在高溫和強(qiáng)光脅迫條件下,水楊酸對(duì)小麥葉片中的蛋白激酶活性和葉綠體D1蛋白降解的影響

1、在高溫和強(qiáng)光脅迫條件下，水楊酸對(duì)小麥葉片中的蛋白激酶活性和葉綠體D1蛋白降解的影響主要內(nèi)容背景與意義背景與意義材料與方法材料與方法結(jié)果分析結(jié)果分析討論討論背景與意義背景與意義 小麥?zhǔn)侵袊辈康闹饕Z食產(chǎn)作物，因此它的產(chǎn)量和質(zhì)量直接影響人們的生活水平和食品安全。小麥在灌漿期經(jīng)常遭受高溫和強(qiáng)光脅迫，導(dǎo)致光合器官的損傷，早期葉片功能下降、種子的抑制發(fā)育，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降。 PSII反應(yīng)中心是許多脅迫的主要作用位點(diǎn)，比如高溫和干旱，損傷的程度取決于損傷和修復(fù)的平衡。PSII是由超過25種亞基組成的蛋白復(fù)合物，而葉綠素基因psbA編碼的D1蛋白是許多環(huán)境脅迫因子作用的目標(biāo)部位。因此，D1蛋白的快速周轉(zhuǎn)可

2、作為PSII功能恢復(fù)的前提。 D1 protein的周轉(zhuǎn)和光合體系的狀態(tài)改變與可逆的蛋白磷酸化密切相關(guān)。 在葉綠體中，STN8 and STN7是PSII中心蛋白磷酸化的蛋白激酶，在控制PSI和PSII狀態(tài)改變和能量分布中起重要作用。而在高溫和強(qiáng)光下，葉綠體中蛋白激酶活性的改變和其調(diào)節(jié)機(jī)制所知甚少。 SA是一種很長時(shí)間被用作植物激素的酚類物質(zhì)。很多近期報(bào)道表明SA在植物對(duì)抗非生物脅迫中起重要作用。 SA可通過引起一些蛋白激酶基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)蛋白可逆的磷酸化來調(diào)節(jié)植物的抗逆性。但SA是否能夠通過調(diào)節(jié)葉片中的蛋白激酶的活性來影響D1 protein的周轉(zhuǎn)仍有待探究。 因此研究在高溫和強(qiáng)光下，SA對(duì)

3、小麥葉片葉綠體和PSII的功能性恢復(fù)中的蛋白激酶的活性、D1 protein周轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)，會(huì)為小麥對(duì)高溫和強(qiáng)光脅迫下的抵御機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。材料與方法材料與方法耐熱高產(chǎn)的小麥種子播種，土培。含有有機(jī)物，氮/堿性氮、速效磷、速效鉀。植物隨機(jī)分為3組。當(dāng)旗葉完全展開后，用SA和FSBA預(yù)處理，用水當(dāng)對(duì)照組。3天后，暴露在高溫強(qiáng)光下(36C, 1,800 mol m-2 s-1)2h在人工氣候室恢復(fù)到無脅迫條件(25C, 500 mol m-2 s-1)3h測(cè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)、凈光合率Pn和電子傳遞率、蛋白激酶活性和D1蛋白含量測(cè)量方法 測(cè)量蛋白激酶測(cè)量蛋白激酶活性活性： 膜蛋白通過萃取得到，勻漿離心。

4、進(jìn)行蛋白磷酸化，測(cè)磷酸化活性。 D1蛋白的提取和蛋白的提取和Western blotting analysis蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法提取類囊體膜蛋白，通過考馬斯亮藍(lán)的方法測(cè)定含量。用蛋白質(zhì)印跡法分析，類囊體膜片段通過15% SDS-PAGE分離出并進(jìn)行免疫檢測(cè)。D1蛋白的免疫檢測(cè)通過抗D1蛋白的多克隆抗體。 放氧率和電子傳遞放氧率和電子傳遞率率 放氧率通過氧電極系統(tǒng)測(cè)定，光合電子傳遞率通過Clark-oxygen electrodes測(cè)定。 葉綠素?zé)晒馊~綠素?zé)晒鈪?shù)參數(shù) 葉綠素?zé)晒鈪?shù)通過便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定。測(cè)量葉片先在黑暗中暗適應(yīng)20min。測(cè)Fv/Fm、PSII。每組都5個(gè)平行組，結(jié)

5、果用平均值+-標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。結(jié)果分析結(jié)果分析 1.水楊酸水楊酸對(duì)蛋白激酶活性的對(duì)蛋白激酶活性的影響影響 與對(duì)照組的水預(yù)處理組相比，在所有生長條件下，SA預(yù)處理組的葉片中蛋白激酶活性顯著上升，而FSBA預(yù)處理組的顯著下降。 FSBA預(yù)處理組的顯著下降，不受脅迫和恢復(fù)的影響，表明SA可能刺激蛋白磷酸化而FSBA卻抑制其磷酸化。水預(yù)處理組和SA預(yù)處理組葉片中的蛋白激酶活性在2h高溫和強(qiáng)光脅迫下，顯著提高。脅迫移除時(shí)活性下降，但是仍比無脅迫條件下生長的葉片蛋白激酶活性高，表明高溫強(qiáng)光脅迫增強(qiáng)蛋白激酶的活性，由蛋白激酶引起的蛋白磷酸化是可逆的。 2.水楊酸對(duì)水楊酸對(duì)D1蛋白含量的影響蛋白含量的影響 在F

6、SBA預(yù)處理組的D1蛋白含量顯著下降，只是對(duì)照組的61%。間接證明了磷酸化可阻止D1蛋白的降解。 2h高溫和強(qiáng)光處理后，水預(yù)處理組中，D1蛋白含量下降到對(duì)照組的79%，在3h無脅迫的恢復(fù)后上升到81%，表明高溫和強(qiáng)光引起的D1蛋白的損傷是可逆的。 與水預(yù)處理組葉片相比，SA預(yù)處理組的葉片中的D1蛋白含量更高，無論在脅迫前和脅迫后，表明SA預(yù)處理組顯著抑制D1蛋白的降解，通過刺激高的蛋白激酶活性和調(diào)節(jié)D1蛋白的磷酸化。 3.水楊酸對(duì)水楊酸對(duì)PSII的光化學(xué)效率的影響的光化學(xué)效率的影響 FSBA預(yù)處理組的PSII潛在和實(shí)際光化學(xué)效率與對(duì)照相比，均顯著下降。水預(yù)處理組，F(xiàn)v/Fm和實(shí)際光化學(xué)效率均在

7、脅迫時(shí)下降，在3h恢復(fù)后上升，但仍比無脅迫對(duì)照組低。在SA預(yù)處理組，脅迫和非脅迫條件下，F(xiàn)v/Fm均比水預(yù)處理組高。盡管SA預(yù)處理組葉片的PSII在脅迫前比對(duì)照組稍低，但比起水處理組脅迫和恢復(fù)后高。4.水楊酸水楊酸對(duì)電子傳遞和光合速率的影響對(duì)電子傳遞和光合速率的影響 結(jié)果表明FSBA預(yù)處理組引起了總電子鏈和PSII的光合速率和電子傳遞率的下降。在水處理組的葉片，總電子鏈和PSII的ETR和光合效率在脅迫后下降，在恢復(fù)后顯著升高。SA預(yù)處理組葉片的光合效率和總電子鏈和PSII的ETR總比相對(duì)應(yīng)的水預(yù)處理高。討論討論 研究表明葉綠體中的PSII反應(yīng)中心是高溫強(qiáng)光脅迫下最易受損的部分，其中D1蛋白是

8、PSII最敏感的組分。D1蛋白不僅為許多輔因子提供結(jié)合位點(diǎn)，維持PSII反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且與初級(jí)電荷分離和電子傳遞有關(guān)，因此D1蛋白的損傷會(huì)導(dǎo)致PSII反應(yīng)中心構(gòu)造的改變。高溫和強(qiáng)光下，D1蛋白的損傷和修復(fù)同時(shí)發(fā)生，它們的平衡決定了光抑制的程度。只有當(dāng)修復(fù)率等于損傷率是，可避免光抑制。 脅迫時(shí)維持D1蛋白的有效周轉(zhuǎn)對(duì)保護(hù)光合器官很重要。 周轉(zhuǎn)途徑：損傷的D1蛋白非堆疊面積被蛋白激酶磷酸化，后在改變到類囊體基質(zhì)，之后受損的D1蛋白去磷酸化，最后降解并被新合成的copy替代。因此D1蛋白的周轉(zhuǎn)率主要受限于兩步：可逆的磷酸化和D1蛋白的合成。因此，研究蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)和D1蛋白的周轉(zhuǎn)相關(guān)關(guān)

9、系對(duì)在脅迫條件下保護(hù)光合器官免受損傷是非常重要的。 SA是高等植物中誘導(dǎo)防御機(jī)制的一個(gè)重要信號(hào)分子。 通過SA的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式可以引起蛋白質(zhì)的可逆磷酸化。已知有種SA引導(dǎo)的蛋白激酶SIPK和許多對(duì)生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)，比如滲透脅迫，可以引起SIPK活性的增強(qiáng)。之前的研究可推測(cè)SA可促進(jìn)D1蛋白的修復(fù)和翻轉(zhuǎn)，因此通過誘導(dǎo)蛋白激酶活性和蛋白的可逆磷酸化來保護(hù)光合系統(tǒng)。 小麥葉片用SA預(yù)處理然后暴露在高溫強(qiáng)光脅迫下，來研究蛋白激酶活性，D1蛋白和PSII功能的變化。同時(shí)，F(xiàn)SBA（蛋白激酶的抑制劑）用于確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)果表明SA預(yù)處理不僅能通過調(diào)節(jié)蛋白激酶活性來減輕高溫強(qiáng)光脅迫對(duì)D1蛋白和PSII功能的損傷，而且能夠加速脅迫