n-3多不飽和脂肪酸對腸道菌作用線蟲模型的建立與應(yīng)用

1、n-3多不飽和脂肪酸對腸道菌作用線蟲模型的建立與應(yīng)用腸道菌群是人體重要組成部分。有研究表明,腸道微生物的異常變化與多種疾病的發(fā)生相關(guān),而飲食對腸道微生物具有調(diào)節(jié)作用。這提示,一些食品功能因子可以通過影響腸道微生物,間接地影響人體健康。因此,食品因子對腸道微生物的影響有重要的研究價值。與人和小鼠等宿主相類似,線蟲腸道也能夠為微生物提供定居場所,并且實驗室培養(yǎng)條件下線蟲容易實現(xiàn)單菌或多個已知菌的喂食,便于排除無關(guān)菌的干擾腸道微生物極具復(fù)雜性,且有許多腸道菌尚不能在體外培養(yǎng),因此借鑒糞便移植的概念,本文提出將哺乳動物的腸道菌群引入線蟲體內(nèi)探究功能性食品因子對腸道菌群作用的研究方法,既能保持菌群的復(fù)雜

2、性,又克服以哺乳動物為實驗?zāi)Ｐ蛶淼纳芷陂L,難以觀察且腸道環(huán)境復(fù)雜,結(jié)果難以分析的缺陷,然而相關(guān)研究仍是空白。本課題旨在建立線蟲-腸道菌群體系,利用該體系快速有效地反映食品功能因子對腸道菌群的影響,并在食品功能因子、腸道菌群、宿主健康三者之間建立聯(lián)系,為腸道微生物的研究拓展新的思路奠定一定基礎(chǔ)。本研究主要利用了二代測序技術(shù),對線蟲自由攝食新鮮小鼠糞便菌群后形成的腸道菌群進(jìn)行分析,比較線蟲腸道菌群和糞便菌群在多樣性、菌群組成及分布比例上的相似性和差異性,確定線蟲進(jìn)行菌群移植的可行性。之后,選取n-3PUFAs和n-6PUFAs兩種食品功能因子,利用線蟲模型探究其對腸道菌群的影響。在此基礎(chǔ)上，

3、進(jìn)一步測定高n-3PUFAs或高n-6PUFAs飲食飼喂的小鼠,其相應(yīng)糞便菌群對線蟲壽命的影響。本論文主要結(jié)論如下:(1)外源微生物可以在線蟲腸道內(nèi)存活利用表達(dá)綠色熒光蛋白的大腸桿菌BL21-ZsGreen研究線蟲攝食菌體的時相及菌體在線蟲體內(nèi)的維持時間。結(jié)果表明,喂食細(xì)菌1h后大多數(shù)線蟲腸道內(nèi)即布滿菌體,在停止喂食2h后仍有菌體維持在線蟲體內(nèi),并主要分布在線蟲尾部。為線蟲通過自由攝食引入小鼠糞便菌群提供了依據(jù)。同時,探討了不同洗滌條件對線蟲體表微生物和腸道內(nèi)微生物的分離,確定了最佳洗滌條件,為下一步分析線蟲體內(nèi)微生物群排除了體表菌體的干擾。(2) 線蟲通過自由攝食新鮮小鼠糞便菌群形成線蟲-腸

4、道菌群系統(tǒng)在PCR擴(kuò)增菌屬的特異性片段驗證特定菌屬能夠引入線蟲體內(nèi)的基礎(chǔ)上,利用二代測序技術(shù)對實驗室培養(yǎng)條件下的線蟲腸道菌群、收集所得小鼠糞便菌群以及喂食小鼠糞便菌群24h后線蟲腸道菌群的組成進(jìn)行分析。實驗室培養(yǎng)條件下,線蟲腸道菌群絕大部分由變形菌門占據(jù)。與初始小鼠糞便菌群相比,自由攝食小鼠糞便菌群后形成的線蟲腸道菌群有相近的門水平的組成及比例分布;在屬水平上,優(yōu)勢菌群種類基本相同,而在比例分布上有一些差異。對線蟲腸道菌群及培養(yǎng)基中添加的菌群隨時間的變化規(guī)律進(jìn)行了分析,線蟲能夠形成與培養(yǎng)環(huán)境不同的菌群,說明菌群在線蟲腸道內(nèi)有富集改變的過程。隨著時間推移,門水平上的變化主要體現(xiàn)在擬桿菌門比例下降

5、,變形菌門比例上升。屬水平分析顯示,厚壁菌門的優(yōu)勢菌屬組成比較穩(wěn)定,變形菌門的菌屬種類增加較多。(3) n-3PUFAs和n-6PUFAs對線蟲腸道菌群豐富度及組成產(chǎn)生不同的影響根據(jù)上述菌群喂食結(jié)果,進(jìn)行食品功能因子對菌群影響的研究,喂食線蟲新收集的小鼠糞便菌群的同時分別添加n-3PUFAs和n-6PUFAs,24h后收集線蟲樣品,對線蟲腸道菌群進(jìn)行宏基因組測序分析。與對照組相比,n-3PUFAs喂食組菌群豐度提高,n-6PUFAs喂食組菌群豐度沒有差異。在菌群組成與分布方面，擬桿菌門比例和厚壁菌門比例在n-3和n-6PUFAs添加組中均有增加的趨勢。與對照組相比,n-3PUFAs明顯下調(diào)了變形菌門的比例。N-6PUFAs調(diào)節(jié)菌群中乳桿菌屬的比例明顯上調(diào)。（4）高n-3PUFAs飲食小鼠的糞便菌喂食延長了線蟲壽命以線蟲壽命為指征,測定受到不同飲食調(diào)節(jié)的菌群對線蟲健康的影響。高n-3PUFAs飲食調(diào)節(jié)的小鼠糞便菌群喂食的線蟲比高n-6PUFAs飲食調(diào)節(jié)的菌群喂食的線蟲壽命長,體現(xiàn)了受到不同飲食調(diào)節(jié)的菌群對宿主健康帶來的影響。本研究首次探究了將哺乳動物腸道菌群引入線蟲體內(nèi),用于研究食物組分中的功能因子對腸道菌群的作用的可行性,發(fā)現(xiàn)線蟲腸道內(nèi)可以引入大多數(shù)優(yōu)勢菌群,動態(tài)上維持菌群的多樣性,并對多不飽和脂肪酸的添加產(chǎn)生響應(yīng)。N-3PUFAs與n-6PUFAs對腸道菌具有不同