(3.4)-第4章酶的提取與分離純化

PAGEPAGE19酶工程電子教案第三章酶的提取與分離純化◆酶的提取與分離純化是指將酶從細(xì)胞或其它含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所要求的酶制品的過程?！糁饕獌?nèi)容包括細(xì)胞破碎，酶的提取，離心分離，過濾與膜分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，濃縮，干燥、結(jié)晶等。1.細(xì)胞破碎◆細(xì)胞破碎方法可以分為機械破碎法，物理破碎法，化學(xué)破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。表3-1細(xì)胞破碎方法及其原理分類細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎原理機械破碎法搗碎法研磨法勻漿法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。化學(xué)破碎法添加有機溶劑添加表面活性劑通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎1.1機械破碎法◆通過機械運動所產(chǎn)生的剪切力的作用，使細(xì)胞破碎的方法稱為機械破碎法。◆常用的破碎機械有組織搗碎機，細(xì)胞研磨器，勻漿器等?！魴C械破碎法分為3種:搗碎法，研磨法和勻漿法。1.2物理破碎法◆通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用于微生物細(xì)胞的破碎?！舫Ｓ玫奈锢砥扑榉ǚ椒ㄓ袦囟炔钇扑榉?、壓力差破碎法、超聲波破碎法等，現(xiàn)簡介如下：(1)溫度差破碎法：利用溫度的突然變化，由于熱脹冷縮的作用而使細(xì)胞破碎的方法稱為溫度差破碎法。(2)壓力差破碎法：通過壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎的方法稱為壓力差破碎法。常用的有高壓沖擊法、突然降壓法、及滲透壓變化法等。(3)超聲波破碎法：利用超聲波發(fā)生器所發(fā)出的聲波或超聲波的作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴作用（cavitation）而使細(xì)胞破碎的方法稱為超聲波破碎法。1.3化學(xué)破碎法◆通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎的方法稱為化學(xué)破碎法。◆常用的化學(xué)試劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機溶劑，和特里頓（Triton）、吐溫（Tween）等表面活性劑?！粲袡C溶劑可以使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，使胞內(nèi)酶等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到細(xì)胞外?！舯砻婊钚詣┛梢院图?xì)胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而增加細(xì)胞膜的透過性。1.4酶促破碎法◆通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法稱為酶促破碎法，或稱為酶學(xué)破碎法?！魧⒓?xì)胞在一定的pH值和溫度條件下保溫一段時間，利用細(xì)胞本身酶系的作用，使細(xì)胞破壞，而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋出的方法，稱為自溶法。

自溶法效果的好壞取決于溫度、pH值、離子強度等自溶條件的選擇與控制。

為了防止其他微生物在自溶細(xì)胞液中生長，必要時可以添加少量的甲苯、氯仿、疊氮鈉等防腐劑?！舾鶕?jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)的特點，還可以外加適當(dāng)?shù)拿缸饔糜诩?xì)胞，使細(xì)胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中，使細(xì)胞破裂。2.酶的提取◆酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^程。也稱為酶的抽提。◆酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機溶劑提取。2.1酶提取的主要方法表4-2酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶2.2影響酶提取的主要因素◆主要影響因素是酶在所使用的溶劑中的溶解度以及酶向溶劑相中擴散的速度。◆此外，還受到溫度、pH值、提取液體積等提取條件的影響。(1)溫度：提取時的溫度對酶的提取效果有明顯影響。一般說來，適當(dāng)提高溫度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的擴散速度。(2)pH值：溶液的pH值對酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響。為了提高酶的溶解度，提取時pH值應(yīng)該避開酶的等電點。(3)提取液的體積：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是過量的提取液，會使酶的濃度降低，對進(jìn)一步的分離純化不利。所以提取液的總量一般為原料體積的3～5倍，最好分幾次提取。此外，在酶的提取過程中，含酶原料的顆粒體積越小，則擴散面積越大，有利于提高擴散速度；適當(dāng)?shù)臄嚢杩梢允固崛∫褐械拿阜肿友杆匐x開原料顆粒表面，從而增大兩相界面的濃度差，有利于提高擴散速率；適當(dāng)延長提取時間，可以使更多的酶溶解出來，直至達(dá)到平衡。在提取過程中，為了提高酶的穩(wěn)定性，免致在引起酶的變性失活，可適當(dāng)加入某些保護(hù)劑。如酶作用的底物、輔酶、某些抗氧化劑等。3.沉淀分離◆沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。◆沉淀分離是酶的分離純化過程中經(jīng)常采用的方法?！舫恋矸蛛x的方法主要有鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法、選擇性變性沉淀法等。表4-3沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離3.1鹽析沉淀法◆鹽析沉淀法簡稱鹽析法，是利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離的過程。鹽蛋白質(zhì)在水中的溶解度受到溶液中鹽濃度的影響?！粢话阍诘望}濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。◆而在鹽濃度升高到一定濃度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。◆鹽之所以會改變蛋白質(zhì)的溶解度，是由于鹽在溶液中離解為正離子和負(fù)離子。由于反離子作用，使蛋白質(zhì)分子表面的電荷改變，同時由于離子的存在改變了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改變。◆酶在溶液中的溶解度與溶液的離子強度關(guān)系密切。它們之間的關(guān)系可用下式表示：SLog＝-KsIS0式中，S：酶或蛋白質(zhì)在離子強度為I時的溶解度（g/L）S0：酶或蛋白質(zhì)在離子強度為0時（即在純?nèi)軇┲校┑娜芙舛龋╣/L）Ks：鹽析系數(shù)I：離子強度在溫度和pH值一定的條件下，S0為一常數(shù)。所以上式可以改寫為：LogS=LogS0-KsI=β-KsI式中，β=LogS0，主要決定于酶或蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溫度和pH值有關(guān)。當(dāng)溫度和pH值一定時，β為一常數(shù)。Ks為鹽析系數(shù)，主要決定于鹽的性質(zhì)。Ks的大小與離子價數(shù)成正比、與離子半徑和溶液的介電常數(shù)成反比，也與酶或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)?！綦x子強度I是指溶液中離子強弱的程度，與離子濃度和離子價數(shù)有關(guān)。即：1I=—∑miZi2式中，mi：離子強度（mol/L）Zi：離子價數(shù)◆對于含有多種酶或蛋白質(zhì)的混合液，可以采用分段鹽析的方法進(jìn)行分離純化。

在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；

而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為β分段鹽析?！粼诘鞍踪|(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用?！粼邴}析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。飽和度是指溶液中加入的飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積之比值。3.2等電點沉淀法◆利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為等電點沉淀法。◆由于在等電點時兩性電解質(zhì)分子表面的水化膜仍然存在,在實際使用時，等電點沉淀法往往與其它方法一起使用?！粼诩铀峄蚣訅A調(diào)節(jié)pH值的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加進(jìn)，以防止局部過酸或過堿而引起的酶變性失活。3.3有機溶劑沉淀法◆利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為有機溶劑沉淀法?！粲袡C溶劑之所以能使酶沉淀析出是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低?！舫Ｓ糜诿傅某恋矸蛛x的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。有機溶劑的用量一般為酶液體積的2倍左右，不同的酶和使用不同的有機溶劑時，有機溶劑的使用濃度有所不同?！粲袡C溶劑沉淀法的分離效果受到溶液pH值的影響，一般應(yīng)將酶液的pH值調(diào)節(jié)到欲分離酶的等電點附近。3.4復(fù)合沉淀法◆在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為復(fù)合沉淀法?！舫Ｓ玫膹?fù)合沉淀劑有單寧、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。3.5選擇性變性沉淀法◆選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，這種分離方法稱為選擇性變性沉淀法?！舾鶕?jù)酶和所含雜質(zhì)的特性，通過加熱或改變pH值或加進(jìn)某些金屬離子等使雜蛋白變性沉淀而除去?！粼趹?yīng)用該法之前，必須對欲分離的酶以及酶液中的雜蛋白等雜質(zhì)的種類，含量及其物理、化學(xué)性質(zhì)有比較全面的了解。4.離心分離◆離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程?！粼陔x心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。4.1離心機的選擇◆離心機通常按照離心機的最大轉(zhuǎn)速的不同進(jìn)行分類，可以分為常速（低速）離心機、高速離心機和超速離心機3種。

常速離心機（低速離心機）：最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1×104×g以下。主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。

高速離心機（設(shè)有冷凍裝置）：最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對離心力達(dá)到1×104～1×105×g。主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。

超速離心機：最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.5～12)×104r/min，相對離心力可以高達(dá)5×105×g甚至更高。主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。4.2離心方法的選用◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達(dá)到分離效果；◆如果希望從樣品液中分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，需要采用差速離心方法。◆而對于超速離心，則可以根據(jù)需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。4.2.1差速離心：◆差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。4.2.2密度梯度離心：◆密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法?！魹榱耸钩两迪禂?shù)比較接近的顆粒得以分離，必須配制好適宜的密度梯度系統(tǒng)。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成的。這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)?！舫Ｓ玫奶荻冉橘|(zhì)有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其適用范圍是：蔗糖濃度5～60%，密度范圍1.02～1.30g/cm2。◆密度梯度一般采用密度梯度混合器進(jìn)行制備。制備得到的密度梯度可以分為線性梯度、凹形梯度和凸形梯度等(圖4-1)?！裘芏忍荻然旌掀饔少A液室、混合室、電磁攪拌器和閥門等組成，如圖4-2所示。BABABAabc圖4-1三種梯度形式示意圖a:線性梯度b:凸形梯度c:凹形梯度BACabC圖4-2梯度混合器示意圖A:混合室B:貯液室C電磁攪拌器閥門C◆離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。4.2.3等密梯度離心：◆當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏巷h浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區(qū)帶。這種方法稱為等密梯度離心，或稱為平衡等密度離心。◆等密梯度離心常用的離心介質(zhì)是銫鹽，如氯化銫（CsCl）、硫酸銫（Cs2SO4）、溴化銫（CsBr）等。有時也可以采用三碘苯的衍生物作為離心介質(zhì)。4.3離心條件的確定◆選擇好離心力（或離心速度）和離心時間。4.3.1離心力：◆低速離心一般可以用離心速度，即轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示。如5000r/min等。◆在高速離心，特別是超速離心時，往往以相對離心力（RCF）表示。如60000×g等。◆相對離心力是指顆粒所受到的離心力與地心引力之比值。即：FcRCF=——=1.12×10-5·n2·rFg式中:RCF:相對離心力(×g)Fc：離心力Fg：地心引力n:轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)r:旋轉(zhuǎn)半徑(cm)4.3.2離心時間：◆對于常速離心、高速離心和差速離心來說，離心時間是指顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到離心管底的時間，稱為沉降時間或澄清時間；◆對于密度梯度離心而言，離心時間是指形成界限分明的區(qū)帶的時間，稱為區(qū)帶形成時間；◆等密梯度離心所需的離心時間是指顆粒完全達(dá)到等密度點的平衡時間，稱為平衡時間。◆最常用到的是沉降時間。沉降時間是指顆粒從樣品液面完全沉降到離心管底所需的時間。沉降時間決定于顆粒的沉降速度和沉降距離。對于已經(jīng)知道沉降系數(shù)的顆粒，其沉降時間可以用下列公式計算：1lnr2-lnr1t=—（）Sω2式中，t：沉降時間（s）S：顆粒的沉降系數(shù)（s）ω：轉(zhuǎn)子角速度（rad/s）r1，r2：分別為旋轉(zhuǎn)軸中心到樣品液液面和離心管底的距離（cm）上式中括號中部分可以用轉(zhuǎn)子因子K表示。即：lnr2-lnr1K=（）=Stω2轉(zhuǎn)子的效率因子K與轉(zhuǎn)子的半徑和轉(zhuǎn)速有關(guān)。生產(chǎn)廠家已經(jīng)在轉(zhuǎn)子出廠時表示出了最大轉(zhuǎn)速式的K值。據(jù)此，可以根據(jù)公式ω12K1=ω22K2計算出其他轉(zhuǎn)速式的K值。對于某一具體的顆粒來說，沉降系數(shù)S為定值，所以K值越小，其沉降時間就越短，轉(zhuǎn)子的使用效率就越高。4.3.3溫度和pH值：◆離心溫度一般控制在4℃◆離心介質(zhì)的pH值必須是處于酶穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，必要時可以采用緩沖溶液。5.過濾與膜分離◆過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程?！暨^濾介質(zhì)常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等。◆根據(jù)過濾介質(zhì)的不同,過濾可以分為膜過濾和非膜過濾兩大類?！舾鶕?jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同，過濾可以分為粗濾、微濾、超濾和反滲透等4大類。它們的主要特性如表4-4所示。表4-4過濾的分類及其特性類別截留的顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜5.1非膜過濾◆采用高分子膜以外的材料,如濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)稱為非膜過濾。包括粗濾和部分微濾。5.1.1粗濾：◆借助于過濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于2μm的大顆粒，使固形物與液體分離的技術(shù)稱為粗濾。通常所說的過濾就是指粗濾而言。◆粗濾主要用于分離酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、培養(yǎng)基殘渣及其它大顆粒固形物?！舸譃V所使用的過濾介質(zhì)主要有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等。◆為了加快過濾速度，提高分離效果，經(jīng)常需要添加助濾劑。常用的助濾劑有硅藻土、活性炭、紙粕等?！舾鶕?jù)推動力的產(chǎn)生條件不同，過濾有常壓過濾，加壓過濾，減壓過濾等3種。(1)常壓過濾:以液位差為推動力的過濾。◆實驗室常用的濾紙過濾以及生產(chǎn)中使用的吊籃或吊袋過濾都屬于常壓過濾。(2)加壓過濾:以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為推動力。◆生產(chǎn)中常用各式壓濾機進(jìn)行加壓過濾?！籼砑又鸀V劑、降低懸浮液粘度、適當(dāng)提高溫度等措施，均有利于加快過濾速度和提高分離效果。(3)減壓過濾:又稱為真空過濾或抽濾，是通過在過濾介質(zhì)的下方抽真空的方法，以增加過濾介質(zhì)上下方之間的壓力差，推動液體通過過濾介質(zhì)，而把大顆粒截留的過濾方法◆實驗室常用的抽濾瓶和生產(chǎn)中使用的各種真空抽濾機均屬于此類?！魷p壓過濾需要配備有抽真空系統(tǒng)。由于壓力差最高不超過0.1MPa，多用于粘性不大的物料的過濾。5.1.2微濾:◆微濾又稱為微孔過濾。微濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒直徑為0.2～2μm，主要用于細(xì)菌、灰塵等光學(xué)顯微鏡可以看到的物質(zhì)顆粒的分離?！舴悄のV一般采用微孔陶瓷、燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)。也可采用微濾膜為過濾介質(zhì)進(jìn)行膜分離。5.2膜分離技術(shù)◆借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)?！裟し蛛x所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等?！舾鶕?jù)物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^薄膜的原理和推動力的不同，膜分離可以分為3大類。(1)加壓膜分離:以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動力的膜分離技術(shù)。在靜壓差的作用下，小于孔徑的物質(zhì)顆粒穿過膜孔，而大于孔徑的顆粒被截留。

根據(jù)所截留的物質(zhì)顆粒的大小不同，加壓膜分離可分為微濾、超濾和反滲透等3種。①微濾：以微濾膜（也可以用非膜材料）作為過濾介質(zhì)的膜分離技術(shù)。微濾膜所截留的顆粒直徑為0.2～2μm。微濾過程所使用的操作壓力一般在0.1MPa以下。

在實驗室和生產(chǎn)中通常利用微濾技術(shù)除去細(xì)菌等微生物，達(dá)到無菌的目的。②超濾：超濾又稱超過濾。是借助于超濾膜將不同大小的物質(zhì)顆粒或分子分離的技術(shù)。超濾膜截留的顆粒直徑為20～2000?。相當(dāng)于分子質(zhì)量為1×103～5×105道爾頓。

主要用于分離病毒和各種生物大分子。

膜的透過性一般以流率表示。流率是指每平方厘米的膜每分鐘透過的流體的量。超濾時流率一般為0.01～5.0mL/cm2?min。膜的孔徑大，流率也大。

影響流率的主要因素是膜孔徑的大小。此外，顆粒的形狀與大小，溶液濃度，操作壓力，溫度和攪拌等條件對超濾流率也有顯著影響。

在酶的超濾分離過程中，壓力一般由壓縮氣體來維持，操作壓力一般控制在0.1～0.7MPa。③反滲透：反滲透膜的孔徑小于20?，被截留的物質(zhì)分子質(zhì)量小于1000道爾頓。操作壓力為0.7～13MPa。

主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)。(2)電場膜分離◆電場膜分離是在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。在電場作用下，小分子的帶電物質(zhì)或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動，透過半透膜，而達(dá)到分離的目的?！綦姖B析和離子交換膜電滲析即屬于此類。①電滲析：◆滲析時要控制好電壓和電流強度，滲析開始的一段時間，由于中心室溶液的的離子濃度較高，電壓可低些。當(dāng)中心室的離子濃度較低時，要適當(dāng)提高電壓。◆電滲析主要用于酶液或其它溶液的脫鹽、海水淡化、純水制備以及其它帶電荷小分子的分離。也可以將凝膠電泳后的含有蛋白質(zhì)或核酸等的凝膠切開，置于中心室，經(jīng)過電滲析，使帶電荷的大分子從凝膠中分離出來。離子交換膜電滲析：◆離子交換膜電滲析的裝置與一般電滲析相同。只是以離子交換膜代替一般的半透膜而組成。◆離子交換膜的選擇透過性比一般半透膜強?！綦x子交換電滲析在酶液脫鹽、海水淡化、以及從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸等帶有電荷的小分子發(fā)酵產(chǎn)物等。(3)擴散膜分離◆擴散膜分離是利用小分子物質(zhì)的擴散作用，不斷透過半透膜擴散到膜外。而大分子被截留，從而達(dá)到分離效果。常見的透析就是屬于擴散膜分離?！敉肝瞿た捎脛游锬?、羊皮紙、火棉膠或賽璐玢等制成?！敉肝鲋饕糜诿傅壬锎蠓肿拥姆蛛x純化，從中除去無機鹽等小分子物質(zhì)。6.層析分離◆層析分離是利用混合液中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同比例分布在兩相中。◆其中一個相是固定的稱為固定相，另一個相是流動的，稱為流動相?！舢?dāng)流動相流經(jīng)固定相時，各組分以不同的速度移動，從而使不同的組分分離純化?！舴蛛x純化酶采用的層析方法常用的有吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析等，如表4-5所示。 表4-5層析分離方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離6.1吸附層析6.1.1吸附層析原理：◆任何兩個相之間都可以形成一個界面，其中一個相中的物質(zhì)在兩相界面上的密集現(xiàn)象稱為吸附?！舴彩悄軌?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)稱為吸附劑。吸附劑一般是固體或者液體，在吸附層析中通常應(yīng)用的是固體吸附劑?！艄腆w物質(zhì)之所以具有吸附作用，是由于固體表面的分子（原子或離子）與固體內(nèi)部的分子所受到的作用力不相同?！裟芫奂谖絼┍砻娴奈镔|(zhì)稱為被吸附物。◆吸附劑與被吸附物之間的相互作用力主要是范德華力。其特點是可逆的。即在一定條件下，被吸附物被吸附到吸附劑的表面上；而在另外的某種條件下，被吸附物可以離開吸附劑表面，這稱之為解吸作用。◆吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。◆層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫?！粼谙疵摃r，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。◆移動距離的長短與吸附劑對該物質(zhì)的吸附力以及洗脫擠兌該物質(zhì)的洗脫能力有關(guān)。6.1.2◆為溶劑洗脫法，置換洗脫法和前緣洗脫法等。①溶劑洗脫法：采用單一或者混合的溶劑進(jìn)行洗脫的方法，是目前應(yīng)用最廣泛的方法。洗脫曲線（圖4-3）。物質(zhì)濃度物質(zhì)濃度洗脫液體積圖4-3溶劑洗脫法的洗脫曲線②置換洗脫法：又稱為置換法或取代法。所用的洗脫劑是置換洗脫液。階梯式的洗脫曲線（圖4-4）。物物質(zhì) 質(zhì)濃濃度度BA+B+CA+BAA洗脫液體積洗脫液體積圖4-4置換洗脫法洗脫曲線圖4-5前緣洗脫法洗脫曲線③前緣洗脫法：又稱為前緣分析法，是連續(xù)向吸附層析柱內(nèi)加入欲分離的混合溶液，即所用的洗脫液為含有各組分的混合溶液本身。洗脫曲線如圖4-5所示。6.1.3①吸附劑的選擇：吸附層析的關(guān)鍵因素。目前尚無固定的法則可循。在實際應(yīng)用過程中，可以根據(jù)前人的經(jīng)驗或者通過小樣試驗來確定?！魳O性物質(zhì)容易被極性表面吸附；非極性物質(zhì)容易被非極性表面吸附；溶液中溶解度越大的物質(zhì)越難被吸附。◆無機吸附劑和有機吸附劑。吸附劑通常由一些化學(xué)性質(zhì)不活潑的多孔材料制成，比表面積很大。◆常用吸附劑包括：硅膠、活性炭、磷酸鈣、碳酸鹽、氧化鋁、硅藻土、泡沸石、陶土、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖、瓊脂糖、菊糖、纖維素等。此外，還可以在吸附劑上連接親和基團(tuán)而制成親和吸附劑?！敉ǔＳ糜诿傅姆蛛x純化的吸附劑有硅藻土、氧化鋁、磷酸鈣、羥基磷灰石和活性炭等。②洗脫劑的選擇：將目的物從吸附劑上洗脫下來，要根據(jù)吸附劑的性質(zhì)和被吸附物的特點來選擇合適的洗脫劑?！魧τ跇O性組分，用極性大的溶劑洗脫效果較好。◆而對于非極性組分，則用非極性溶劑洗脫較佳?！粝疵搫┑姆N類有：飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等?！粝疵搫┑倪x擇要注意下列各點：

洗脫劑不會與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，也不會使吸附劑溶解。

洗脫劑對混合液中的各組分的溶解度大，粘度小，流動性好，容易與被洗脫的組分分離。

洗脫劑要求一定的純度，以免雜質(zhì)對分離帶來不利影響。6.4分配層析◆分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法?！舴峙湎禂?shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)，以K表示?！粼诜峙鋵游鲋?，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上?！袅硪环N與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相◆的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。其分配系數(shù)為：固定相中溶質(zhì)的濃度K=流動相中溶質(zhì)的濃度◆由于不同的溶質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度不同，從而達(dá)到分離?！舴峙鋵游鲋饕屑埳蠈游?、分配薄層層洗、分配氣相層析等方法。6.5離子交換層析◆離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法?！綦x子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成?！舭椿钚曰鶊F(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑?！粲捎诿阜肿泳哂袃尚孕再|(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。在溶液的pH值大于酶的等電點時，酶分子帶負(fù)電荷，可用陰離子交換劑進(jìn)行層析分離；當(dāng)溶液pH值小于酶的等電點時，酶分子帶正電荷，則要采用陽離子交換劑進(jìn)行分離?！舭茨阁w物質(zhì)種類的不同，離子交換劑有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。其中某些大孔徑的離子交換樹脂，離子交換纖維素和離子交換凝膠可用于酶的分離純化?！粼谝欢l件下，某種組分離子在離子交換劑上的濃度與在溶液中的濃度達(dá)到平衡時，兩者濃度的比值K稱為平衡常數(shù)（也叫分配系數(shù)）。即：組分離子在離子交換劑上的濃度（mol/g）K=組分離子在溶液中的濃度（mol/mL）平衡常數(shù)K是離子交換劑上的活性基團(tuán)與組分離子之間親和力大小的指標(biāo)。(1)離子交換劑的選擇與處理(2)離子交換層析的操作過程：裝柱、上柱、洗脫和收集、再生6.6凝膠層析◆凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。6.6.1◆凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，各組分在層析柱內(nèi)同時進(jìn)行兩種不同的運動。◆一種是隨著溶液流動而進(jìn)行的垂直向下的移動，另一種是無定向的分子擴散運動（布朗運動）?！舸蠓肿游镔|(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱?！糨^小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的?！魹榱硕康睾饬炕旌弦褐懈鹘M分的流出順序，常常采用分配系數(shù)Ka來量度。Ve-VoKa=VI式中，Ve：洗脫體積，表示某一組分從加進(jìn)層析柱到最高峰出現(xiàn)時，所需的洗脫液體積；Vo：外體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆?？障吨g的體積；VI：內(nèi)體積，即為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積。如果某組分的分配系數(shù)Ka=0，即Ve=Vo，說明該組分完全不能進(jìn)入凝膠微孔，洗脫是最先流出；如果某組分的分配系數(shù)Ka=1，即Ve=Vo+VI，說明該組分可以自由地擴散進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部的所有微孔，洗脫是最后流出；如果某組分的分配系數(shù)Ka在0～1，說明該組分分子大小介乎大分子和小分子之間，可以進(jìn)入凝膠的微孔，但是擴散速度較慢，洗脫時按照Ka值由小到大的順序先后流出。酶、右旋糖酐、球蛋白等，都有其各自特定的選擇曲線（如圖4-6所示）。Kav1.0。··。·0.5?！?。3.54.04.55.05.56.0logM圖4-6球蛋白的選擇曲線葡聚糖凝膠G200葡聚糖凝膠G1006.6.2凝膠的選擇與處理：◆凝膠材料主要有葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等?！魧游鲇玫奈⒖啄z是由凝膠材料與交聯(lián)劑交聯(lián)聚合而成。交聯(lián)劑加得越多，載體顆粒的孔徑就越小。所使用的交聯(lián)劑有環(huán)氧氯丙烷等。葡聚糖凝膠：一般由相對分子質(zhì)量4×104～20×104的葡聚糖為單體，以1，2-環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，交聯(lián)聚合而成。商品名有多種。如Sephadex等。葡聚糖凝膠具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，在堿性條件下非常穩(wěn)定，在0.01mol/L的鹽酸中放置半年不受影響,可以耐受120℃瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠：瓊脂凝膠是一種天然多孔凝膠，其內(nèi)部孔徑較大，允許較大的分子進(jìn)出，因此其用作凝膠層析時的工作范圍大于聚丙烯酰胺凝膠和葡聚糖凝膠。聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺（CH2＝CH-CONH2）與甲叉雙丙烯酰胺（CH2＝CH-CONH-CH2-NHCO-CH＝CH2）共聚而成。商品名稱有多種，如生物膠-P（Bio-gelP）等。聚丙烯酰胺是一種惰性凝膠，適合于各種酶、蛋白質(zhì)、核酸等的分離純化。缺點是遇強酸時，會使其中的酰胺鍵水解而使結(jié)構(gòu)破壞。一般在pH2～11的范圍內(nèi)使用?！暨x擇凝膠主要是依據(jù)欲分離組分的分子質(zhì)量的大小。6.6.3凝膠層析操作過程：凝膠層析的操作一般包括裝柱、上柱、洗脫等過程。6.7.親和層析◆親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對?！粲捎谏锎蠓肿雍团浠g的結(jié)合是專一性的，故選擇性非常好。親和層析技術(shù)的特點是可減少提純步驟。6.7.◆在親和層析中,作為固定相的一方稱為配基(Ligand).配基必須偶聯(lián)于不溶性母體(Matrix)上.母體又稱為載體或擔(dān)體.◆在親和層析中,一般采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠或纖維素等作為母體.當(dāng)小分子物質(zhì)(金屬離子等無機輔助因子、有機輔助因子等)作為配基時，由于空間位阻作用，難以與配對的大分子親和吻合，需要在母體與配基之間引入適當(dāng)長度的連接臂（spacearm）?！粢共蝗苄阅阁w與配基偶聯(lián)或通過連接臂與配基偶聯(lián)，都必須進(jìn)行母體活化。即通過某種方法，如溴化氰法、疊氮法、高碘酸氧化法、環(huán)氧化法、甲苯磺酰氯法、雙功能試劑法等，使母體引入某種活潑基團(tuán)，才能以共價鍵與配基偶聯(lián)。6.7.2根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為共價親和層析，疏水層析，金屬離子親和層析，免疫親和層析，染料親和層析，凝集素親和層析等。（1）共價親和層析(CovalentAffinityChromatography)(2）疏水層析(HydrophobicChromatography)（3）金屬離子親和層析(MetalIonAffinityChromatography,)（4）免疫親和層析(5)染料親和層析(6)凝集素(Lectin)親和層析6.8.層析聚焦◆層析聚焦(chromatofocusing)是將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離的技術(shù)?！粼趯游鱿到y(tǒng)中，柱內(nèi)裝上多緩沖離子交換劑，當(dāng)加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體的多緩沖溶液流過層析柱時，在層析柱內(nèi)形成穩(wěn)定的pH梯度。欲分離酶液中的各個組分在此系統(tǒng)中會移動到(聚焦于)與其等電點相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點的組分得以分離。7.電泳分離◆帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳?！舭雌涫褂玫闹С煮w的不同，可以分為紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、自由電泳和等電聚焦電泳等?！纛w粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。（1）電場強度：電場強度是指每厘米距離的電壓降。又稱為電位梯度或電勢梯度。電場強度對顆粒的泳動速度起著十分重要的作用?！舾鶕?jù)電場強度的大小可將電泳分為高壓電泳和常壓電泳。常壓電泳的電場強度一般為2～10V/cm,電壓為100～500V,電泳時間從幾十分鐘到幾十小時,多用于帶電荷的大分子物質(zhì)的分離;高壓電泳的電場強度為20～200V/cm,電壓大于500V,電泳時間從幾分鐘到幾小時,多用于帶電荷的小分子物質(zhì)的分離.（2）溶液的pH值:溶液的pH值決定了溶液中顆粒分子的解離程度,也就是決定了顆粒分子所帶凈電荷的多少.◆對于兩性電解質(zhì)而言,溶液的pH值,不僅決定顆粒分子所帶電荷的種類.而且決定凈電荷的數(shù)量.電泳時,溶液的pH值應(yīng)該選擇在適當(dāng)?shù)臄?shù)值,并需采用緩沖液,使pH值維持恒定.（3）溶液的離子強度:溶液的離子強度越高,顆粒的泳動速度越慢.一般電泳溶液的離子強度為0.02～0.2較為適宜.（4）電滲:在電場中,溶液對于固體支持物的相對移動稱為電滲.◆在酶學(xué)研究中，電泳技術(shù)主要用于酶的純度鑒定、酶分子量測定、酶等電點測定以及少量酶的分離純化?！糁饕捎玫碾娪炯夹g(shù)有紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳和等電聚焦電泳等。8.萃取分離◆萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。◆萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相?！舭凑諆上嗟慕M成不同，萃取可以分為有機溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取和反膠束萃取等。8.1有機溶劑萃取◆用于萃取的有機溶劑主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。例如，用丁醇萃取微粒體或線粒體中的酶；用苯酚萃取RNA等?！粲捎谟袡C溶劑容易引起酶蛋白和酶RNA的變性失活，所以在酶的萃取過程中，應(yīng)在0－10℃8.2雙水相萃取◆雙水相萃取的兩相分別為互不相溶的兩個水相。◆雙水相萃取中使用的雙水相一般由按一定百分比組成的互不相溶的鹽溶液和高分子溶液或者兩種互不相溶的高分子溶液組成?！粼陔p水相系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)、RNA等在兩相中的溶解度不一樣，分配系數(shù)不同，從而達(dá)到分離。表4-8各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉雙水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖表示，對于兩種聚合物和水相組成的系統(tǒng)，其相圖如圖4-8所示。聚Ｔ合物QT'或。Ｍ鹽(%)C·BB’聚合物P(%)圖4-8雙水相系統(tǒng)相圖從圖中可以看到，只有當(dāng)P和Q的濃度達(dá)到一定時才能形成兩相，◆影響酶在兩相中分配系數(shù)的主要因素有：(1)兩相的組成，（2）高分子聚合物的分子量、濃度，極性等，（3）兩相溶液的比例，（4）酶的分子量、電荷、極性等，（5）溫度、pH值等。對于酶在兩相中的分配系數(shù)，目前尚無成熟的理論可作為依據(jù)，需通過試驗而確定。8.3超臨界萃取◆超臨界萃取又稱為超臨界流體萃取，是利TGSCF用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。L◆不同的溫度和壓力條件下，可以以不同的形態(tài)存在，如固體(S)、液體(L)、氣體(G)、超臨界流體(SCF)等。如圖4-9所示：SP圖4-9超臨界系統(tǒng)相◆作為萃取劑的超臨界流體必須具有以下條件：◆目前在超臨界萃取中最常用的超臨界流體是CO2。二氧化碳超臨界點的溫度為31.1℃，超臨界壓力為7.3MPa，超臨界密度為0.47g◆CO2超臨界萃取的工藝過程由萃取和分離兩個步驟組成。

萃取在萃取罐中進(jìn)行，將原料裝入萃取罐，通入一定溫度和壓力的超臨界CO2,將欲分離的組分萃取出來。

分離在分離罐中進(jìn)行，是將目的物與超臨界CO2分離的過程。根據(jù)分離方法的不同，分離工藝過程可以分為3種:等壓分離、等溫分離、3，吸附分離：8.4反膠束萃取：◆反膠束萃取是利用反膠束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來的一種分離純化技術(shù)。

反膠束，又稱為反膠團(tuán)，是表面活性劑分散于連續(xù)有機相中形成的納米尺度的一種聚集體。反膠束溶液是透明的，熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。(1)膠束與反膠束的形成：將表面活性劑溶于水中，并使其濃度超過臨界膠束濃度（即膠束形成時所需表面活性劑的最低濃度），表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起而形成聚集體。

通常將在水溶液中形成的聚集體膠束，稱為正膠束。

如果將表面活性劑溶于非極性溶劑中，并使其濃度超過臨界膠束濃度，便會在有機溶劑內(nèi)形成聚集體，這種聚集體稱為反膠束。

反膠束系統(tǒng)作為液—液萃取方法，更具有選擇性。其基本過程是：首先在酶蛋白相轉(zhuǎn)移最佳的條件下，將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步，在最佳條件下，將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相的，即將酶從有機相中提取出來。表4-10反膠束萃取中常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機溶劑表面活性劑有機溶劑AOT正烷烴(C6~C10)，異辛烷，環(huán)己烷，四氯化碳，苯CTAB乙醇/異辛烷，己醇/辛烷，三氯甲烷/辛烷TOMAC環(huán)己烷Brij60辛烷TritonX己醇/環(huán)己烷磷脂酰膽堿苯，庚烷磷脂酰乙醇胺苯，庚烷

最常用的是陰離子表面活性劑。如，AOT(AerosolOT)，其化學(xué)名為丁二酸乙基己基酯磺酸鈉。(2)水相pH：水相pH決定了蛋白質(zhì)表面帶電基團(tuán)的離子化狀態(tài)