CFX_熒光定量PCR儀操作指引Bio-rad

1、CFX96實時熒光定量PCRZ操作流程及注意事項開始運行儀器打開電腦打開定量PCR儀底座開關(guān)啟動CFXManager軟件放置樣品將PCR應(yīng)體系加入到0.2ml低緣八聯(lián)管，蓋上管蓋；或加入低緣96孔板，用光學(xué)級封膜封好。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應(yīng)管表面。將反應(yīng)管按順序放入儀器的加熱孔中。設(shè)置程序，運行實驗定量PCR軟件操作基本步驟為：a.設(shè)置熱循環(huán)程序文件(ProtocolTab)b.設(shè)置反應(yīng)板文件(PlateTab)。C.點擊“StartRun”鍵，運行程序熱循環(huán)程序文件(ProtocolTab)設(shè)置指南：點擊Edit(編輯)或CreateNew(創(chuàng)建新程序)。反應(yīng)板設(shè)置

2、文件(PlateTab)設(shè)置指南：選擇本次實驗所要使用的熒光染料種類；單擊樣品類型；如要某些反應(yīng)孔第一熒光染料對應(yīng)的樣品類型為標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)，點擊"DilutionSeries"鍵可設(shè)置其標(biāo)準(zhǔn)品濃度及稀釋倍數(shù)。點擊"StartRun"鍵。單擊openlid(打開熱蓋)或Closelid(關(guān)閉熱蓋)放置樣品；單擊StartRun,保存文件，開始運行程序。結(jié)果分析PC皈應(yīng)結(jié)束后，軟件會自動計算標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值等。如需進行表達量分析、等位基因分析等，在軟件窗口選擇相應(yīng)分析功能。點擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結(jié)果報告單關(guān)閉運行儀器實驗結(jié)束后

3、取出反應(yīng)管，順序關(guān)閉CFXManager軟件、定量PC敬電源，關(guān)閉電腦。注意！CFX儀器上蓋部分為全自動控制，在通電狀態(tài)，嚴(yán)禁任何人為干涉上蓋開啟或關(guān)閉的行為，此類行為會導(dǎo)致上蓋故障，危及儀器使用。CFXManager軟件操作快速指南實驗操作程序設(shè)置圖1顯示實驗設(shè)置窗口中一個預(yù)覽的程序。點擊CreateNew,打開程序編輯器創(chuàng)建一個新的程序。點擊SelectExisting,通過瀏覽器加載一個程序或?qū)ζ溥M行編輯。使用ExpressLoad下拉菜單直接加載一個程序或?qū)ζ溥M行編輯。點擊EditSelected,打開程序編輯器編輯所選程序的各個步驟。點擊StartRun開始運行當(dāng)前加載的程序。程序編

4、輯器程序編輯器可用來創(chuàng)建一個新程序或編輯一個已存在的程序，圖21 .在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步（該步驟會用藍色高亮顯示），點擊溫度或保持時間進行直接編輯。2 .點擊InsertStep在程序中增加一個溫度步驟。點擊DeleteStep在程序中刪除選中的步驟。3 .點擊AddPlateReadtoStep,在程序中指定獲取熒光數(shù)據(jù)的時間。如果當(dāng)前的高亮顯示步驟已經(jīng)進行了讀板設(shè)置，則這一選項變?yōu)镽emovePlateRead。如果在這一步不想獲取數(shù)據(jù)，則點擊RemovePlateRead。4 .點擊GOTO步驟的重復(fù)次數(shù)，改變程序中的循環(huán)次數(shù)，圖2第4步。點擊GOTO驟數(shù)可改變GOT

5、O循環(huán)中所包含的步驟。增加一個梯度步驟：1 .在程序編輯控制窗口中，點擊InsertGradient，圖2。2 .對梯度中最低和最高溫度值進行編輯，在圖形模式，文本模式下或出現(xiàn)在文本模式右側(cè)的梯度范圍計算器中直接點擊數(shù)值進行編輯，圖3。3 .在梯度范圍計算器中，對任何一行都可以賦予一個指定的溫度。每行的溫度都會調(diào)整為合適的溫度來滿足指定的溫度范圍。增加熔解曲線：1 .在程序編輯控制窗口中，點擊InsertMeltCurve，圖2。2 .在圖形或文本顯示模式下，點擊溫度值來編輯融解曲線范圍的最低和最高溫度，圖4第5步1950CfattIO3C加胤也fof005+FlweRe«JENO3

6、 .點擊增量值來編輯數(shù)據(jù)獲取的溫度區(qū)間4 .點擊保持時間編輯每一個增量溫度的保持時間選中的孔是藍色的，未選中的孔是亮灰色的。若把光標(biāo)置于熒光信號曲線上，孔選擇器中的孔上，數(shù)據(jù)電CFXManager軟件數(shù)據(jù)分析快速指南定量分析數(shù)據(jù)瀏覽子表格的孔上，或者標(biāo)準(zhǔn)曲線上均可以顯示出相應(yīng)的信息擴增圖表可以顯示實驗中每個循環(huán)每個孔收集的相對熒光信號曲線。點擊位于擴增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要顯示的熒光數(shù)據(jù)，圖1。在孔選擇器中點擊孔，行或列來顯示所選孔的熒光數(shù)據(jù)，圖1數(shù)據(jù)分析選項CFXManager軟件可以自動的扣除從各個孔所得數(shù)據(jù)的基線。從菜單欄中選擇Settings,選擇BaselineThresho

7、ld可以改變基線范圍。軟件會自動計算基線的位置。可以點擊并拖動閥值線來手動定位。點擊工具欄中View/EditPlate按鈕來編輯孔的內(nèi)容，可以臨時創(chuàng)建新的分群，從分析中增加或刪掉一些孔。-圖表選項可用鼠標(biāo)右鍵點擊任何圖表來復(fù)制或保存圖像，或選擇ChartOptions來改變軸范圍或刪除柵格，圖2。點擊工具欄中TraceStyles按鈕，或鼠標(biāo)右鍵點擊任何圖表來設(shè)定制定孔的熒光信號曲線顏色。鼠標(biāo)左鍵點擊任何圖表，向下和拖動光標(biāo)可以放大圖表?？椎姆秩簲?shù)據(jù)瀏覽使用工具欄中SelectWellGroup下拉菜單來瀏覽指定孔的分群數(shù)據(jù)，圖3。軟件可以針對每個分群作為獨立的實驗來處理，每一個分群可針對自

8、己的設(shè)置進行分析，如進行自身標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析。AlWeis4.定量數(shù)據(jù)分析顯示選項點擊數(shù)據(jù)分析窗口中QuantitationData,瀏覽數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計，包括每個孔的閥值（CT）和平均值以及復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)偏差，圖4。點擊任一列的標(biāo)題進行基于列的行分類。鼠標(biāo)右鍵點擊電子表格并選擇Sort可進行基于多個列的行分類。鼠標(biāo)左鍵點擊任一列的標(biāo)題并向左或向右拖動可以重新排列電子表格中列的順序。鼠標(biāo)右鍵點擊電子表格，選擇數(shù)據(jù)輸出格式如text,XM或Excel輸出數(shù)據(jù)，圖4。從QuantitationData下拉菜單中選擇Plate,在反應(yīng)板柵格模式下顯示所選熒光的孔數(shù)據(jù)。創(chuàng)建報告顯示選項點擊數(shù)據(jù)分析窗口工具欄中

9、Report按鈕，圖1,打開Report窗口，圖5。點擊報告選項列表中的檢查窗，使制定信息包含在報告中，這些信息在預(yù)覽部分中會有所顯示，圖5。點擊工具欄中File并選擇Save,以PDF格式保存報告,或選擇Print打印報告。也可以保存報告為其它的文件格式。nsCFXManager軟件基因表達分析快速指南通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制，您可以使用GeneExpressionModuleofCFXManager軟件來評估樣品之間靶標(biāo)濃度的相對差異。這種應(yīng)用最常用的使用是評估cDNA樣品中靶標(biāo)的濃度來推斷其mRNA水平。通常，一個或多個參照基因的含量被用來衡量目標(biāo)基因的水平。參照基因用來校正上樣的差異或各樣品

10、取樣的差異。通過生物學(xué)條件的研究，參照基因的表達水平通常不發(fā)生變化?；虮磉_分析設(shè)置圖1顯示各樣品孔含單一的熒光，四個復(fù)制類群，包含兩個不同靶標(biāo)名稱和兩個不同的樣品名稱。指定參照基因圖11 .點擊反應(yīng)板編輯器中ExperimentSettings或GeneExpressionModule,打開實驗設(shè)置窗口,EpartwM2 .選擇Targets。3 .點擊合適的檢查窗選擇將被使用為參照基因的靶標(biāo)。4 .點擊ShowAnalysisSettings檢查窗，為靶標(biāo)設(shè)置反應(yīng)擴增效率。5 .AutoEfficiency檢查窗被默認(rèn)設(shè)定。如果實驗中運行一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算得到的擴增效率將在計算

11、中被使用。或者對合適的靶標(biāo)輸入指定反應(yīng)擴增效率值，則計算中將使用這一擴增效率值。指定對照樣本1 .在ExperimentSettings窗口，選擇Samples標(biāo)簽2 .點擊合適的檢查窗，選擇在計算中將被作為對照的樣本，圖3。對每個基因來說，對照樣本的值被指定為1,同時所有其他樣本相對于對照樣本的值會被顯示出來基因表達分析選擇分析模式4:1.從Mode下拉菜單中選擇分析模式，圖a.NormalizedExpressionAAC(t)-靶標(biāo)基因的相對量可通過樣本的參照基因來進行相對量的衡量。b.相對量/C(t)-靶標(biāo)基因的相對量不能被衡量；結(jié)果顯示的是實驗中靶標(biāo)基因相對于其他樣品的基因濃度。圖形選項1 GraphData下拉菜單中選擇對照相關(guān)或零相關(guān)的圖形數(shù)據(jù)。在表中，GraphData選項默認(rèn)是對照相關(guān)。2 X軸下拉菜單中選擇X軸以Sample顯示或Target顯示。3 丫軸下拉菜單中選擇Linear,Log2或LoglO作為丫軸刻度。4 ScalingOption下拉菜單中選擇Highest,Lowest或Unscaled。5 ErrorType下拉菜單中選擇StandardErroroftheMean或StandardDeviation。6鼠標(biāo)右鍵點擊圖形菜單選擇Sort選項來指定X軸的顯示順序。7鼠標(biāo)右鍵