細(xì)胞分離常用方法

1、WOR格式專業(yè)資料整理1000r/min的TD4A低氐速PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液，因?yàn)?，?jīng)或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間細(xì)胞分離常用方法 一、懸浮細(xì)胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡(jiǎn)單的方法是采用 離心機(jī)離心10分鐘，若懸液量大，可適當(dāng)延心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損 傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂 中某些細(xì)這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。不同比重的

2、分層液的配制和具體分離方法詳見淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié)。二、實(shí)體組織材料的細(xì)胞分離方法對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分 散法（物理裂解）和消化分離法。（一）機(jī)械分散法所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉?分剪碎分散的組織放在注射器內(nèi) （用九號(hào)針），使細(xì)胞通過針頭壓出， ）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅處理纖維成分少的軟組織。（二）消化分離法組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊 的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，

3、此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生 一長(zhǎng)。1、酶消化分離法酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下:（1）胰蛋白酶分散技術(shù)胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于 賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開，在常用的蛋白 酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活 力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等。細(xì)胞類

4、型胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組的軟組織織、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富 的組織能增加其對(duì)組織的分離作用。一、，酶的活力市售的胰蛋，其活力都經(jīng)過測(cè)定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低 白酶溫冰箱中，消化時(shí)的和溫度都要適宜，否則會(huì)影響活力，細(xì)胞的分散直接與 酶的活力有關(guān)，時(shí)活力最強(qiáng)。最終使用活pH1:200 或 1:250 ,56 C PH8.0,如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效， 但若與膠原酶合用該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內(nèi)溫度不宜過高，保存時(shí)間不能太長(zhǎng)， 若粉劑結(jié)團(tuán)塊 酶的濃度胰蛋白酶一般采用的濃度為可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng) 因子

5、所清除。 溫度一般認(rèn)為胰蛋白 酶在,說明該部分受潮或 失效。 活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時(shí)，濃 0.1%-0.25%(度可適當(dāng)提高，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中 可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，若培養(yǎng) 液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶56 C時(shí)活性最強(qiáng)，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用，常使 用的溫度為376常在37 C進(jìn)行消化比室溫作用快。 pHpH8P H9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性 強(qiáng)分散快，細(xì)胞也容易被消化下來，消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.68.0之間，否則對(duì)細(xì)胞有損傷?？梢园l(fā)生抑制胰蛋白

6、的消化作 無機(jī)鹽離子若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制 胰蛋白酶時(shí)，采用無鈣鎂離子的 PBS配制。 消化時(shí)間如果細(xì)胞消化時(shí)間過長(zhǎng)，可以損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞 的代謝，一般消化時(shí)間為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于 4C過 夜也可。用。因此，在配制時(shí)20分鐘為分離方法如下： 過夜冷消化將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為 和脂肪組織，再加入 0.25%的胰蛋白酶，搖4C過夜，次日再用 Hanks液洗滌，棄去上清，共洗23次，然后，加入少量營養(yǎng)液吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。 多次提取消化法多次提取消化法有以下三種：4毫米左右，用液洗23次以除去Hanks血球勻后放熱消

7、化多次提取將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37C水浴中消化1520分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液，按合適的濃度分瓶培養(yǎng)，然后將留下的未徹底消化的組織 按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞。冷消化多次提取方法同上，只是消化溫度為4C。先熱消消化冷消化將組織塊先用胰蛋白酶于37C下消化 20分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散，制成懸液，的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于 4 C下過夜，次日再提取細(xì)胞，分散成懸液，分瓶培養(yǎng)。（2） 膠原酶（Collagenase）消化法膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌 組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身

8、影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離 效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度200u/mL或0.10.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞 團(tuán)塊尚未被完全消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因 此不必要再進(jìn)一步消化處理。（小時(shí)）有（見表 差異（對(duì)細(xì)胞表面糖基 有作用鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生（見4-1）和在不同濃度下消化各種組織小物學(xué)活性表塊所需的時(shí)間4-2），以及兩

9、者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí) 還可加透明質(zhì)酸酶采用兩者的聯(lián)合消化作用，對(duì)分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。表4-1胰蛋白酶和膠原酶生物活 性的差別項(xiàng)目胰蛋白酶膠原酶 消化特性適用于消化軟組織適用于消化纖維多的組織用量 0.01%0.5%0.112小時(shí)0.3mg/mL（200u/mL）消化時(shí)間0.52小時(shí)（小塊）1pH896.5 7.0作用強(qiáng)度強(qiáng)烈緩和 細(xì)胞影響時(shí)間過長(zhǎng)有影響無大影響 血清、鈣、鎂離子有影響無影響(小時(shí))(0.5 1cm3)表4-2胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間 酶種類較硬組織軟組織種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。4C室溫

10、37C 4C室溫37C胰蛋白酶（0.25%）244816121224120.51 膠原酶（200u/mL）2466.51230.25兩者聯(lián)合（對(duì)沖）12461224412122461212還有除上述兩種最常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來，2、非酶消化法（EDTA消化法）Versene，全名為乙 PBS配成EDTA是 一種非酶消化物，又稱螯合劑或 烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的 成螯合的工作液'對(duì)一些組織，尤其是上超織分散效果好'該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形（1:1或2:1），不僅利于細(xì)胞脫壁物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì) 胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用，但可與胰蛋白酶混合使用 又利于細(xì) 胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。消化分離法的操作步驟： 剪切把組織塊剪碎，呈 15mm3大小的組織塊。（加液漂洗將碎組織塊（自然沉降燒瓶）中用無鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜,2）在平皿（X若組織塊3消化加入消化液（胰蛋白酶或膠 EDTA于 37C水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕）原酶或搖12呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨