外源性VEGF誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變

外源性VEGF誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變【摘要】目的：探討外源性VEGF誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變的特點(diǎn)。方法：大鼠120只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、rrVEGF164低、高濃度組。不同時(shí)間行熒光素眼底血管造影、視網(wǎng)膜電圖振蕩電位、組織學(xué)檢查。結(jié)果：高濃度組注射rrVEGF164眼從注射后10d表現(xiàn)為眼底后極部視網(wǎng)膜動(dòng)脈局限性高熒光，2wk時(shí)表現(xiàn)為單個(gè)視網(wǎng)膜內(nèi)核層毛細(xì)血管管腔窄小，內(nèi)皮細(xì)胞肥大,管腔面積和細(xì)胞面積分別與自身對(duì)照眼、4，6wk比較，差異有顯著性。視網(wǎng)膜電圖OPs總波幅2，6wk降低，分別與自身對(duì)照眼、4wk比較，差異有顯著性。結(jié)論：高濃度高頻率注射rrVEGF164誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜血管病變主要表現(xiàn)有視網(wǎng)膜水腫，大血管擴(kuò)張，內(nèi)核層毛細(xì)血管管腔變窄、接近閉塞，內(nèi)皮細(xì)胞肥大、增生，周邊部玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣膜。

【關(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜毛細(xì)血管

0引言

VEGF是最重要的促血管形成因子，組織缺血、缺氧是VEGF的啟動(dòng)因素。缺血性眼病的視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜下新生血管膜等均有VEGF的表達(dá)，眼內(nèi)VEGF濃度明顯升高[1]。目前有關(guān)VEGF的研究大多是離體拮抗外源性VEGF或在體拮抗內(nèi)源性VEGF的藥物抑制實(shí)驗(yàn)，而單獨(dú)應(yīng)用外源性VEGF進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管病變的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外研究甚少。我們探討外源性VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管病變的特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究藥物拮抗VEGF打下基礎(chǔ)。

1材料和方法

材料Sprague-Daweley大鼠120只隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組36只，不作眼內(nèi)注射。VEGF低濃度組36只，實(shí)驗(yàn)眼每次注射濃度為10mg/L的rrVEGF1644μL，自身對(duì)照眼注射等量的/LPBS。兩眼均為隔天1次，共2次。VEGF高濃度組48只，實(shí)驗(yàn)眼每次注射濃度為100mg/L的rrVEGF1644μL，自身對(duì)照眼注射等量的/LPBS。兩眼均為隔天1次，共4次。分別于2，4，6wk時(shí)均作眼底檢查后各隨機(jī)選取6只作眼底熒光血管造影、6只作視網(wǎng)膜電圖振蕩電位檢查，再各隨機(jī)抽取6只處死作組織學(xué)切片、6只處死作透射電子顯微鏡觀察。VEGF高濃度組剩余12只于12wk時(shí)處死，隨機(jī)選取各6只行組織學(xué)切片、透射電子顯微鏡檢查。Topcon眼底照相機(jī)，視覺(jué)電生理診斷儀，正方測(cè)試格，玻璃毛細(xì)管，重組大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，F(xiàn)ITC-Dextran。

方法大鼠充分散瞳后，30g/L戊巴比妥鈉溶液ip麻醉。結(jié)膜囊表面麻醉，眼科手術(shù)顯微鏡下用30#B-D針頭于背側(cè)角膜緣后1mm處刺穿眼球壁后立即出針，角膜緣行前房穿刺，消毒剪刀將自制玻璃體腔微量注射針針尖剪去，暴露開(kāi)口。10μL加樣移液器抽取rrVEGF164或PBS4μL注于消毒的點(diǎn)樣紙上。自制玻璃體腔微量注射針立即吸取。沿預(yù)先穿刺好的針孔處以45～50°的角度進(jìn)入眼內(nèi)并緩慢注射，停留約15s后拔針。術(shù)眼涂眼膏，術(shù)后3d用3g/L諾氟沙星滴眼液滴眼，2次/d。注射rrVEGF164或PBS前、后，出現(xiàn)玻璃體出血者不納入實(shí)驗(yàn)對(duì)象。散瞳后，ip麻醉大鼠，結(jié)膜囊表面麻醉。暗適應(yīng)30min，暗紅光下安放3個(gè)電極，小號(hào)銀針柄端連接于電極線末端后，角膜電極插于上方周邊部角膜基質(zhì)層，參考電極置于兩眼連線的中點(diǎn)皮下，地電極置于同側(cè)耳根皮下，黑色膠紙遮蓋未檢查眼。根據(jù)國(guó)際臨床視覺(jué)電生理學(xué)會(huì)制定的視覺(jué)電生理標(biāo)準(zhǔn)化方案，設(shè)定刺激參數(shù),雙眼分別記錄視網(wǎng)膜電圖振蕩電位(electroretinographicoscillatorypotentials,ERG-OPs)。散瞳后眼底熒光血管造影，鼠尾靜脈注射50g/LFITC-Dextran，固定動(dòng)物，注射造影劑后5s，各個(gè)方位眼底照相，每次拍片間隔5～10s，持續(xù)3min，選擇性拍片直至注射造影劑50min。剝離視網(wǎng)膜，常規(guī)電鏡制片，每只大鼠每眼隨機(jī)觀察2個(gè)銅網(wǎng)，每個(gè)銅網(wǎng)隨機(jī)照相2張。同一組、同一眼別的樣本分散，使各組樣本容量達(dá)24張。對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)核層單個(gè)毛細(xì)血管管腔面積、血管內(nèi)皮細(xì)胞面積進(jìn)行形態(tài)計(jì)量，采用正方測(cè)試格計(jì)數(shù)法測(cè)量視網(wǎng)膜內(nèi)核層單個(gè)毛細(xì)血管管腔面積、血管內(nèi)皮細(xì)胞的面積。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSSforWindows統(tǒng)計(jì)軟件處理。資料正態(tài)檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)后，單因素方差分析，兩因素方差分析，P＜為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

2結(jié)果

直接眼底鏡觀察注射rrVEGF164眼低濃度組在注射后1d表現(xiàn)為玻璃體腔輕度混濁，隨后逐漸減輕，至3d恢復(fù)透明。高濃度組在注射后1d表現(xiàn)玻璃體中度混濁，5～6d后玻璃體腔恢復(fù)透明。約10d表現(xiàn)為眼底后極部大血管輕度結(jié)節(jié)樣擴(kuò)張，周圍視網(wǎng)膜輕度水腫，2wk時(shí)重度擴(kuò)張，4wk時(shí)有所加重。6wk時(shí)與4wk時(shí)相比無(wú)明顯變化。12wk時(shí)玻璃體腔出現(xiàn)纖維組織增生，眼底模糊不清。注射PBS眼無(wú)玻璃體混濁，低濃度組和注射PBS眼未出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣擴(kuò)張和視網(wǎng)膜水腫。

眼底熒光血管造影高濃度組注射rrVEGF164眼視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈約11s開(kāi)始充盈，灌注時(shí)間較正常組延長(zhǎng)。注射rrVEGF164后10d表現(xiàn)為眼底后極部視網(wǎng)膜動(dòng)脈局限性高熒光，熒光素從中央?yún)^(qū)開(kāi)始消退。2wk時(shí)呈結(jié)節(jié)樣擴(kuò)張，隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯，6wk時(shí)與4wk時(shí)比較無(wú)明顯加重。未見(jiàn)視網(wǎng)膜前新生血管滲漏征象。3mo時(shí)玻璃體腔纖維血管樣組織增生，眼底觀察困難，未行造影檢查。

組織學(xué)觀察光鏡下低濃度組可見(jiàn)視網(wǎng)膜水腫，各個(gè)層次厚度無(wú)明顯變化。未見(jiàn)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞。高濃度組10d時(shí)輕度視網(wǎng)膜水腫，2wk時(shí)視網(wǎng)膜水腫加重，6wk時(shí)視網(wǎng)膜內(nèi)界膜不完整，視網(wǎng)膜前纖維組織樣增生，12wk時(shí)在眼底周邊部玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣組織增生。透射電鏡顯示正常大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈扁長(zhǎng)形，細(xì)胞核較大，突入毛細(xì)血管管腔內(nèi)。胞質(zhì)稀少，含有高爾基體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)。高濃度組實(shí)驗(yàn)眼2wk時(shí)表現(xiàn)為視網(wǎng)膜內(nèi)核層單個(gè)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大、管腔面積變窄，4wk與6wk時(shí)血管管腔、細(xì)胞面積恢復(fù)正常，但是6wk時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生明顯。12wk血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，毛細(xì)血管接近閉塞。內(nèi)核層單個(gè)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管腔面積和單個(gè)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞面積經(jīng)配伍設(shè)計(jì)兩因素方差分析，注射rrVEGF164眼同一濃度不同時(shí)間各組間比較：100mg/L組差異有顯著性，單個(gè)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管管腔面積F＝，P＝。進(jìn)一步用多個(gè)樣本均數(shù)q檢驗(yàn)，4wk與6wk組差異無(wú)顯著性，P＝，2wk組與4wk組，2wk組與6wk組差異有顯著性。單個(gè)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞面積F＝，P＝。進(jìn)一步用多個(gè)樣本均數(shù)q檢驗(yàn)，4wk組與6wk組比較差異無(wú)顯著性，P＝，2wk組與4wk組，2wk組與6wk組差異有顯著性(表1)。

視網(wǎng)膜電圖振蕩電位總波幅經(jīng)配伍設(shè)計(jì)兩因素方差分析，同一濃度不同時(shí)間各組間比較：100mg/L組差異有顯著性，F(xiàn)＝，P＝。進(jìn)一步用多個(gè)樣本均數(shù)q檢驗(yàn)，2wk組與6wk組比較，差異無(wú)顯著性，P＝。2wk組與4wk組，6wk組與4wk組差異有顯著性。

3討論

玻璃體腔注射的量過(guò)低，玻璃體腔藥物濃度、藥物在玻璃體內(nèi)的彌散受影響。Dureau等研究發(fā)現(xiàn)注射量為3μL或者5μL具有丟失量少、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。而Hayashi等的經(jīng)驗(yàn)是：對(duì)200～250g的白化病大鼠注射玻璃體的液體量的原則是最大量不超過(guò)玻璃體容積的10%。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠玻璃體腔內(nèi)注射rrVEGF164的體積為4μL，前房穿刺可防止注射后眼壓升高。高分子量右旋糖苷標(biāo)記的熒光素不會(huì)從血管內(nèi)漏出，背景熒光很低。為了比較清晰的顯示視網(wǎng)膜血管病變，不遺漏可能出現(xiàn)的早期新生血管，我們選擇50g/LFITC-dextran1mL鼠尾靜脈注射眼底血管造影，大鼠視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)顯示清晰。正常大鼠眼底熒光血管造影與人眼比較，具有灌注時(shí)間短、熒光素完全消退時(shí)間延長(zhǎng)等特點(diǎn)。我們推測(cè)可能與大鼠體表面積少、高分子量的右旋糖苷標(biāo)記物使熒光素衰減慢有關(guān)。

研究糖尿病視網(wǎng)膜病變時(shí)最常用的指標(biāo)是振蕩電位各子波波幅的總和。實(shí)驗(yàn)中我們誘導(dǎo)的早期視網(wǎng)膜血管病變?cè)谝欢ǔ潭壬项愃朴谔悄虿⌒砸暰W(wǎng)膜病變的早期改變,但未發(fā)現(xiàn)明顯的視網(wǎng)膜缺血無(wú)灌注區(qū)域?？赡苡腥缦略颍篤EGF的濃度和刺激時(shí)間不足；極周邊部視網(wǎng)膜即使出現(xiàn)上述病變，造影時(shí)的角度、動(dòng)物麻醉時(shí)的眼位固定狀態(tài)也可能影響造影時(shí)觀察，難以發(fā)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高濃度組2wk時(shí)視網(wǎng)膜內(nèi)核層血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，血管管腔面積減少。我們推測(cè)這種改變影響組織的血液供應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜的缺血。因此可能引起的OPs改變先于a，b波的改變。因此我們選擇OPs的總波幅作為觀察指標(biāo)。結(jié)果顯示高濃度組2wk時(shí)SAOPs降低，說(shuō)明血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，毛細(xì)血管管腔變窄導(dǎo)致了視網(wǎng)膜缺血。

VEGF作為一種重要的促進(jìn)新生血管形成因子，已被人們所認(rèn)識(shí)。VEGF的明膠微球置于獼猴的視網(wǎng)膜下后，視網(wǎng)膜下新生血管的形成率為92％。Alikcacem等將VEGF緩釋裝置置入兔的玻璃體腔，誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變與增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變類似。Tolentino等認(rèn)為VEGF誘導(dǎo)的獼猴視網(wǎng)膜出血、水腫、靜脈串珠、毛細(xì)血管閉塞、微血管瘤、視網(wǎng)膜內(nèi)血管組織增生等視網(wǎng)膜病變類似于糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其他缺血性視網(wǎng)膜病變。采用ADPase染色的方法，證明周邊部眼底存在視網(wǎng)膜前新生血管。VEGF誘導(dǎo)猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大亦有報(bào)道。本研究顯示：低濃度作用，玻璃體視網(wǎng)膜血管病變不明顯。高濃度短時(shí)間作用可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜內(nèi)核層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，管腔面積減少。高濃度較長(zhǎng)時(shí)間可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生。高濃度長(zhǎng)時(shí)間作用可以出現(xiàn)視網(wǎng)膜內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，管腔面積接近閉塞，玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣組織。但是，在高濃度作用4wk時(shí)，誘導(dǎo)的病變僅限于視網(wǎng)膜血管曲張，視網(wǎng)膜內(nèi)核層的毛細(xì)血管管腔、血管內(nèi)皮細(xì)胞未出現(xiàn)變化。我們推測(cè)在rrVEGF164作用2wk至6wk之間，也就是血管內(nèi)皮細(xì)胞從肥大到增生的演變過(guò)程中，存在某種更替機(jī)制?？赡茉?wk時(shí)外源性的rrVEGF164對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于作用階段，表現(xiàn)為細(xì)胞代償性肥大。在4wk時(shí)玻璃體腔外源性的rrVEGF164的濃度不足以再起刺激作用。在6wk或更晚期階段，在先期階段外源性的rrVEGF164作用下，內(nèi)源性的機(jī)制被啟動(dòng)，而表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，甚至玻璃體視網(wǎng)膜纖維血管樣組織增生。

產(chǎn)生視網(wǎng)膜前新生血管，必須要有足夠強(qiáng)度的刺激因素，而且要具備足夠的刺激時(shí)間。視網(wǎng)膜層間的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖可以認(rèn)為是視網(wǎng)膜內(nèi)新生血管形成的征象，但是這種新生血管因?yàn)橄鄬?duì)靜止，不會(huì)產(chǎn)生滲漏等改變，因此不同于視網(wǎng)膜前、視網(wǎng)膜下的新生血管，它的臨床意義不大。我們推測(cè)早期的血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大，血管管腔面積減少，影響視網(wǎng)膜局部血液供應(yīng)，視網(wǎng)膜水腫，局限性缺血、缺氧，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能發(fā)生改變，視網(wǎng)膜電圖振蕩電位總波幅降低。但是rrVEGF誘導(dǎo)的這種視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大的確切原因、病理意義，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化有待更深層次的研究。

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