第二章第二節(jié)分子熒光和磷光分析法

1、*第二章第二章 分子發(fā)光分析法分子發(fā)光分析法一、一、 儀器與結(jié)構(gòu)流程儀器與結(jié)構(gòu)流程instrument and general process 二、二、 熒光分析法和應(yīng)用熒光分析法和應(yīng)用fluorescence analysis and application三、三、 磷光分析法及應(yīng)用磷光分析法及應(yīng)用phosphorescence analysis and application第二節(jié)第二節(jié) 分子熒光與磷光分析法分子熒光與磷光分析法molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis

2、 *一、儀器結(jié)構(gòu)流程一、儀器結(jié)構(gòu)流程 測量熒光的儀器主要由測量熒光的儀器主要由五個部分五個部分組成：激發(fā)光源、組成：激發(fā)光源、激發(fā)激發(fā)單色器、單色器、樣品池、樣品池、發(fā)射單色器和發(fā)射單色器和檢測器。檢測器。 特殊點特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。高壓汞燈是以汞蒸氣放電發(fā)高壓汞燈是以汞蒸氣放電發(fā)光的光源，主要有光的光源，主要有365、405、436nm 的三條譜線的三條譜線，尤以，尤以365nm譜線最強，譜線最強，一般濾光片式的熒光計多采一般濾光片式的熒光計多采用它為激發(fā)光源用它為激發(fā)光源 光源要求強光源要求強度大、使用度大、使用波長范圍寬波

3、長范圍寬*1.1.定量依據(jù)與方法定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)定量依據(jù) 熒光強度熒光強度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和熒光量子效率和熒光量子效率 的乘積的乘積： If = Ia （1）式）式 根據(jù)吸收定律，根據(jù)吸收定律，I0入射光強度，入射光強度， It透射光強透射光強度，則度，則 Ia=I0- It （2）式）式 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：A= lg(I0/It)= bc It=I010-A=I010- bc Ia = I0(1-10- b c ) （3）式）式 If = I0(1-10- bc ) = I0(1-e-2.3 b c ) （4）式）式 將上式展開，得：將上式展

4、開，得： 二、熒光分析方法與應(yīng)用二、熒光分析方法與應(yīng)用If = Kc當當I0一定時，得一定時，得! 332! 23232320f ).().(.IIbcbcbc濃度很低時（濃度很低時（A = bc 0.05時），時），得：得： If = 2.3 I0 b c I0It入射光入射光透過光透過光*定量關(guān)系的成立條件為：定量關(guān)系的成立條件為： bc小于小于0.05 ，此時，此時 與濃度與濃度無關(guān)，為定值；無關(guān)，為定值； 即這種線性關(guān)系即這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中才成立只有在極稀的溶液中才成立 對于較濃溶液，對于較濃溶液， 由于猝滅由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強度

5、與濃度不成線性關(guān)系。度與濃度不成線性關(guān)系。If = 2.3 I0 b c If = Kc問問:為什么熒光分析法的靈敏度比相應(yīng)的吸收光度法高為什么熒光分析法的靈敏度比相應(yīng)的吸收光度法高?熒光強度疊加在很小的背景值上，提高熒光訊號的放大熒光強度疊加在很小的背景值上，提高熒光訊號的放大倍數(shù)倍數(shù); I0A= lg(I0/It)*（2 2）定量方法）定量方法標準曲線法：標準曲線法： 配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度；上求出濃度；1.

6、 確定確定 ex和和 em (激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)；2. 確定適宜的條件確定適宜的條件: 試劑濃度、試劑濃度、pH、T、t 等；等；3. 以標準溶液做工作曲線；以標準溶液做工作曲線；4. 測未知樣的熒光強度測未知樣的熒光強度(If), 根據(jù)工作曲線計算熒光根據(jù)工作曲線計算熒光物質(zhì)的濃度物質(zhì)的濃度. If = Kc*3.3.熒光分析法的應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用(1)(1)無機化合物的分析無機化合物的分析 與有機試劑形成配合物后測量；可測量約與有機試劑形成配合物后測量；可測量約6060多種元素。多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采

7、用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定( (液氮溫度液氮溫度-196-196) )； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定 如：如：pH=8.50,Cu2+能催化過氧化氫氧化羅丹明能催化過氧化氫氧化羅丹明6G,使其發(fā)使其發(fā)生熒光猝滅生熒光猝滅,建立了測定微量建立了測定微量Cu2+的催化熒光分析法的催化熒光分析法. 如如:鈾的測定鈾的測定

8、:將將80gNaF壓制成片壓制成片,取含鈾溶液滴在片上取含鈾溶液滴在片上,在在1000燒成熔珠后測量燒成熔珠后測量.*(2)生物與有機化合物的分析生物與有機化合物的分析 脂肪族有機化合物脂肪族有機化合物般需要與某些試劑反般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進行熒光分析。應(yīng)后才能進行熒光分析。 帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯帶苯環(huán)的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸，可以直借用熒光法測定?；彼幔梢灾苯栌脽晒夥y定。 見表見表. 芳香族化合物具有共軛的不飽和體系，多芳香族化合物具有共軛的不飽和體系，多能發(fā)熒光。此外，胺類、蛋白質(zhì)、酶與輔酶能發(fā)熒光。此外，胺類、蛋白質(zhì)、酶與輔酶、維生素等均可用熒光法

9、進行分析。、維生素等均可用熒光法進行分析。*磷光分析法基本原理磷光分析法基本原理一、磷光的產(chǎn)生和磷光強度一、磷光的產(chǎn)生和磷光強度 磷光是由處于第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級的磷光是由處于第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級的分子躍遷返回基態(tài)時所產(chǎn)生的輻射。分子躍遷返回基態(tài)時所產(chǎn)生的輻射。二、與熒光比較，磷光的特點：二、與熒光比較，磷光的特點： (1)磷光輻射的波長比熒光長；磷光輻射的波長比熒光長； (2)磷光的發(fā)光速率慢，但具有較長的壽命；磷光的發(fā)光速率慢，但具有較長的壽命； (3)磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子非常敏感磷光的壽命和輻射強度對于重原子和順磁性離子非常敏感 （4）發(fā)光效率受溫度

10、影響大。）發(fā)光效率受溫度影響大。 由于三重態(tài)的壽命長，激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子發(fā)生碰撞由于三重態(tài)的壽命長，激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子發(fā)生碰撞去激發(fā)的幾率增大，使磷光強度減弱甚至消失。去激發(fā)的幾率增大，使磷光強度減弱甚至消失。 當磷光物質(zhì)濃度很小時：當磷光物質(zhì)濃度很小時： Ip = Kc*2重原子效應(yīng)：重原子效應(yīng)：1增加試樣的剛性增加試樣的剛性3.室溫磷光室溫磷光(1)固體磷光法：在室溫下以固體基質(zhì)吸附磷光體，增加分子固體磷光法：在室溫下以固體基質(zhì)吸附磷光體，增加分子剛性剛性,減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。 濾紙、纖維素色層紙、氧化鋁、硅

11、膠等濾紙、纖維素色層紙、氧化鋁、硅膠等 這種方法可減小質(zhì)點間的碰撞幾率這種方法可減小質(zhì)點間的碰撞幾率,以減小無輻射躍遷以減小無輻射躍遷.低低溫熒光法就是基于這一原理的：在低溫下（溫熒光法就是基于這一原理的：在低溫下（77K)，將試樣的，將試樣的乙醚或異戊醇溶液冷凍成透明玻璃狀后測定。乙醚或異戊醇溶液冷凍成透明玻璃狀后測定。 重原子的高核電荷使磷光分子的電子能級交錯，容易重原子的高核電荷使磷光分子的電子能級交錯，容易引起或增強磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使引起或增強磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使S1T1的的系間竄躍概率增大，有利于增大磷光效率。除了使用含有系間竄躍概率增大，有利于增大磷光

12、效率。除了使用含有重原子的溶劑外，還可采用重原子的溶劑外，還可采用Ag+鹽、鹽、Pb2+鹽和鹽和T1+鹽等重金鹽等重金屬鹽類。屬鹽類。三、為了獲得較強的磷光，宜采用以下措施三、為了獲得較強的磷光，宜采用以下措施:*(3)敏化磷光敏化磷光(2)膠束增穩(wěn)：膠束增穩(wěn)： 利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境，增加定向約束力，使其剛性增強。從而減磷光體的微環(huán)境，增加定向約束力，使其剛性增強。從而減小碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性小碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性 如：在表面活性劑十二烷基硫酸鹽和重原子離子如：在表面活

13、性劑十二烷基硫酸鹽和重原子離子T1+ (鉈鉈，音，音ta)和和Pb2+的存在下，室溫可測定的存在下，室溫可測定10-610-7mol的萘、芘的萘、芘和聯(lián)苯，精密度達和聯(lián)苯，精密度達6%。采用這種方法，可采用這種方法，可測定測定10-9mol/L的可卡因。的可卡因。 分析物本分析物本身年個并不發(fā)身年個并不發(fā)磷光磷光,而是引而是引發(fā)受體發(fā)磷光發(fā)受體發(fā)磷光.*四、磷光分析儀器四、磷光分析儀器 熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。熒光發(fā)射的同時測量磷光。 測量方法：測量方法：（1 1）通常借助于熒光和磷）通常借助于熒光

14、和磷光壽命的差別，在激發(fā)光被光壽命的差別，在激發(fā)光被旋轉(zhuǎn)斬光片阻斷時，熒光停旋轉(zhuǎn)斬光片阻斷時，熒光停止發(fā)射，而磷光則持續(xù)發(fā)射止發(fā)射，而磷光則持續(xù)發(fā)射。采用磷光鏡的裝置將熒光。采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。隔開。（2 2）還可采用脈沖光源和）還可采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術(shù)?？煽貦z測及時間分辨技術(shù)。 室溫測量時，不需要杜瓦瓶。室溫測量時，不需要杜瓦瓶。 與熒光計區(qū)別：與熒光計區(qū)別：1.樣品池樣品池 2.斬光器斬光器*三、磷光分析法的應(yīng)用三、磷光分析法的應(yīng)用1.1.稠環(huán)芳烴和稠環(huán)芳烴和石油產(chǎn)品石油產(chǎn)品分析分析 采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；如：芘、苯并芘、萘酚等，如：芘、苯并芘、萘酚等，見表見表2