共聚焦顯微鏡應(yīng)用

1、共聚焦顯微鏡應(yīng)用細(xì)胞原位檢測核酸目錄 概述 PI的特性 PI的應(yīng)用 PI標(biāo)記細(xì)胞的方法.概述激光掃描共聚焦顯微術(shù)通過成像顯示出細(xì)胞內(nèi)核酸的分布特征及含量，即實(shí)現(xiàn)定位、定性及定量檢測核酸。該方法常用于細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察、檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀察等。.熒光探針分子與核酸結(jié)合方式 嵌入性結(jié)合方式 嵌入在DNA的兩個堿基之間，每隔幾個堿基嵌入一個熒光分子 結(jié)構(gòu)親和方式 以靜電力結(jié)合，正電荷熒光分子和帶負(fù)電和的磷酸互相結(jié)合，極弱，常造成熒光分子丟失 共價鍵方式 使DNA鏈之間以原子結(jié)合的方式被打開，形成與熒光探針分子共價結(jié)合.碘化丙啶（PI）檢測核酸 PI的特性 PI屬于

2、嵌入性熒光探針，可以嵌入到雙鏈DNA和RNA堿基對中與之結(jié)合，無堿基特異性。這種結(jié)合方式緊密，穩(wěn)定。 通常，PI染色可以同時標(biāo)記雙鏈DNA和RNA的總和；經(jīng)過RNA酶處理除去RNA的干擾后，可定性和定量DNA。 PI另一特點(diǎn)是不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，因此用于檢測細(xì)胞的死活.PI應(yīng)用 PI標(biāo)記可以是活細(xì)胞也可以是固定的細(xì)胞 當(dāng)標(biāo)記活細(xì)胞樣品時，目的在于檢查細(xì)胞的膜完整性及其壞死情況，常應(yīng)用于檢測膜損傷、細(xì)胞凋亡； 標(biāo)記固定細(xì)胞時，目的一般是進(jìn)行細(xì)胞核定位、顯示細(xì)胞核或染色體的形態(tài)、定量測定核酸等，常應(yīng)用于檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、RNA和DNA在細(xì)胞內(nèi)的分布及其含量變化、以及用作核酸顯色劑.PI標(biāo)記

3、細(xì)胞的方法 樣品為活細(xì)胞 可直接向細(xì)胞外液中加人PI,使終濃度為115 g/ml（根據(jù)細(xì)胞種類及其密度而異），室溫放置515min后，用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測。 細(xì)胞膜完好的正?；罴?xì)胞，PI不能染色； 膜不完整的細(xì)胞及死細(xì)胞則可檢測到PI的紅色熒光，此時觀察到的是細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的總量。該項(xiàng)檢測最好在短時間內(nèi)完成， 因PI也有一定的細(xì)胞毒性，長時間接觸會損傷正常活細(xì)胞而進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)，造成實(shí)驗(yàn)假象 .PI標(biāo)記細(xì)胞的方法 樣品為固定細(xì)胞 用含有PI 110g/ml的PBS染色液（pH為7.27.4）標(biāo)記，室溫標(biāo)記515min，上機(jī)測定。若只要檢測細(xì)胞內(nèi)DNA時，則在上述染色前還需要加人濃度為50 g/ml的RNA酶，然后在37 孵育30分鐘，以消化去除RNA,即可進(jìn)行PI染色和DNA觀察分析.謝謝聆聽未完待續(xù).楚河漢界小鼠腸道及其中的人類腸道微生物，63x.重影的林小鼠耳部血管與神經(jīng)網(wǎng)，10 x.無