HACCP系統(tǒng)與安檢課件

HACCP系統(tǒng)與微生物快速檢測技術(shù)史賢明華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技系，武漢430070

HACCP系統(tǒng)與微生物快速檢測技術(shù)史賢明1

一、食品安全控制方法的發(fā)展歷史二、食品安全控制體系三、HACCP系統(tǒng)四、微生物快速自動檢測技術(shù)一、食品安全控制方法的發(fā)展歷史2一.食品安全控制方法的發(fā)展歷史1.遠古時代——火烤食物2.古代——干燥、煙熏、地窖（低溫）3.幾千年前——發(fā)酵、腌制4.巴士德時代以后——巴士德殺菌法、罐頭和冰箱的利用5.近代——防腐劑、保鮮劑6.現(xiàn)代控制體系——GMP、ISO系統(tǒng)、HACCP一.食品安全控制方法的發(fā)展歷史1.遠古時代——火烤食物3

二、食品安全控制體系（1）GMP

1963，F(xiàn)DA——藥品GMP1969，WHO——要求成員國實施藥品GMP1969，USA——CGMP隨后，CAC采納CGMPGMP宗旨：條件、環(huán)境、設(shè)施、人員操作符合規(guī)范GMP重點：生產(chǎn)過程、防止污染、雙重檢驗、標(biāo)簽、記錄、檔案二、食品安全控制體系4

（2）ISO系統(tǒng)1970——ISO認證委員會（合格評定委員會——CASCO）1980——質(zhì)量管理和保證技術(shù)委員會1986——ISO84021987——ISO900090多個國家，14萬以上企業(yè)采用

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（3）HACCPHazardAnalysisandCriticalControlPoint危容分析與關(guān)鍵控制點包括七項基本原則（3）HACCP6三.HACCP系統(tǒng)（一）HACCP的形成過程（二）相關(guān)定義（三）HACCP的七要素（原則）（四）HACCP系統(tǒng)的特點（五）對HACCP的評價三.HACCP系統(tǒng)（一）HACCP的形成過程7（一）HACCP的形成過程1960Pillsbury公司HowardBauman博士提出概念1971美國食品保護協(xié)會公布HACCP梗概1973Pillsbury公司培訓(xùn)FDA人員1985美國科學(xué)院肯定HACCP1988HACCP專著出版1989美國食品的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)顧問委員會批準(zhǔn)HACCP標(biāo)準(zhǔn)版本1992修訂1992年后兩種HACCP法規(guī)出臺：FDA——魚、水產(chǎn)品USDA——肉、禽產(chǎn)品SSOP——HACCP的基石（一）HACCP的形成過程1960Pillsbury8

（二）相關(guān)定義

1．關(guān)鍵控制點確定程序（CCPDecisionTree）：

決定某個控制點是否是關(guān)鍵控制點的一系列問題。

2．連續(xù)監(jiān)控（ContinuousMonitoring）：

不間斷地收集數(shù)據(jù)（如溫度）并將其記錄在圖形上。

3．控制（Control）：

（a）控制操作條件使之遵循已建立的標(biāo)準(zhǔn)；

（b）對照。描述正確的步驟已經(jīng)維持且標(biāo)準(zhǔn)已達到的狀況。

4．控制點（ControlPoint）：

生物、物理或化學(xué)因素需要進行控制的任何點，步驟，或程序。

（二）相關(guān)定義

1．關(guān)鍵控制點確定程序（CCP95.糾偏措施（CorrectiveAction）：

當(dāng)偏差出現(xiàn)時應(yīng)遵循的程序。

6.標(biāo)準(zhǔn)（Criterion）：

作決定或判斷時所依據(jù)的參數(shù)。

7.關(guān)鍵控制點（CriticalControlPoint,CCP）：

食品加工的某操作點、某步驟或某方法，在這些點上可以實施控制，最終使食品安全危害因子得到防止、消除或降低到可接受的水平。

8.臨界偏離（CriticalDefect）：

可能會導(dǎo)致危害發(fā)生的關(guān)鍵控制點的偏離。

5.糾偏措施（CorrectiveAction）：

109.臨界極限（CriticalLimit）：

所有同關(guān)鍵控制點相關(guān)的預(yù)防措施都必需滿足的一種標(biāo)準(zhǔn)。

10.偏差（Deviation）：

偏離臨界極限的狀況。

11. HACCP計劃（HACCPPlan）：

基于HACCP原則所建立的一套文件，描述了確保對某一特定步驟或過程進行控制的一系列程序。

12. HACCP系統(tǒng)（HACCPSystem）：

執(zhí)行HACCP計劃的一系列過程和方案。

9.臨界極限（CriticalLimit）：

1113.HACCP小組（HACCPTeam）：

負責(zé)起草和建立HACCP計劃并執(zhí)行的一群人。

14.HACCP計劃的審查（HACCPPlanValidation）：

HACCP小組對HACCP計劃的最初的評審，以確定HACCP計劃中的每一組成部分都是準(zhǔn)確無誤的。

15.HACCP計劃的再審查（HACCPPlanRevalidation）：

由HACCP小組定期對HACCP計劃的文件所進行的再審查，目的是要盡可能地完善HACCP計劃。

16.危害（Hazard）：

一種影響食品消費安全的生物、化學(xué)或物理的特性。

13.HACCP小組（HACCPTeam）：

1217.監(jiān)控（Monitor）：

執(zhí)行一系列有計劃的觀察或檢測，以評價某一關(guān)鍵控制點是否在控制中，并可為將來的查證過程提供準(zhǔn)確的記錄。

18.預(yù)防措施（PreventiveMeasure）：

對已經(jīng)確認危害健康的化學(xué)、物理或其他因子所采取的控制辦法。

19.隨機檢測（RandomChecks）：

用作對HACCP計劃所要求的定期評價的補充觀察或檢測，要求避免主觀性。

20.風(fēng)險（Risk）：

對危害發(fā)生可能性的估計。

17.監(jiān)控（Monitor）：

執(zhí)行一系列有計劃1321.敏感性成分（SensitiveIngredient）：

已知同某一危害相關(guān)聯(lián)并值得關(guān)注的成分。

22.嚴重性（Severity）：某一危害的嚴重程度。

23.目標(biāo)水平（TargetLevels）：

比臨界極限更為嚴格的標(biāo)準(zhǔn)，操作者可用來減小發(fā)生偏差的風(fēng)險。

24.查證（Verification）：

為了確定HACCP系統(tǒng)是否遵循HACCP計劃或確定HACCP計劃是否需要完善和再審查，除了監(jiān)控中使用的方法、程序或測試以外，還要使用其他方法、程序和測試加以核實。21.敏感性成分（SensitiveIngredien14

（三）HACCP的七要素（原則）（1）危害分析；（2）關(guān)鍵控制點的識別；（3）各關(guān)鍵控制點臨界極限的確定；（4）建立各關(guān)鍵控制點的監(jiān)測方法和處理監(jiān)測結(jié)果的程序；（5）建立各關(guān)鍵控制點偏離臨界極限時的校正方案；（6）建立HACCP系統(tǒng)的有效記錄檔案制度；（7）建立確認HACCP系統(tǒng)是否運轉(zhuǎn)正常的程序。

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（四）HACCP系統(tǒng)的特點

HACCP——預(yù)防策略——有效、減少損失——全面性、系統(tǒng)化

Farm——Home

生產(chǎn)商、銷售商、消費者、政府部門——嚴格檔案制度——分清責(zé)任——國際公認（四）HACCP系統(tǒng)的特點16

（五）對HACCP的評價美國科學(xué)院——對微生物危害的控制必須采用HACCP系統(tǒng)，對終產(chǎn)品的檢驗不是防止食品傳播疾病的一種有效方法。美國食品的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)顧問委員會——保證食品從原料種植到餐桌的安全的一項有效而又合理的策略。國際食品安全協(xié)會——HACCP系統(tǒng)是保證食品安全與完善的最佳方法。FAO/WHO聯(lián)合食品法典委員會——HACCP是控制由食品引起疾病的最有效方法。（五）對HACCP的評價17

四.微生物快速自動檢測技術(shù)四.微生物快速自動檢測技術(shù)18

（一）微生物快速自動檢測技術(shù)在HACCP系統(tǒng)中的地位

微生物快速自動檢測技術(shù)在科學(xué)研究、工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境保護等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，我國在這一方面還很落后，只對少數(shù)幾項技術(shù)予以了引進和研究，實現(xiàn)了商業(yè)化的技術(shù)甚微。我國加入WTO在即，農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料的安全性日益受到重視，農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料的生產(chǎn)要求逐步按HACCP系統(tǒng)要求對生產(chǎn)——消費的每個可能發(fā)生安全問題的環(huán)節(jié)都要進行微生物檢測。于是，引進、消化和研究微生物快速自動檢測技術(shù)迫在眉睫。（一）微生物快速自動檢測技術(shù)19（二）微生物快速自動檢測技術(shù)類型1.生化反應(yīng)快速檢測試劑盒*API20ERSystem*EnterotubeⅡR*Micro-IDR*MinitekTM*CrystalTMIdentificationSystem*RapIDOneSystem*RapIDTMANAⅡSystem（二）微生物快速自動檢測技術(shù)類型1.生化反應(yīng)快速檢測試劑202.計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)*BiologTM*ATBRIdentification*MicroTeamR3.活細胞計數(shù)檢測*Petrifilm*Redigel*HydrophobicGrid-membraneFiltrationSystem*SpiralAssaySystem2.計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)214.估計微生物數(shù)量的新方法*阻抗測定，如BactometerR系統(tǒng)*電導(dǎo)測定，如MalthusMicrobialAnalyzer系統(tǒng)*生物發(fā)光和ATP酶檢測，如BioluminescenceandATPanalysis4.估計微生物數(shù)量的新方法225.免疫學(xué)方法檢測*Transia卡片檢測法*TECRA系統(tǒng)*VIDAS系統(tǒng)*Biocontrol1-2Test6.分子生物學(xué)方法*ProbeliaTM*BAXR系統(tǒng)*Gene-TrakR5.免疫學(xué)方法檢測23（三）生化反應(yīng)快速檢測試劑盒1.API20ERSystem

是一種基于傳統(tǒng)的腸桿菌科和其他G-細菌生化鑒定方法上的標(biāo)準(zhǔn)化、小型檢測試劑盒。它將23種生化反應(yīng)集中設(shè)計在一個微型管系統(tǒng)中，管內(nèi)裝有脫水反應(yīng)底物和指示劑，接種培養(yǎng)后通過顏色變化呈現(xiàn)陰、陽性結(jié)果。可以在18-24hr內(nèi)鑒定腸桿菌科，18-24hr或38-48hr內(nèi)鑒定其他G-細菌。優(yōu)點：為商業(yè)化產(chǎn)品，簡便易得，數(shù)據(jù)可靠。缺點：接種較費時；塑料板易變形；需有微生物工作經(jīng)驗者分析結(jié)果。（三）生化反應(yīng)快速檢測試劑盒242.EnterotubeⅡR

是一支長形塑料管，包含有分割開的12種不同的培養(yǎng)基和中間的一根接種針。這根針可將單個細菌菌落同時接種于15種標(biāo)準(zhǔn)生化反應(yīng)系統(tǒng)中，結(jié)果可由計算機軟件來分析鑒定。優(yōu)點：接種快速簡單；不需為接種做準(zhǔn)備工作；鑒定時可選用單菌落缺點：只能鑒定氧化酶反應(yīng)陰性的G-菌和腸桿菌科細菌；在培養(yǎng)箱中堆放較困難；因脫水而帶來貨架期縮短2.EnterotubeⅡR253.Micro-IDR

這是一種鑒定腸桿菌科細菌的反應(yīng)盤，由苯乙烯塑造而成，包括15個反應(yīng)小室和一個鉸鏈連接的盒蓋。其中5個反應(yīng)小室中只含有一種混合反應(yīng)底物，其余10個小室中各包含一種混合反應(yīng)底物。通過反應(yīng)的顏色變化來分析結(jié)果。優(yōu)點：準(zhǔn)確，與傳統(tǒng)生化鑒定方法有95%以上的吻合性；快速，在經(jīng)簡單分離后，只需4小時培養(yǎng)即得出結(jié)果；可靠，反應(yīng)底物是包裝在錫箔袋中，保存期長。缺點：僅針對腸桿菌科細菌，尤其是細胞色素氧化酶陰性的G-菌；需微生物工作者讀結(jié)果。3.Micro-IDR264.MinitekTM主要用于實驗室對腸桿菌科和各類G-好氧微生物的輔助鑒定，通常針對那些“非發(fā)酵型細菌”。它是一個由多個小圓盤組成的紙盤，每個小圓盤中盛有不同的生化反應(yīng)底物和指示劑，經(jīng)接種培養(yǎng)后呈現(xiàn)特定顏色反應(yīng)。優(yōu)點：多功能性，當(dāng)將小圓盤內(nèi)的反應(yīng)底物更換一下，就可用來鑒定其他微生物；結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，不易損壞；可在培養(yǎng)箱中簡單的堆放。4.MinitekTM275.CrystalTMIdentificationSystem

是改良的傳統(tǒng)發(fā)色底物制成的小型鑒定體系，主要用于腸桿菌科中典型的好氧G-菌以及人類病原的不發(fā)酵葡萄糖的G-桿菌。該鑒定盤包含有30種干燥的生化酶反應(yīng)底物，當(dāng)加入細菌培養(yǎng)液后底物復(fù)水，培養(yǎng)后指示劑顯色。優(yōu)點：反應(yīng)盤堅固，可以在一個盒中壘放10個；計算機輔助讀結(jié)果；除腸桿菌科細菌外，還可鑒定一些非發(fā)酵型微生物。缺點：只能用棉拭接種；培養(yǎng)箱要保證一定濕度，以防水分揮發(fā)。5.CrystalTMIdentificationSy286.RapID-OneSystem

運用傳統(tǒng)顯色底物來定性鑒定腸桿菌科和一些從人類臨床病樣中分離到的氧化酶陰性、G-

細菌。該系統(tǒng)包含一個反應(yīng)盤和反應(yīng)試劑。反應(yīng)盤是一個塑有很多反應(yīng)孔的一次性塑料板，每個反應(yīng)孔中含有脫水底物，經(jīng)RapID培養(yǎng)液增菌的細菌懸浮液可同時接種于反應(yīng)孔中，結(jié)果可通過計算機數(shù)據(jù)比較。優(yōu)點：在4hr內(nèi)提供結(jié)果；有明顯的顏色反應(yīng)，減少了判斷時的主觀因素；準(zhǔn)確靈敏；只需一步接種。缺點：需要微生物工作者解釋結(jié)果；不同廠家會提供不同的鑒定操作表格。6.RapID-OneSystem29（四）計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)1.BiologTM

利用細菌對95種不同碳源的代謝情況來鑒定菌種。在96微孔板中預(yù)填充并脫水干燥的95種不同碳源，并加入顯色劑。若細菌利用某種碳源，發(fā)生代謝反應(yīng)，則會在某一孔的位置上產(chǎn)生紫色。再通過查詢Biolog數(shù)據(jù)庫，就可得知細菌種類。優(yōu)點：擁有大量菌種數(shù)據(jù)庫，可鑒定2000余種，包括501種G-菌，318種G+菌，363種厭氧菌，267種酵母菌，600種絲狀真菌和45種放線菌，準(zhǔn)確率達95%以上；操作簡便。缺點：接種菌懸液時易失誤（四）計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)302.ATBRIdentification半自動化微生物鑒定系統(tǒng)，包括密度計、自動閱讀機、計算機、自動移樣管、應(yīng)用軟件等部分。每個試驗條含有32個單獨的吸盤，吸盤中含有不同反應(yīng)底物和生化試劑，經(jīng)接種培養(yǎng)后，ATB系統(tǒng)通過對吸盤中混濁度和顏色的變化來分析鑒定菌株，結(jié)果自動輸出。2.ATBRIdentification313.MicroTeamR

這是一種快速自動化微生物鑒定系統(tǒng)，是Bactometer系統(tǒng)和VITEK系統(tǒng)的組合。其中，Bactometer系統(tǒng)可利用阻抗變化來測定微生物活動，從而在6-48hr內(nèi)鑒定多種微生物；而VITEK系統(tǒng)有四部分組成：將一定濃度的菌液真空填充到該系統(tǒng)提供的菌種鑒定試驗卡中的真空填充器、自動為試驗卡封口的封口器、培養(yǎng)此卡可調(diào)溫的培養(yǎng)箱、在培養(yǎng)的同時每小時檢測一次顏色和濁度變化并分析數(shù)據(jù)的計算機。計算機收集每小時的數(shù)據(jù)，由數(shù)據(jù)庫進行分析比較判斷出菌種的種類。3.MicroTeamR32（五）活細胞計數(shù)檢測1.Petrifilm（皿膜系統(tǒng)）這是一張制好的卡片，由兩個粘在一起的塑料薄膜組成，在一邊膜上涂布有培養(yǎng)基成分和溶于冷水的凝膠劑?？蛇M行好氧培養(yǎng)計數(shù)（APCs),也可使用選擇性培養(yǎng)基檢測特殊菌群。在兩薄膜中間滴加1mL的稀釋液，適當(dāng)溫度下48hr左右就可菌落計數(shù)。

（五）活細胞計數(shù)檢測331.Petrifilm（皿膜系統(tǒng)）-II優(yōu)點：通過AOAC等機構(gòu)認證；無須制備培養(yǎng)基，提高了檢測效率；每個膜上都有顏色指示劑，故特定菌落顯示特定顏色，方便計數(shù)；大腸桿菌計數(shù)卡中的大腸桿菌菌落是藍色并伴有氣泡的；無論對于大小實驗室均實用，尤其適合野外測定。缺點：低pH和低濕度的樣品需要另外稀釋。1.Petrifilm（皿膜系統(tǒng)）-II342.Redigel(即用膠系統(tǒng)）此系統(tǒng)具盛有無菌液體培養(yǎng)基的試管，把樣品（譬如1mL食物樣品）傾入該試管中，混勻后再將混合物倒入一個裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中，混合物與膠質(zhì)接觸后便形成與瓊脂相似的復(fù)合物，經(jīng)培養(yǎng)后可計菌數(shù)。優(yōu)點：已包裝好的，無須滅菌；減少了培養(yǎng)基制備過程；應(yīng)用領(lǐng)域多，適合野外測定；此種培養(yǎng)基不會被一些果膠分解菌水解。2.Redigel(即用膠系統(tǒng)）353.HydrophobicGrid-membraneFiltrationSystem（疏水格柵過濾系統(tǒng)）此法中所用的膜為特殊的含有1600個蠟質(zhì)網(wǎng)格的防水膜，每格限制微生物的生長和菌落大小。1mL的樣品處理勻液經(jīng)過此濾膜過濾后，將膜置于瓊脂培養(yǎng)基表面恒溫過夜，用MPN自動計數(shù)。優(yōu)點：受傷細胞可在非選擇性培養(yǎng)基上復(fù)蘇后，再移至選擇性培養(yǎng)基上；能將水中可能影響微生物生長的水溶性物質(zhì)去除；含量很低的微生物菌懸液經(jīng)過濾后濃度加大，便于檢測；每個菌落都是正方形，便于人工或機器計數(shù)。3.HydrophobicGrid-membrane364.SpiralAssaySystem（旋轉(zhuǎn)平板法）

平板中預(yù)注入培養(yǎng)基并凝固，液體接種物經(jīng)特制注射器涂布在此旋轉(zhuǎn)的平板上，散布器從平板中心移至外圍，樣品即被涂布在一條阿基米德線上。注射器不斷增加散布樣品的體積量，使得在一個平板上的濃度范圍達到10000：1。在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，平板中心菌落濃度較高，邊緣較低。通過特殊的格狀計數(shù)器對旋轉(zhuǎn)平板的菌落計數(shù)。優(yōu)點：已通過AOAC認證；所用的瓊脂少；所需培養(yǎng)皿、稀釋液空白、吸管少；每小時可涂布50-60個平板，操作中不需調(diào)試。缺點：食品樣品中的顆?？赡軙棺⑸淦鞯尼橆^堵塞。4.SpiralAssaySystem（旋轉(zhuǎn)平板法）37（六）估計微生物數(shù)量的新方法1.阻抗測定，如BactometerR系統(tǒng)原理：當(dāng)微生物的生長和降解代謝營養(yǎng)物質(zhì)時，液體中的大分子變?yōu)樾》肿?，從而引起液體內(nèi)部阻抗和導(dǎo)電變化。操作過程：樣品經(jīng)過一定的程序處理后裝入隨儀器提供的小室中，在培養(yǎng)的同時測定阻抗的變化，所有測量數(shù)據(jù)由系統(tǒng)中的計算機處理。當(dāng)微生物代謝基質(zhì)并達到105-6細胞/mL時，阻抗積聚增加，檢測屏幕上出現(xiàn)類似生長曲線對數(shù)生長期的斜線，阻抗發(fā)生變化的時間為檢測時間，和樣品中微生物量呈反比。此方法主要用于牛奶、乳制品、肉制品和其它食物中微生物的測定。（六）估計微生物數(shù)量的新方法382.電導(dǎo)測定，如MalthusMicrobialAnalyzer系統(tǒng)與測阻抗類似，該系統(tǒng)是測定電導(dǎo)變化來評估微生物量。優(yōu)點：自動化；對抗原和其它微生物的快速鑒定有高效性；可在一臺儀器上進行多種試驗；細胞可回收利用；操作簡便；可隨時抽樣；容量大，可同時檢測1200種樣品；軟件大眾化，易運行。2.電導(dǎo)測定，如MalthusMicrobialAna393.生物發(fā)光和ATP酶檢測，即BioluminescenceandATPanalysis產(chǎn)品如PocketSwabTM原理：所有生物都含有ATP，當(dāng)螢火蟲熒光素酶系統(tǒng)和ATP接觸時就會發(fā)熒光。發(fā)光量和樣品中的ATP的量成正比，可用熒光計來測量發(fā)光量。優(yōu)點：快速方便，40秒出結(jié)果；可用于衛(wèi)生監(jiān)督和生產(chǎn)線監(jiān)控；能達到傳統(tǒng)方法的全面、復(fù)雜度；產(chǎn)品經(jīng)過ATP試驗后仍可商用。3.生物發(fā)光和ATP酶檢測，即Bioluminescen40（七）免疫學(xué)方法檢測1.Transia卡片檢測法此法以單步免疫反應(yīng)即夾心型免疫色譜反應(yīng)為基礎(chǔ)。反應(yīng)固相包括一塊用“特異性抗體-染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條，抗該種菌的抗體就固定在薄膜的反應(yīng)區(qū)上。增菌后的菌液用移液管加到點樣小孔中并令其吸收，若樣品中存在該種菌的抗原，就會與偶合物作用，然后依次遷移到膜上，與固定在膜上反應(yīng)區(qū)的抗體結(jié)合，在反應(yīng)窗上呈現(xiàn)一條色帶，結(jié)果可在5-7分鐘內(nèi)讀取。（七）免疫學(xué)方法檢測412.TECRA系統(tǒng)原理：Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)

酶聯(lián)免疫分析檢測過程：微量孔中預(yù)先包被有待檢菌的特異性抗體，當(dāng)樣品加入后，若存在此種菌，則會與該抗體結(jié)合而被捕獲，隨后加入酶標(biāo)抗體，就形成了“抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，最后加入顯色劑，在酶作用下呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，若呈現(xiàn)綠色則為陽性，無色則為陰性?？扇庋叟袛?，也可通過微量比色計讀取結(jié)果。2.TECRA系統(tǒng)423.VIDAS系統(tǒng)原理：Enzyme-linkedFluorescentimmunoAssay(ELFA)酶聯(lián)熒光免疫分析操作過程：樣品中的目的檢測物或抗原被固相捕獲，而非特異性抗原則被洗去，特異性抗體和堿性磷酸酶復(fù)合物與固相反應(yīng)并結(jié)合，未結(jié)合上的則被洗去。底物4-甲基-傘形酮就會和這些已結(jié)合在固相上的酶起反應(yīng)而產(chǎn)生熒光，熒光量與結(jié)合在固相上的酶成正比，通過熒光檢測器和計算機處理系統(tǒng)輸出結(jié)果。3.VIDAS系統(tǒng)434.Biocontrol1-2Test是一種檢測有動力沙門氏菌的試劑盒。在一個特殊的含兩個容器的塑料設(shè)備中，一個容器中裝有選擇性半固體培養(yǎng)基，另一個中裝有非選擇性培養(yǎng)基，并含有鞭毛抗體。恒溫培養(yǎng)時，運動性沙門氏菌經(jīng)選擇性培養(yǎng)后進入非選擇性培養(yǎng)基，并與其中的抗體結(jié)合形成免疫帶。優(yōu)點：將血清學(xué)反應(yīng)和生化增菌過程結(jié)合起來；簡便易用，不需特殊實驗室條件；結(jié)果在8-14小時內(nèi)得出。缺點：不能檢測非運動型沙門氏菌免疫條帶的判斷有主觀因素。4.Biocontrol1-2Test44（八）分子生物學(xué)方法1.ProbeliaTM一種特異性快速檢測食品中病原菌的自動化設(shè)備。原理：根據(jù)待測細菌設(shè)計特異DNA引物，與待測細菌內(nèi)相應(yīng)保守序列結(jié)合后進行PCR特異性擴增，擴增產(chǎn)物再和預(yù)先設(shè)計好的過氧化物酶標(biāo)記的分子探針進行分子雜交，結(jié)果通過比色檢測裝置讀出。優(yōu)點：針對保守序列設(shè)計引物和探針，故具有高度特異性；PCR擴增可檢測極低含量菌體，故靈敏度高（八）分子生物學(xué)方法452.BAXR系統(tǒng)

BAX系統(tǒng)利用PCR儀以極快的方法擴增目標(biāo)病原菌的特定DNA片段至可檢測的水平，而其他微生物由于沒有相同的特定DNA片段，因而不能被擴增。所以，BAX系統(tǒng)具有很高的專一性。BAX系統(tǒng)將所有的試劑（引物、聚合酶等）均預(yù)制成一個片狀物放在PCR反應(yīng)試管中，不需要對病原菌DNA進行分離，檢出結(jié)果明確肯定，使得病原菌的檢測和確認一次完成，因此，整個檢測過程快速、準(zhǔn)確、操作簡單。2.BAXR系統(tǒng)463.Gene-TrakR原理：針對被檢微生物的核糖體RNA（rRNA)設(shè)計一段特異寡核苷酸序列，進行特異性雜交。核糖體是細胞蛋白質(zhì)合成器的一部分，每個細胞中存在5000-20000個復(fù)制體，相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2-10個，因此檢測的靈敏度高。而且由于rRNA為單鏈（而DNA為雙鏈），雜交前無須經(jīng)過變性步驟，較快速。要得到陽性結(jié)果，只需105個靶細胞/mL。3.Gene-TrakR47謝謝！

ThankYou!謝謝！

ThankYou!48HACCP系統(tǒng)與微生物快速檢測技術(shù)史賢明華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技系，武漢430070

HACCP系統(tǒng)與微生物快速檢測技術(shù)史賢明49

一、食品安全控制方法的發(fā)展歷史二、食品安全控制體系三、HACCP系統(tǒng)四、微生物快速自動檢測技術(shù)一、食品安全控制方法的發(fā)展歷史50一.食品安全控制方法的發(fā)展歷史1.遠古時代——火烤食物2.古代——干燥、煙熏、地窖（低溫）3.幾千年前——發(fā)酵、腌制4.巴士德時代以后——巴士德殺菌法、罐頭和冰箱的利用5.近代——防腐劑、保鮮劑6.現(xiàn)代控制體系——GMP、ISO系統(tǒng)、HACCP一.食品安全控制方法的發(fā)展歷史1.遠古時代——火烤食物51

二、食品安全控制體系（1）GMP

1963，F(xiàn)DA——藥品GMP1969，WHO——要求成員國實施藥品GMP1969，USA——CGMP隨后，CAC采納CGMPGMP宗旨：條件、環(huán)境、設(shè)施、人員操作符合規(guī)范GMP重點：生產(chǎn)過程、防止污染、雙重檢驗、標(biāo)簽、記錄、檔案二、食品安全控制體系52

（2）ISO系統(tǒng)1970——ISO認證委員會（合格評定委員會——CASCO）1980——質(zhì)量管理和保證技術(shù)委員會1986——ISO84021987——ISO900090多個國家，14萬以上企業(yè)采用

53

（3）HACCPHazardAnalysisandCriticalControlPoint危容分析與關(guān)鍵控制點包括七項基本原則（3）HACCP54三.HACCP系統(tǒng)（一）HACCP的形成過程（二）相關(guān)定義（三）HACCP的七要素（原則）（四）HACCP系統(tǒng)的特點（五）對HACCP的評價三.HACCP系統(tǒng)（一）HACCP的形成過程55（一）HACCP的形成過程1960Pillsbury公司HowardBauman博士提出概念1971美國食品保護協(xié)會公布HACCP梗概1973Pillsbury公司培訓(xùn)FDA人員1985美國科學(xué)院肯定HACCP1988HACCP專著出版1989美國食品的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)顧問委員會批準(zhǔn)HACCP標(biāo)準(zhǔn)版本1992修訂1992年后兩種HACCP法規(guī)出臺：FDA——魚、水產(chǎn)品USDA——肉、禽產(chǎn)品SSOP——HACCP的基石（一）HACCP的形成過程1960Pillsbury56

（二）相關(guān)定義

1．關(guān)鍵控制點確定程序（CCPDecisionTree）：

決定某個控制點是否是關(guān)鍵控制點的一系列問題。

2．連續(xù)監(jiān)控（ContinuousMonitoring）：

不間斷地收集數(shù)據(jù)（如溫度）并將其記錄在圖形上。

3．控制（Control）：

（a）控制操作條件使之遵循已建立的標(biāo)準(zhǔn)；

（b）對照。描述正確的步驟已經(jīng)維持且標(biāo)準(zhǔn)已達到的狀況。

4．控制點（ControlPoint）：

生物、物理或化學(xué)因素需要進行控制的任何點，步驟，或程序。

（二）相關(guān)定義

1．關(guān)鍵控制點確定程序（CCP575.糾偏措施（CorrectiveAction）：

當(dāng)偏差出現(xiàn)時應(yīng)遵循的程序。

6.標(biāo)準(zhǔn)（Criterion）：

作決定或判斷時所依據(jù)的參數(shù)。

7.關(guān)鍵控制點（CriticalControlPoint,CCP）：

食品加工的某操作點、某步驟或某方法，在這些點上可以實施控制，最終使食品安全危害因子得到防止、消除或降低到可接受的水平。

8.臨界偏離（CriticalDefect）：

可能會導(dǎo)致危害發(fā)生的關(guān)鍵控制點的偏離。

5.糾偏措施（CorrectiveAction）：

589.臨界極限（CriticalLimit）：

所有同關(guān)鍵控制點相關(guān)的預(yù)防措施都必需滿足的一種標(biāo)準(zhǔn)。

10.偏差（Deviation）：

偏離臨界極限的狀況。

11. HACCP計劃（HACCPPlan）：

基于HACCP原則所建立的一套文件，描述了確保對某一特定步驟或過程進行控制的一系列程序。

12. HACCP系統(tǒng)（HACCPSystem）：

執(zhí)行HACCP計劃的一系列過程和方案。

9.臨界極限（CriticalLimit）：

5913.HACCP小組（HACCPTeam）：

負責(zé)起草和建立HACCP計劃并執(zhí)行的一群人。

14.HACCP計劃的審查（HACCPPlanValidation）：

HACCP小組對HACCP計劃的最初的評審，以確定HACCP計劃中的每一組成部分都是準(zhǔn)確無誤的。

15.HACCP計劃的再審查（HACCPPlanRevalidation）：

由HACCP小組定期對HACCP計劃的文件所進行的再審查，目的是要盡可能地完善HACCP計劃。

16.危害（Hazard）：

一種影響食品消費安全的生物、化學(xué)或物理的特性。

13.HACCP小組（HACCPTeam）：

6017.監(jiān)控（Monitor）：

執(zhí)行一系列有計劃的觀察或檢測，以評價某一關(guān)鍵控制點是否在控制中，并可為將來的查證過程提供準(zhǔn)確的記錄。

18.預(yù)防措施（PreventiveMeasure）：

對已經(jīng)確認危害健康的化學(xué)、物理或其他因子所采取的控制辦法。

19.隨機檢測（RandomChecks）：

用作對HACCP計劃所要求的定期評價的補充觀察或檢測，要求避免主觀性。

20.風(fēng)險（Risk）：

對危害發(fā)生可能性的估計。

17.監(jiān)控（Monitor）：

執(zhí)行一系列有計劃6121.敏感性成分（SensitiveIngredient）：

已知同某一危害相關(guān)聯(lián)并值得關(guān)注的成分。

22.嚴重性（Severity）：某一危害的嚴重程度。

23.目標(biāo)水平（TargetLevels）：

比臨界極限更為嚴格的標(biāo)準(zhǔn)，操作者可用來減小發(fā)生偏差的風(fēng)險。

24.查證（Verification）：

為了確定HACCP系統(tǒng)是否遵循HACCP計劃或確定HACCP計劃是否需要完善和再審查，除了監(jiān)控中使用的方法、程序或測試以外，還要使用其他方法、程序和測試加以核實。21.敏感性成分（SensitiveIngredien62

（三）HACCP的七要素（原則）（1）危害分析；（2）關(guān)鍵控制點的識別；（3）各關(guān)鍵控制點臨界極限的確定；（4）建立各關(guān)鍵控制點的監(jiān)測方法和處理監(jiān)測結(jié)果的程序；（5）建立各關(guān)鍵控制點偏離臨界極限時的校正方案；（6）建立HACCP系統(tǒng)的有效記錄檔案制度；（7）建立確認HACCP系統(tǒng)是否運轉(zhuǎn)正常的程序。

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（四）HACCP系統(tǒng)的特點

HACCP——預(yù)防策略——有效、減少損失——全面性、系統(tǒng)化

Farm——Home

生產(chǎn)商、銷售商、消費者、政府部門——嚴格檔案制度——分清責(zé)任——國際公認（四）HACCP系統(tǒng)的特點64

（五）對HACCP的評價美國科學(xué)院——對微生物危害的控制必須采用HACCP系統(tǒng)，對終產(chǎn)品的檢驗不是防止食品傳播疾病的一種有效方法。美國食品的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)顧問委員會——保證食品從原料種植到餐桌的安全的一項有效而又合理的策略。國際食品安全協(xié)會——HACCP系統(tǒng)是保證食品安全與完善的最佳方法。FAO/WHO聯(lián)合食品法典委員會——HACCP是控制由食品引起疾病的最有效方法。（五）對HACCP的評價65

四.微生物快速自動檢測技術(shù)四.微生物快速自動檢測技術(shù)66

（一）微生物快速自動檢測技術(shù)在HACCP系統(tǒng)中的地位

微生物快速自動檢測技術(shù)在科學(xué)研究、工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境保護等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，我國在這一方面還很落后，只對少數(shù)幾項技術(shù)予以了引進和研究，實現(xiàn)了商業(yè)化的技術(shù)甚微。我國加入WTO在即，農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料的安全性日益受到重視，農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料的生產(chǎn)要求逐步按HACCP系統(tǒng)要求對生產(chǎn)——消費的每個可能發(fā)生安全問題的環(huán)節(jié)都要進行微生物檢測。于是，引進、消化和研究微生物快速自動檢測技術(shù)迫在眉睫。（一）微生物快速自動檢測技術(shù)67（二）微生物快速自動檢測技術(shù)類型1.生化反應(yīng)快速檢測試劑盒*API20ERSystem*EnterotubeⅡR*Micro-IDR*MinitekTM*CrystalTMIdentificationSystem*RapIDOneSystem*RapIDTMANAⅡSystem（二）微生物快速自動檢測技術(shù)類型1.生化反應(yīng)快速檢測試劑682.計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)*BiologTM*ATBRIdentification*MicroTeamR3.活細胞計數(shù)檢測*Petrifilm*Redigel*HydrophobicGrid-membraneFiltrationSystem*SpiralAssaySystem2.計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)694.估計微生物數(shù)量的新方法*阻抗測定，如BactometerR系統(tǒng)*電導(dǎo)測定，如MalthusMicrobialAnalyzer系統(tǒng)*生物發(fā)光和ATP酶檢測，如BioluminescenceandATPanalysis4.估計微生物數(shù)量的新方法705.免疫學(xué)方法檢測*Transia卡片檢測法*TECRA系統(tǒng)*VIDAS系統(tǒng)*Biocontrol1-2Test6.分子生物學(xué)方法*ProbeliaTM*BAXR系統(tǒng)*Gene-TrakR5.免疫學(xué)方法檢測71（三）生化反應(yīng)快速檢測試劑盒1.API20ERSystem

是一種基于傳統(tǒng)的腸桿菌科和其他G-細菌生化鑒定方法上的標(biāo)準(zhǔn)化、小型檢測試劑盒。它將23種生化反應(yīng)集中設(shè)計在一個微型管系統(tǒng)中，管內(nèi)裝有脫水反應(yīng)底物和指示劑，接種培養(yǎng)后通過顏色變化呈現(xiàn)陰、陽性結(jié)果?？梢栽?8-24hr內(nèi)鑒定腸桿菌科，18-24hr或38-48hr內(nèi)鑒定其他G-細菌。優(yōu)點：為商業(yè)化產(chǎn)品，簡便易得，數(shù)據(jù)可靠。缺點：接種較費時；塑料板易變形；需有微生物工作經(jīng)驗者分析結(jié)果。（三）生化反應(yīng)快速檢測試劑盒722.EnterotubeⅡR

是一支長形塑料管，包含有分割開的12種不同的培養(yǎng)基和中間的一根接種針。這根針可將單個細菌菌落同時接種于15種標(biāo)準(zhǔn)生化反應(yīng)系統(tǒng)中，結(jié)果可由計算機軟件來分析鑒定。優(yōu)點：接種快速簡單；不需為接種做準(zhǔn)備工作；鑒定時可選用單菌落缺點：只能鑒定氧化酶反應(yīng)陰性的G-菌和腸桿菌科細菌；在培養(yǎng)箱中堆放較困難；因脫水而帶來貨架期縮短2.EnterotubeⅡR733.Micro-IDR

這是一種鑒定腸桿菌科細菌的反應(yīng)盤，由苯乙烯塑造而成，包括15個反應(yīng)小室和一個鉸鏈連接的盒蓋。其中5個反應(yīng)小室中只含有一種混合反應(yīng)底物，其余10個小室中各包含一種混合反應(yīng)底物。通過反應(yīng)的顏色變化來分析結(jié)果。優(yōu)點：準(zhǔn)確，與傳統(tǒng)生化鑒定方法有95%以上的吻合性；快速，在經(jīng)簡單分離后，只需4小時培養(yǎng)即得出結(jié)果；可靠，反應(yīng)底物是包裝在錫箔袋中，保存期長。缺點：僅針對腸桿菌科細菌，尤其是細胞色素氧化酶陰性的G-菌；需微生物工作者讀結(jié)果。3.Micro-IDR744.MinitekTM主要用于實驗室對腸桿菌科和各類G-好氧微生物的輔助鑒定，通常針對那些“非發(fā)酵型細菌”。它是一個由多個小圓盤組成的紙盤，每個小圓盤中盛有不同的生化反應(yīng)底物和指示劑，經(jīng)接種培養(yǎng)后呈現(xiàn)特定顏色反應(yīng)。優(yōu)點：多功能性，當(dāng)將小圓盤內(nèi)的反應(yīng)底物更換一下，就可用來鑒定其他微生物；結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，不易損壞；可在培養(yǎng)箱中簡單的堆放。4.MinitekTM755.CrystalTMIdentificationSystem

是改良的傳統(tǒng)發(fā)色底物制成的小型鑒定體系，主要用于腸桿菌科中典型的好氧G-菌以及人類病原的不發(fā)酵葡萄糖的G-桿菌。該鑒定盤包含有30種干燥的生化酶反應(yīng)底物，當(dāng)加入細菌培養(yǎng)液后底物復(fù)水，培養(yǎng)后指示劑顯色。優(yōu)點：反應(yīng)盤堅固，可以在一個盒中壘放10個；計算機輔助讀結(jié)果；除腸桿菌科細菌外，還可鑒定一些非發(fā)酵型微生物。缺點：只能用棉拭接種；培養(yǎng)箱要保證一定濕度，以防水分揮發(fā)。5.CrystalTMIdentificationSy766.RapID-OneSystem

運用傳統(tǒng)顯色底物來定性鑒定腸桿菌科和一些從人類臨床病樣中分離到的氧化酶陰性、G-

細菌。該系統(tǒng)包含一個反應(yīng)盤和反應(yīng)試劑。反應(yīng)盤是一個塑有很多反應(yīng)孔的一次性塑料板，每個反應(yīng)孔中含有脫水底物，經(jīng)RapID培養(yǎng)液增菌的細菌懸浮液可同時接種于反應(yīng)孔中，結(jié)果可通過計算機數(shù)據(jù)比較。優(yōu)點：在4hr內(nèi)提供結(jié)果；有明顯的顏色反應(yīng)，減少了判斷時的主觀因素；準(zhǔn)確靈敏；只需一步接種。缺點：需要微生物工作者解釋結(jié)果；不同廠家會提供不同的鑒定操作表格。6.RapID-OneSystem77（四）計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)1.BiologTM

利用細菌對95種不同碳源的代謝情況來鑒定菌種。在96微孔板中預(yù)填充并脫水干燥的95種不同碳源，并加入顯色劑。若細菌利用某種碳源，發(fā)生代謝反應(yīng)，則會在某一孔的位置上產(chǎn)生紫色。再通過查詢Biolog數(shù)據(jù)庫，就可得知細菌種類。優(yōu)點：擁有大量菌種數(shù)據(jù)庫，可鑒定2000余種，包括501種G-菌，318種G+菌，363種厭氧菌，267種酵母菌，600種絲狀真菌和45種放線菌，準(zhǔn)確率達95%以上；操作簡便。缺點：接種菌懸液時易失誤（四）計算機自動化分析鑒定系統(tǒng)782.ATBRIdentification半自動化微生物鑒定系統(tǒng)，包括密度計、自動閱讀機、計算機、自動移樣管、應(yīng)用軟件等部分。每個試驗條含有32個單獨的吸盤，吸盤中含有不同反應(yīng)底物和生化試劑，經(jīng)接種培養(yǎng)后，ATB系統(tǒng)通過對吸盤中混濁度和顏色的變化來分析鑒定菌株，結(jié)果自動輸出。2.ATBRIdentification793.MicroTeamR

這是一種快速自動化微生物鑒定系統(tǒng)，是Bactometer系統(tǒng)和VITEK系統(tǒng)的組合。其中，Bactometer系統(tǒng)可利用阻抗變化來測定微生物活動，從而在6-48hr內(nèi)鑒定多種微生物；而VITEK系統(tǒng)有四部分組成：將一定濃度的菌液真空填充到該系統(tǒng)提供的菌種鑒定試驗卡中的真空填充器、自動為試驗卡封口的封口器、培養(yǎng)此卡可調(diào)溫的培養(yǎng)箱、在培養(yǎng)的同時每小時檢測一次顏色和濁度變化并分析數(shù)據(jù)的計算機。計算機收集每小時的數(shù)據(jù)，由數(shù)據(jù)庫進行分析比較判斷出菌種的種類。3.MicroTeamR80（五）活細胞計數(shù)檢測1.Petrifilm（皿膜系統(tǒng)）這是一張制好的卡片，由兩個粘在一起的塑料薄膜組成，在一邊膜上涂布有培養(yǎng)基成分和溶于冷水的凝膠劑?？蛇M行好氧培養(yǎng)計數(shù)（APCs),也可使用選擇性培養(yǎng)基檢測特殊菌群。在兩薄膜中間滴加1mL的稀釋液，適當(dāng)溫度下48hr左右就可菌落計數(shù)。

（五）活細胞計數(shù)檢測811.Petrifilm（皿膜系統(tǒng)）-II優(yōu)點：通過AOAC等機構(gòu)認證；無須制備培養(yǎng)基，提高了檢測效率；每個膜上都有顏色指示劑，故特定菌落顯示特定顏色，方便計數(shù)；大腸桿菌計數(shù)卡中的大腸桿菌菌落是藍色并伴有氣泡的；無論對于大小實驗室均實用，尤其適合野外測定。缺點：低pH和低濕度的樣品需要另外稀釋。1.Petrifilm（皿膜系統(tǒng)）-II822.Redigel(即用膠系統(tǒng)）此系統(tǒng)具盛有無菌液體培養(yǎng)基的試管，把樣品（譬如1mL食物樣品）傾入該試管中，混勻后再將混合物倒入一個裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中，混合物與膠質(zhì)接觸后便形成與瓊脂相似的復(fù)合物，經(jīng)培養(yǎng)后可計菌數(shù)。優(yōu)點：已包裝好的，無須滅菌；減少了培養(yǎng)基制備過程；應(yīng)用領(lǐng)域多，適合野外測定；此種培養(yǎng)基不會被一些果膠分解菌水解。2.Redigel(即用膠系統(tǒng)）833.HydrophobicGrid-membraneFiltrationSystem（疏水格柵過濾系統(tǒng)）此法中所用的膜為特殊的含有1600個蠟質(zhì)網(wǎng)格的防水膜，每格限制微生物的生長和菌落大小。1mL的樣品處理勻液經(jīng)過此濾膜過濾后，將膜置于瓊脂培養(yǎng)基表面恒溫過夜，用MPN自動計數(shù)。優(yōu)點：受傷細胞可在非選擇性培養(yǎng)基上復(fù)蘇后，再移至選擇性培養(yǎng)基上；能將水中可能影響微生物生長的水溶性物質(zhì)去除；含量很低的微生物菌懸液經(jīng)過濾后濃度加大，便于檢測；每個菌落都是正方形，便于人工或機器計數(shù)。3.HydrophobicGrid-membrane844.SpiralAssaySystem（旋轉(zhuǎn)平板法）

平板中預(yù)注入培養(yǎng)基并凝固，液體接種物經(jīng)特制注射器涂布在此旋轉(zhuǎn)的平板上，散布器從平板中心移至外圍，樣品即被涂布在一條阿基米德線上。注射器不斷增加散布樣品的體積量，使得在一個平板上的濃度范圍達到10000：1。在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，平板中心菌落濃度較高，邊緣較低。通過特殊的格狀計數(shù)器對旋轉(zhuǎn)平板的菌落計數(shù)。優(yōu)點：已通過AOAC認證；所用的瓊脂少；所需培養(yǎng)皿、稀釋液空白、吸管少；每小時可涂布50-60個平板，操作中不需調(diào)試。缺點：食品樣品中的顆?？赡軙棺⑸淦鞯尼橆^堵塞。4.SpiralAssaySystem（旋轉(zhuǎn)平板法）85（六）估計微生物數(shù)量的新方法1.阻抗測定，如BactometerR系統(tǒng)原理：當(dāng)微生物的生長和降解代謝營養(yǎng)物質(zhì)時，液體中的大分子變?yōu)樾》肿?，從而引起液體內(nèi)部阻抗和導(dǎo)電變化。操作過程：樣品經(jīng)過一定的程序處理后裝入隨儀器提供的小室中，在培養(yǎng)的同時測定阻抗的變化，所有測量數(shù)據(jù)由系統(tǒng)中的計算機處理。當(dāng)微生物代謝基質(zhì)并達到105-6細胞/mL時，阻抗積聚增加，檢測屏幕上出現(xiàn)類似生長曲線對數(shù)生長期的斜線，阻抗發(fā)生變化的時間為檢測時間，和樣品中微生物量呈反比。此方法主要用于牛奶、乳制品、肉制品和其它食物中微生物的測定。（六）估計微生物數(shù)量的新方法862.電導(dǎo)測定，如MalthusMicrobialAnalyzer系統(tǒng)與測阻抗類似，該系統(tǒng)是