在線(xiàn)二維液相色譜法快速測(cè)定桂枝茯苓膠囊中芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量

1、在線(xiàn)二維液相色譜法快速測(cè)定桂枝茯苓膠囊中芍藥苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量高效液相色譜已成為中藥復(fù)雜體系研究的重要技術(shù)， 隨著新 型色譜柱填料和鍵合技術(shù)的發(fā)展， 為中藥中各類(lèi)成分的分離提供 了多種選擇，然而中藥的復(fù)雜性已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了人們的設(shè)想， Davis 等1 曾經(jīng)指出用一維分離方法對(duì)含有 100 個(gè)隨機(jī)組分的樣品進(jìn) 行分離，完全分離 82個(gè)組分，至少需要 400 萬(wàn)的理論板數(shù)，且 當(dāng)色譜峰的數(shù)量超過(guò)峰容量的 37%時(shí)，系統(tǒng)的分離度會(huì)大大降低， 所以在現(xiàn)有技術(shù)條件下， 期望如此高的柱效和峰容量是不切實(shí)際 的。多維液相色譜分離是液相色譜發(fā)展的一個(gè)重要方向， 它是將 多種不同分離機(jī)制的色譜體系

2、進(jìn)行聯(lián)用， 增加了色譜系統(tǒng)的分離 能力，擴(kuò)大了分離空間，提高了系統(tǒng)的峰容量，可以滿(mǎn)足復(fù)雜樣 品的分離要求。在多維色譜分離手段中，二維分離最為常見(jiàn)。二 維色譜根據(jù)一維組分是否直接進(jìn)入到第二維進(jìn)行分離可分為離 線(xiàn)2-4 和在線(xiàn) 5-62 類(lèi)，其中在線(xiàn)方法具有自動(dòng)化程度高、避 免人為誤差及加快樣品分析效率等優(yōu)點(diǎn)， 二維液相色譜分離技術(shù) 已被越來(lái)越多的應(yīng)用到中藥的研究中 7-9 。桂枝茯苓膠囊系漢代張仲景 金匱要略 古方桂枝茯苓丸的 改進(jìn)劑型，經(jīng)現(xiàn)代制造工藝精制而成為純中藥制劑，由桂枝、牡 丹皮、桃仁、赤芍和茯苓組成。在 2010 年版中國(guó)藥典中收 載的桂枝茯苓膠囊含量測(cè)定項(xiàng)下分別采用 3 種高效液相

3、色譜法測(cè)定丹皮酚、 芍藥苷和苦杏仁苷的含量 10 ，不僅實(shí)際樣品的分 析效率較低， 且缺乏來(lái)自桂枝中的指標(biāo)性成分。 本文利用雙梯度 高效液相系統(tǒng)（ dual gradient liquid chromatography， DGLC）在線(xiàn)二維色譜分離技術(shù)，樣品提取后，溶液直接進(jìn)樣分析，并同 時(shí)測(cè)定了肉桂酸的含量， 含量測(cè)定結(jié)果與原方法基本一致， 且樣 品分析效率大大提升，可用于桂枝茯苓膠囊的質(zhì)量分析。1 材料雙三元液相色譜RS系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛世爾公司），配置 6 通道真空脫氣機(jī)SRD36O0雙梯度分析型色譜泵 DGP3600RS自 動(dòng)進(jìn)樣器 WPS3000TSL柱溫箱TCC-3000 （配有1個(gè)

4、六通閥和1 個(gè)十通閥），二極管陣列檢測(cè)器DAD3000RS變色龍色譜管理軟件 Chromeleon 6.8 SR11; Acclaim PAH （4.6 mnh 150 mm 3 卩 m, 美國(guó)賽默飛世爾公司， 批號(hào)063191） ; Acclaim C18色譜柱（3.0 mm98%， 上海安譜，STA-07013001）;苦杏仁苷（amygdaloside，純度 99% 上海安譜，STA-20107007）;肉桂酸 （cinnamic acid ,純度 99% 上海安譜，STA-43200000）。桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)XX公司，產(chǎn)品批號(hào) 110625， 110626， 110730）。

5、2 方法和結(jié)果2.1 色譜條件 一維分析泵的流動(dòng)相 A 為乙腈，流動(dòng)相 B 為 0.08%磷酸+0.08%三乙胺， Acclaim 120 C18 為一維分析柱，流 速為 0.5 mL?min-1,梯度洗脫，010 min, 15%A 1025 min, 15%75%A 2530 min, 75%85%A 3033 min, 85%A 33 35 min , 85%15%A二維分析泵的流動(dòng)相 A為乙腈，流動(dòng)相 B 為 20 mmol, pH 3.0 的磷酸二氫鉀，Acclaim PA II C18 為二維分 析柱,梯度洗脫程序, 0 5 min , 5%A, 5 15 min , 5% 40%

6、A, 1515.2 min , 40%5%A, 15.220 min , 5%A, 2030 min , 5%70%A 3035 min, 70%A 流速 0.8 mL?min-1,柱溫 35 C, 檢測(cè)波長(zhǎng) 0 10 min，230 nm，10 15 min，218 nm，15 35 min， 275 nm,進(jìn)樣量 5 L。2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取肉桂酸、芍藥苷、苦 杏仁苷和丹皮酚對(duì)照品適量，按照 2010 年版中國(guó)藥典桂枝 茯苓膠囊項(xiàng)下對(duì)照品溶液制備方法， 制得各對(duì)照品質(zhì)量濃度分別 為 0.63，1.11 ，0.66，1.32 g?L-1 。2.3 樣品溶液的制備 取桂枝茯苓

7、膠囊 10 粒，將內(nèi)容物至研缽中研勻，取細(xì)粉約 0.25 g ，精密稱(chēng)定，置具塞的錐形瓶中，加入50%甲醇 25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取 30 min ，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，補(bǔ)足 失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液適量，即得。2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取缺少桂枝、桃仁、白芍和牡丹皮的 陰性制劑， 按照 2.3 項(xiàng)下方法制備陰性樣品。 按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)照品、樣品、陰性樣品的分離譜圖見(jiàn)圖13。從陰性樣品疊加譜圖可以看出， 不干擾目標(biāo)物的測(cè)定， 方法專(zhuān)屬性 較好。其中，010 min為一維色譜分離過(guò)程， 波長(zhǎng)230 nm 10 15 min 為二維色譜分離過(guò)程，波長(zhǎng) 218 nm；1525

8、min 為一維 色譜分離過(guò)程，波長(zhǎng) 275 nm；25 35 min 為二維色譜分離過(guò)程， 波長(zhǎng)為 275 nm。2.5線(xiàn)性關(guān)系考察 分別取各對(duì)照品溶液2 mL （肉桂酸對(duì)照 品200卩L）至10 mL量瓶中，加50卿醇至刻度，作為混合對(duì) 照溶液 1，再分別從對(duì)照品溶液 1 中精密量取 5.0， 2.5， 1.0， 0.5 , 0.25 mL至10 mL量瓶中，加50卿醇稀釋至刻度，搖勻， 制成系列混合對(duì)照品溶液。 按照 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析， 以 峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，肉桂酸、 芍藥苷、苦杏仁苷、丹皮酚分別在 0.31512.6， 5.55222.0， 3.

9、3132， 6.6264 mg?L-1 線(xiàn)性關(guān)系良好， r 分別為 0.999 7 ， 0.999 7 ， 0.999 8 ， 0.999 5 。2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣 5 次，結(jié)果表明，肉桂酸、芍藥苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.33%， 0.51%， 0.39%， 0.64%。2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取待測(cè)樣品溶液，分別于配制后 0， 2， 4，6， 10， 12 h 進(jìn)樣，測(cè)定待測(cè)成分的峰面積，結(jié)果表明，肉桂酸、 芍藥苷、苦杏仁苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.4%, 0.45%,1.1%， 0.46%。2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的桂枝茯苓膠囊樣品粉末

10、5 份， 每份 0.25 g ，精密稱(chēng)定。按照樣品溶液制備方法制備樣品，按 照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，肉桂酸、芍藥苷、苦杏仁 苷和丹皮酚含量的 RSD分別為0.39%, 0.65%, 0.68%, 0.78%。2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品 6份，每份 0.1 g ， 精密稱(chēng)定,置錐形瓶中,加入芍藥苷、苦杏仁苷、丹皮酚和肉桂 酸對(duì)照品溶液適量, 按照供試品溶液制備方法制備樣品并測(cè)定含 量,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表 1。2.10 含量測(cè)定 取批號(hào)為 110730, 110625, 110626的桂枝 茯苓膠囊 0.25 g ,精密稱(chēng)定,按照樣品前處理方法制備樣品溶 液,分別采用本法

11、與藥典方法測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表 2。3 討論3.1 分析流路構(gòu)建 樣品中芍藥苷與丹皮酚的含量較高,樣 品基質(zhì)成分干擾較少, 利用一維色譜進(jìn)行分離, 而苦杏仁苷與肉 桂酸的含量較低, 受到基質(zhì)成分干擾影響較大, 因此采用中心切 割的二維分離方法,將 2 種成分分別切至二維色譜中進(jìn)行分離。 為避免在切換轉(zhuǎn)移過(guò)程中系統(tǒng)壓力的驟然變化對(duì)色譜柱造成的 影響,試驗(yàn)中采用定量環(huán)儲(chǔ)存樣品。 為減少一維溶劑效應(yīng)的影響, 試驗(yàn)中米用300卩L的定量環(huán)，并盡量減小一維色譜柱的柱體積。 同時(shí)在一維和二維色譜柱的柱后通過(guò) 1 個(gè)六通閥實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)器 的共用,使方法更具普適性。 整個(gè)系統(tǒng)流路和閥切換過(guò)程見(jiàn)圖 4, 表 3。3.2

12、 色譜條件確定 本文為實(shí)現(xiàn)一維和二維分離選擇的正交性，在色譜柱選擇上先后嘗試了 PFP+C18 PFP+P/SC18, C18+P如C18等組合，最終確定 C18+P如C18組合（柱選擇性對(duì) 比函數(shù)FS=6111）?？色@得良好的峰形和分離度；在流動(dòng)相選 擇上，試驗(yàn)中曾嘗試在一維和二維分離中的有機(jī)相分別采用甲醇 和乙腈，但由于苦杏仁苷與肉桂酸的色譜峰在一維分離過(guò)程中峰 寬較大， 切割過(guò)程中可能會(huì)造成損失， 若一維分離的有機(jī)相也采 用乙腈， 則 2 種成分的峰寬較小， 且與二維色譜流動(dòng)相相溶性較 好。在水相選擇上， 本文為使芍藥苷和丹皮酚在一維分離過(guò)程中 獲得良好的峰形和分離度，選擇了 0.08%

13、磷酸系統(tǒng)，并加入了 0.08%的三乙胺，而二維水相中加入磷酸緩沖鹽，可以減少一維 溶劑pH變化對(duì)二維分離造成的影響。3.3 含量測(cè)定結(jié)果比較 比較樣品的含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍 藥苷、丹皮酚的含量基本一致，但苦杏仁苷的含量差異較大（本 法較藥典方法低近 5%）。本文首先對(duì)比了采用藥典方法和本法 的樣品譜圖中苦杏仁苷色譜峰的 UV光譜均勻性，結(jié)果二者基本 一致，且光譜均勻性均較好，無(wú)法通過(guò)UV二極管陣列檢測(cè)器來(lái)判斷方法的專(zhuān)屬性。 因此本文采用二維分離手段， 在常規(guī)藥典方 法基礎(chǔ)上， 將苦杏仁苷峰的主體中心切割至第二維色譜柱中進(jìn)行 分離，結(jié)果見(jiàn)圖 5，由于一維和二維色譜柱存在分離選擇性的差 異，結(jié)果在同樣檢測(cè)波長(zhǎng)下， 在二維分離的譜圖中可見(jiàn)明顯雜質(zhì) 峰（ tR=16.953 min） ，說(shuō)明常規(guī)藥典的分離手段存在基質(zhì)干擾