xì)胞中catenin的陽性細(xì)胞百分比強(qiáng)度與對照組相比表達(dá)水平降低（經(jīng)2檢驗(yàn)，P0.05）。  3  討 論   Wnt通路是在胚胎發(fā)育、中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成中起關(guān)鍵作用的信號傳導(dǎo)通路，與腫瘤有著密切的關(guān)系，其通路的異常活化參與人類多種癌癥的發(fā)病過程，DKK和FrpHE是Wnt信號通路的抑制劑，因此，抑制或阻斷Wnt通路的異?；罨型蔀榭鼓[瘤治療的新靶點(diǎn)。  本研究結(jié)果顯示：抑制劑DKK1mRNA表

20、達(dá)水平在人的肝癌細(xì)胞、人大腸癌、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，24 h后與對照組相比表達(dá)水平明顯升高。FrpHE mRNA表達(dá)水平在人的肝癌細(xì)胞中，24 h后與對照組相比表達(dá)水平明顯升高。這說明順鉑能夠上調(diào)DKK和FrpHE，對FrpHE和DKK1有顯著的誘導(dǎo)作用。表明順鉑不僅直接抑制DNA復(fù)制，還可通過抑制Wnt通路產(chǎn)生抗腫瘤的作用，順鉑誘導(dǎo)FrpHE和DKK1，很可能是它們抗腫瘤作用的其中一種方式。因此，研究化療藥的抗癌作用新機(jī)制是一項(xiàng)非常有意義的工作，通過對新作用環(huán)節(jié)的研究，不僅可以弄清化療藥的作用，更好地運(yùn)用它們來治療惡性腫瘤，進(jìn)一步探尋抗腫瘤的新靶點(diǎn)，為研究抗腫瘤

21、新藥提供新靶點(diǎn)和新依據(jù)。  異常Wnt通路致癌關(guān)鍵是胞漿內(nèi)游離的變異catenin蛋白積聚進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)靶基因無限制轉(zhuǎn)錄，腫瘤細(xì)胞增殖7-9。本結(jié)果顯示，加入化療藥順鉑后，在不同的腫瘤細(xì)胞中，catenin的陽性細(xì)胞百分比強(qiáng)度和平均熒光量逐漸下降（見圖3-6），說明化療藥物對catenin起下調(diào)作用，能夠誘導(dǎo)Wnt通路抑制劑FrpHE、DKK1的表達(dá)。  實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，大腸癌細(xì)胞株Lovo及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251并沒有FrpHE的表達(dá)，說明它們可能是FrpHE缺失型的腫瘤細(xì)胞株。其他學(xué)者也報(bào)道了在乳腺癌、肺癌中有近半數(shù)存在FrpHE的缺失10，而且FrpHE的缺失常伴有ca

22、tenin的異常積聚。結(jié)合Wnt信號通路異常與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，提示FrpHE在腫瘤的發(fā)生過程可能是一個(gè)很關(guān)鍵的因素。 【參考文獻(xiàn)】  1 POLAKIS P. Wnt signaling and cancer J.Genes Dev,2000,14:1837-1851. 2 KAWANO Y,KYPTA R. Secreted antagonist of the Wnt signaling pathway J.Journal of Cell Science,2003,116(Pt13):2627-2634. 3 CHENG J H,SHE H,HAN Y P，et al. Wnt antagonism inhibits hepatic stellate cell activation