DNA的酶切連接轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定

1、第二次分子生物學(xué)實驗報告dnA勺酶切、連接、轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定一 實驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的分類特性與作用原理，掌握載體和外源目的DNA1切的操作技術(shù)。2、學(xué)習(xí)利用T4 DNA連接酶把酶切后的載體片段和外源目的 DNA片段連接起來，構(gòu)建體外重組 DNA分子的技術(shù)，了解 并掌握幾種常用的連接方法。3 掌握利用CaCl2 制備感受態(tài)細胞的方法；學(xué)習(xí)和掌握熱擊法轉(zhuǎn)化 E. coli 的原理與方法。4、學(xué)習(xí)并掌握使用紅白菌落法篩選獲得重組子以及a互補篩選法的原理及方法。5 學(xué)習(xí)和掌握使用試劑盒抽提質(zhì)粒的方法；6 復(fù)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法；7、通過對重組子進行重組質(zhì)粒 DNA的抽提

2、與酶切鑒定，進一 步確定重組質(zhì)粒中含有外源目的DNA片段，并驗證重組子是期望的重組子。實驗原理1、限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核甘酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶，主要是從原核 生物中分離純化出來的。在限制性核酸內(nèi)切限制酶的作用下，侵入細菌的“外源” DNA分子便會被切割成不同大小的片段，而細 菌自己固有的DNA由于修飾酶（通常是一種甲基化酶）的保護作 用，則可免受限制酶的降解。目前已經(jīng)鑒定出3種不同類型的限制性核酸內(nèi)切酶，即I型 酶、 II 型酶和 III 型酶。I型酶切割位點是隨機的，至少距識別位點 1000bp。田型限 制酶的切割位點距識別序

3、列 3'端為2426bp。II型限制酶的切 割位點一般在識別序列上或與之靠近，而且具有序列特異性，故在基因克隆中有特別廣泛的用途。II型核酸內(nèi)切限制酶具有 3個基本的特性：在 DNA分子雙 鏈的特異性識別序列部位切割 DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂；2個 單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相對的； 斷裂結(jié)果形成的DNA片段往往具有互補的單鏈延伸末端。限制性核酸內(nèi)切酶對DNA底物的酶切作用是否完全，直接關(guān)系到連接反應(yīng)、重組體分子的篩選和鑒定等實驗結(jié)果。核酸內(nèi)切限制酶活性的充分發(fā)揮受到以下幾個因素的影響：1)DNA羊品的純度，可采取措施有純化 DNA加大酶的用量、延長酶催化反應(yīng)的保

4、溫時間，擴大反應(yīng)體積；2) DNA的甲基化程度，基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株；3)酶切消化反應(yīng)的溫度；4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；5)限制性核酸內(nèi)切酶的緩沖液。限制核酸內(nèi)切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在DNA1組技術(shù)中限制性核酸內(nèi)切酶主要用在一下幾方面：構(gòu)建重組質(zhì)粒；構(gòu)建基因文庫；DNA分子的雜交；制備DNA放射性探針；繪制DNA分子的限制酶圖譜DNA序列分析；基因定位及 DNA同源性研究。2、限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)體外構(gòu)建重組DNA分子，首先要了解目的基因的酶切圖譜，選用的限制性核酸內(nèi)切酶都不能在目的基因內(nèi)部有專一的識別位點，即當(dāng)用一種或者兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割外源供體DNA時，

5、能夠得到完整的目的基因。其次，選擇具有相應(yīng)的單一酶切位點的質(zhì)粒、噬菌體等載體分子作為克隆的載體。常用的酶切方法有雙酶切法和單酶切法兩種。(1)雙酶切法：如果只在要克隆的目的 DNA二端具有不同的限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點，而目的基因內(nèi)部沒有相應(yīng)的識別序列，可用這二種限制性核酸內(nèi)切酶酶切，則目的DNAM產(chǎn)生二種不同的黏性末端。選擇同樣具有這二種限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的合適載體，酶切后，同樣產(chǎn)生二個不同的黏性末端，當(dāng)構(gòu)建重組分子時，目的 DNA可以一定的方向插入載體中，這樣操作效率高，也利于重組子的篩選。(2)單酶切法：如果目的DNA片段只能用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割，酶切后的片段兩端產(chǎn)生相同的

6、粘性末端或者平末端。選擇具有同樣限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的合適載體，在構(gòu)建重組分子時，除了形成正常的重組子之外，還可能會出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中，或者目的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象，因此重組效率較低。如果沒有很好的方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子中的重組子，篩選重組子會比用雙酶切法構(gòu)建重組 DNA分子的工作量大很多。單酶切法和雙酶切法各有優(yōu)缺點，在實際操作時要根據(jù)具體情況來定。3、DNAiI接酶DNA連接酶能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3羥基末端 與 5' 磷酸基團末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于連接DNA片段的DNA連接酶有E.

7、 coli DNA 連接酶和T4 DNA連接酶。E. coli DNA 連接酶只能催化雙鏈 DNA片段互補 黏性末端之間的連接，不能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接。T4DNA連接酶既可用于雙鏈 DNA片段互補黏性末端之間的 連接，也能催化雙鏈 DNA片段平末端之間的連接，但平末端之 間連接的效率比較低。DNA連接酶同限制性核酸內(nèi)切酶一樣，都是在體外構(gòu)建重組 DNA分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶可以將 DNA分子切割成不同大小的片段，然而要將不同來源的DNA片段組成新的雜交DNA分子，還必須將它們彼此連接起來。目前 有3種體外連接DNA片段的方法：用DNA連接酶連接具有互 補黏

8、性末端的DNA片段；用T4 DNA連接酶直接將平末端的 DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的 DNA片poly(dA)-poly(dT) 尾之后，再用 DNA連接酶連接起來； 先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成 黏性末端，再用DNA連接酶連接起來。這3種方法雖然互有差 異，但共同的一點都是利用 DNA連接酶所具有的連接和封閉單 鏈DNA的功能。4、載體與外源DNA勺連接反應(yīng)外源DNA片段與載體分子的連接，即DNA分子體外重組，主 要依賴于DNA連接酶來完成。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段 相鄰的5 - 磷酸和3 - 羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中

9、最有用的DNA連接酶是來自T4噬菌體的DNA連接酶：T4 DNA連 接酶，該酶需要ATP作為輔助因子。目的DNA片段與載體DNA片 段之間的連接方式主要有以下幾種：（ 1）互補粘性末端片段之間的連接當(dāng)載體和外源DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割時，產(chǎn)生相同的粘性末端，連接后仍保留原限制性內(nèi)切酶的識別序列；如果用兩種能夠產(chǎn)生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割時，雖然可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來用于切割的那兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，這樣不利于從重組子上完整地將插入片段重新切割下來。定向克?。焊鶕?jù)核酸內(nèi)切限制酶的性質(zhì)，用兩種不同的限制酶同時消化一種特定的DNA分子，將會

10、產(chǎn)生出具有兩種不同粘性末端的DNA片段。十分明顯，如果載體分子和待克隆的 DNA分子都是用同一對核酸內(nèi)切酶切割，然后混合起來，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組 DNA分子?；パa粘性末端連接方案中還有一個問題：片段的多拷貝插入。當(dāng)需要表達蛋白質(zhì)產(chǎn)物時，多拷貝的插入，在沒有拼連剪切信號的情況下，將會導(dǎo)致表達困難或紊亂。所以需要用內(nèi)切酶圖譜對單拷貝插入片段進行鑒定和篩選。適當(dāng)?shù)牟迦肫闻c載體分子比率能減少多拷貝插入片段的形成，一般比例為2:1 （插入片段摩爾數(shù) : 載體摩爾數(shù)）。（ 2） 平末端及非互補黏性末端片段之間的連接載體分子和外源DNA插入片段并不一定總能產(chǎn)生出互補的粘性

11、末端。實際上有許多情況都是例外的，因為有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段； 有的實驗要用兩種不 同的限制酶分別切割載體分子和外源 DNA形成的也多半是非互 補的粘性末端或平末端；再如用機械切割法制備的 DNA片段， PCR擴增的和化學(xué)合成的 DNA片段或由RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成 的cDNA片段，也不會具有互補的粘性末端。既然在一定反應(yīng)條件下，用T4 DNA 連接酶可以將平末端的DNA片段有效地連接起來，那么對于上面提到的非互補粘性末端 的兩種DNA片段之間，經(jīng)過專門作用于單鏈 DNA的S1核酸酶 處理變成平末端或用大腸桿菌 DNA聚合酶I的Klenow片段填 補后變成平末端，

12、一樣也可以使用 T4 DNA連接酶進行有效地連 接。不過，平末端 DNA片段間的連接作用不僅在效率上明顯地低于粘性末端間的連接作用，而且重組之后一般不能從原位刪除下來。影響DNAS接的因素有溫度、時間、酶量、緩沖體系、DNA末端的性質(zhì)及濃度、DNAJ斷的大小等。溫度，理論上最佳溫度是37，此時酶的活性最高，但37時粘性末端分子形成的氫鍵配對極不穩(wěn)定，因此我們選擇在1216進行連接。時間，在最適溫度下，一般粘性末端連接30min 即可取得較好的效果，連接60min 則更完全些，為了實驗方便有時也在4下連接過夜。而對于平末端建議在4下連接，并且時間適當(dāng)延長。更為普遍的條件是：16 連接過夜酶單位(

13、Takara)在20ml的連接反應(yīng)體系中，6mg的 入 DNAHind田的分解產(chǎn)物在16c下fanying30 分鐘時，有90% 上的DNA>t段進行連接的酶量為1U。酶量，連接實驗中 DNA勺 濃度比酶量定義狀態(tài)下低很多倍，所以酶是過量的。Takara 的T4-DNA連接酶濃度是 350U/ml。緩沖體系(buffer )， Tris-HCl 提供連接所需的合適的ph值，DTT提供還原力，ATP促進連接反應(yīng)的有效進行。DNA<度，連接反應(yīng)中 DNA勺濃度一般為0.11pmol/ml。具 中載體濃度過高會增加載體間分子的環(huán)化，而過低則獲得重組分子的效率低，甚至導(dǎo)致載體分子的自身環(huán)化

14、， 外源DNAW依據(jù)連接類型的不同加入載體濃度的110 倍。5、感受態(tài)細胞的制備與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細胞才能大量地進行復(fù)制、增殖和表達，將外源重組體分子導(dǎo)入受體細胞的途徑，包括轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉(zhuǎn)化( transformation ) 。 細菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的過程。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進行轉(zhuǎn)化，

15、其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難，尤其是那些與其親緣關(guān)系較遠的DNA分子更是如此。通常的做法是采用人工的方法制備感受態(tài)細胞，然后進行轉(zhuǎn)化處理，其中代表方法之一是CaCl2誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。感受態(tài)是指宿主細胞最容易接受外源DNAt段并實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，由受體菌的遺傳性狀決定，同時也受菌齡和環(huán)境因子的影響。感受態(tài)的細胞一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期。重組DNA轉(zhuǎn)化細菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過化學(xué)方法，人工 誘導(dǎo)細菌細胞進入一個敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進入細菌內(nèi)。 CaCl2 誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化的原理是將處于對數(shù)生長期的細 菌置于0，CaCl2 低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形，同時鈣離子使細胞膜

16、磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)。此時加入DNA鈣離子又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸 酶（Dnase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細菌細胞膜的外表 面上。經(jīng)短暫的42熱脈沖處理后，細菌細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機進入細胞內(nèi)。影響感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化的因素有細胞的狀態(tài)、DNA勺質(zhì)量和濃度、試劑的純度等。（ 1）細胞的生長狀態(tài)和密度：從甘油管中新鮮活化而不是多次轉(zhuǎn)接的菌；培養(yǎng)至指數(shù)前期到指數(shù)期；應(yīng)為限制- 修飾系統(tǒng)缺陷菌株；感受細胞和所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)應(yīng)匹配。（2）質(zhì)粒DN

17、A勺質(zhì)量和濃度：超螺旋構(gòu)想的質(zhì)粒 DNA較其 線性構(gòu)想的轉(zhuǎn)化率高10100倍；加入DNA勺體積不應(yīng)超過感受 態(tài)細胞的5% 1ng的cccDNA即可使50皿 的感受態(tài)細胞達到飽 和；對于同一類型的載體而言，分子量越大轉(zhuǎn)化率越低。（ 3）其他藥品、試劑質(zhì)量：氯化鈣應(yīng)用高純度藥品、超純水 配制，過濾除菌、分裝保存；所有試劑、容器、耗材等均需無菌 處理；感受態(tài)細胞制備過程均需無菌、冰浴操作。5、 a互補利用B-半乳糖甘酶篩選系統(tǒng)，跟據(jù)菌落顏色篩選含有重組質(zhì) 粒的轉(zhuǎn)化子。載體上插入了 B-半乳糖音酶的調(diào)控序列和 B-半乳 糖甘酶N端146個氨基酸的編碼序列，而其對應(yīng)的宿主菌染色體 上整合有B-半乳糖音酶

18、C端序列的遺傳信息。當(dāng)質(zhì)粒載體導(dǎo)入 相應(yīng)宿主菌后，通過a互補作用，形成完整的B-半乳糖甘酶。 在加有氨芾青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板上，不含質(zhì)粒PUC19的E. coli DH5 民無法生長；含有質(zhì)粒 pUC19的E. coli DH5 民利 用B -半乳糖甘酶分解培養(yǎng)基中的乳糖產(chǎn)生有機酸，pH降低，培養(yǎng)基中的指示劑變紅，菌落變?yōu)榧t色；含有重組質(zhì)粒的E. coliDH5a具有氨芾青霉素抗性可以生長，但質(zhì)粒pUC19中有外源基因插入到多克隆位點，使 B-半乳糖甘酶N端的基因不能表達， 無法實現(xiàn)a互補作用，所以其菌落為白色。利用這種篩選方法 可方便地將含目的基因的重組子篩選出來。6、 重組質(zhì)粒的鑒定重

19、組質(zhì)粒是外源基因通過單酶切（或雙酶切）與用相同的（或二種）限制性核酸內(nèi)切酶切割的質(zhì)粒載體理解后獲得的，因此在連接處仍保留原限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，用該酶 （或二種酶）再次切割重組質(zhì)粒，能把插入片段切離載體，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見有載體片段和插入的外源DN明段，并可知插入片段的大小。7、麥康凱培養(yǎng)基蛋白胨、胨提供碳氮源、維生素和生長因子；牛膽鹽和結(jié)晶紫可抑制革蘭氏陽性菌的生長；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑；乳糖為可發(fā)酵的糖類；中性紅是pH 指示劑，細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸時菌落呈粉紅色并在菌落周圍出現(xiàn)膽鹽沉淀 的渾濁圈。三、主要儀器和實驗試劑1、儀器與材料LB培養(yǎng)基，NaOH&#

20、167;液，氨芾青霉素母液（20mg/mD ,無水 乙醇，超純水，限制性核酸內(nèi)切酶 Hindm及其相應(yīng)的Buffer , T4-DNA連接酶及其 Buffer ,麥康凱培養(yǎng)基，100mmol/L CaCl2 溶液，Omeg頡粒抽提試劑盒，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液（50X）, 上樣緩沖液（10X）,澳化乙錠（EB）。2、實驗試劑恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，漩渦振蕩器，恒溫水浴 鍋，Eppendorf管，微量移液器，培養(yǎng)皿，三角瓶，酒精燈，量 筒，牛皮紙，接種環(huán)，涂布器，電子天平，微波爐，電泳儀，制 膠槽，電泳槽，凝膠成像檢測儀，瓊脂糖凝膠梳子，手套。3、實驗材料E.coli DH5 民（pU

21、C19 ； pUC19質(zhì)粒；入 DNA四、實驗步驟1、酶切在無菌Ep管中按ddH2。buffe、DNA限制性內(nèi)切酶的順序 依次加入酶切反應(yīng)的各種成分（各組分的量見Figure 1 ）,混勻，4000rpm離心1min,將液體集中于管底。37J 12小時,在-20 C冰箱保存。酶切產(chǎn)物電泳檢測酶切效率，各小組向EP觀眾加8 6上周得到的酶切反應(yīng)液，弁加 2 l Loading buffer 。體系組成自己提取的n商品入田商品序號pUC19DNApUC191ddH2O (ul )13.070.064.0210*Buffer(ul)2.010.08.03DNA(ul )4.015.04.04Hind

22、 in(5M/ul)1.05.04.0總計(ul)20.0100.080.0Figure 1 pUC19 質(zhì)粒及入DNA酶切反應(yīng)體系2、連接(1)在無菌Ep管中依次加入連接反應(yīng)的各種成分 (見Figure2),混勻；(2) 4000tpm離線1min,集液于管底；(3)在16 c的恒溫水浴鍋中反應(yīng)過夜。組ddH2 10*Liga pUC19DNA/Hi 入T4-DNA連 合Bufferdm (30U/ul)含 3.21.02.03.00.810.量0(ulFigure 2 連接反應(yīng)體系3、感受態(tài)細胞的制備(1)倒LB平板，劃線活化 E. coli DH5a。(2)從LB平板上挑取E. coli

23、 DH5 a單菌落至5mL LB液體培 養(yǎng)基里，37 c振蕩培養(yǎng)過夜。(3)以1%勺接種量將過夜培養(yǎng)的 E. coli DH5民接種于20mL 新鮮LB液體培養(yǎng)基，220rpm培養(yǎng)2-2.5h 。(4)將菌液之于冰浴中。(5)分別取1.5mL菌液于2個無菌的1.5mL Ep管中，4000rpm 離心5min,棄上清液，收集菌體。(6)每支離心管中加入用冰預(yù)冷的 800 H l 0.1mol/LCaCl 2,輕 輕懸浮細胞，冰上放置 10min, 4000rpm離心5min。(7)棄上清液，加入100 LCaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰 上放置20min,即為感受態(tài)細胞，分裝至 50H l/管。

24、4、轉(zhuǎn)化步 1234567驟感受 DNA 冰浴熱擊冰復(fù)蘇培養(yǎng)基涂平板態(tài)細100連接 10mi 90s 5m LB:含amp麥康凱培II - 50昭八、m- 505.0in 0.9ml/養(yǎng)基，50 1*2、管,0.5-1hpUC19 10mi 90s 5m LB:1.0 nin 0.9ml/管,0.5-1h10mi 90s 5m LB:in 0.9ml/管,0.5-1h100 1*2、1501*2、200U1*1*2含amp麥康凱培養(yǎng)基，50 1*1含amp麥康凱培養(yǎng)基，50 1*1 ;麥康凱培養(yǎng)基,50 1*1昭八、Figure 3 重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化對照表平板至置于操作臺上10分鐘后，導(dǎo)致于37

25、c溫箱中培養(yǎng)1620h。5、轉(zhuǎn)化子和重組質(zhì)粒的篩選(1)轉(zhuǎn)化后的細胞在含有氨芾青霉素的LB培養(yǎng)基上為白色菌落，選取六個白色菌落在另一 LB培養(yǎng)基上劃線，過夜培養(yǎng)。(2)六個菌落中選取三個轉(zhuǎn)接到3mL含氨芾青霉素的LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。6、重組質(zhì)粒的驗證( 1)取菌液3.0mL 用試劑盒提取質(zhì)粒。A.將帶有重組質(zhì)粒的菌體接種 5ml于含amp白LB培養(yǎng)基上， 37搖床過夜；B.取15ml菌液，室溫下10000rpm離心1min收集菌體；C.棄培養(yǎng)基，加入 250mi l solutionI/RNaseA混合液，渦旋震蕩使細胞完全懸浮；D.往混合液中加入250“solution n,輕輕

26、顛倒混勻，裂解時間不要超過5min；E.加入350 “solution m，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；F.室溫，10000rpm 離心 10min；G. 轉(zhuǎn)移上清液到套有2ml 收集管的HiBind DNA 結(jié)合柱中，室溫下，10000rpm離心1min,倒去濾液；H.柱子重新裝回收集管，加 500皿HBBuffer ,按上述條件 離心，棄去濾液；（ 1） 新裝回收集管，力口 700 WDNA Wash Buffer ,按上 述條件離心，棄去濾液；J.柱子重新裝回收集管，10000rpm離心空柱2min；K.把柱子裝在干凈的 Ep管上，加入50"Elution Buffer到柱

27、子基質(zhì)中，10000rpm 離心 1min 洗脫出DNA。（ 2） 對有外源基因插入的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割，進行進一步鑒定。（ 3） 37保溫0.5 1h。（4）利用空載體pUC19片段和目的基因片段為對照，對沒切后的重組質(zhì)粒的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，從酶切后片段的數(shù)目及大小上進行確認。處理：2 11 l ddH2O , 2 l 質(zhì)粒，1 l loading buffer ,輕 彈 / 用槍吹吸混勻，快速離心集液于管底。五、結(jié)果分析1、酶切結(jié)果電泳檢驗泳道1234561樣品kH II1DNAVH LTesi Jpuciv(HA)pus見商品IU1WH1 UI19 LEI祥量(nJ)5JOO

28、ng5。JOQ ng5.010.0IDJI作用M對照T對照對照T(l)TFigure 4酶切檢驗上樣順序在電泳圖中，我們第9小組的酶切產(chǎn)物在第14泳道，主要的 亮帶有兩條。先從位置上看，較近的一條和第5泳道的pUC19商 品）/ Hindm對齊，說明是這條帶是切開的質(zhì)粒，是線性 DNA 較遠的一條帶和第4泳道的亮帶對齊，說明這條帶是未被切開的 質(zhì)粒，是環(huán)狀DNA環(huán)狀DNA電泳速率比線性 DN秋，這也驗證 了 “近處條帶是酶切成功的質(zhì)粒，遠處條帶是未切開的質(zhì)?！钡?說法。再從亮度上看，酶切開的質(zhì)粒的條帶亮度遠遠亮于未酶切 開的質(zhì)粒，相比其他組，我們組酶切效果是比較好；但相比商品 化質(zhì)粒的酶切效，

29、我們小組的效果不是很好。在第6條帶以后的條帶的遠處都有寬而暗的模糊條帶，而在 商品化pUC19的泳道里，沒有，這應(yīng)該是未分離干凈的RNA點樣槽處亮帶可能是附著蛋白質(zhì)的 DN*段、染色體片段等。123 A 56/ S 3 1U 11 1? 13 14 15 16 W l»Figure 5質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果（我們小組的是第14泳道的，第4泳道是未酶切的pUC19第5泳道是酶切的商品化質(zhì)粒， 第1、3泳道為酶切的入DNA）2、轉(zhuǎn)化結(jié)果觀察與分析實驗設(shè)組培養(yǎng)基涂布平板培養(yǎng)結(jié)果I -試驗組含amp的麥康凱培 養(yǎng)基50 *2平均每個平板17個菌落，其中2個白斑100*2平均每個平板40個菌落，其中

30、3個白斑150*2平均每個平板65個菌落，其中5個白斑200 *2平均每個平板100個菌落n -轉(zhuǎn)化對照含amp的麥康凱培 養(yǎng)基50廠1多于100個菌落，均為紅斑m-細胞對照含amp的麥康凱培 養(yǎng)基50廠1沒后菌落不含amp的麥康凱培養(yǎng)基50廠1菌落數(shù)跡逃大于100個，培養(yǎng)基笠為橘黃色Figure 6 轉(zhuǎn)化實驗結(jié)果及分析氨芾青霉素（amp用于篩選轉(zhuǎn)化進質(zhì)粒 pUC19的大腸桿菌。 細胞對照組中的大腸桿菌沒有轉(zhuǎn)入 pUC19而氨芾青霉素抗性存 在于pUC19上，所以細胞對口組無法在含 amp的培養(yǎng)基上生長， 但能在不含amp的培養(yǎng)基上生長。在麥康凱培養(yǎng)基上，菌落有紅斑和白斑兩種，紅斑是轉(zhuǎn)入空 載體的，白斑是轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的，這是由于a互補原理。pUC19載體上插入了 B-半乳糖音酶的調(diào)控序列和