生化實驗思考題參考答案1

1、生化實驗講義思考題參考答案實驗一 淀粉的提取和水解1、實驗材料的選擇依據(jù)是什么？答：生化實驗的材料選擇原則是含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低。從科研工作的角度選材，還應(yīng)當注意具體的情況，如植物的季節(jié)性、地理位置和生長環(huán)境等，動物材料要注意其年齡、性別、營養(yǎng)狀況、遺傳素質(zhì)和生理狀態(tài)等，微生物材料要注意菌種的代數(shù)和培養(yǎng)基成分的差異等。2、材料的破碎方法有哪些？答：(1) 機械的方法： 包括研磨法、組織搗碎法； (2) 物理法：包括凍融法、超聲波處理法、壓榨法、冷然交替法等； (3) 化學(xué)與生物化學(xué)方法：包括溶脹法、酶解法、有機溶劑處理法等。實驗二 總糖與還原糖的測定1、堿性銅試劑法測定還原糖

2、是直接滴定還是間接滴定？兩種滴定方法各有何優(yōu)缺點？答: 我們采用的是堿性銅試劑法中的間接法測定還原糖的含量。間接法的優(yōu)點是操作簡便、反應(yīng)條件溫和，缺點是在生成單質(zhì)碘和轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物的過程中容易引入誤差；直接法的優(yōu)點是反應(yīng)原理直觀易懂，缺點是操作較復(fù)雜，條件劇烈，不易控制。實驗五 粗脂肪的定量測定索氏提取法（1）本實驗制備得到的是粗脂肪，若要制備單一組分的脂類成分，可用什么方法進一步處理？答：硅膠柱層析，高效液相色譜，氣相色譜等。（2）本實驗樣品制備時烘干為什么要避免過熱?答：防止脂質(zhì)被氧化。實驗六 蛋白質(zhì)等電點測定1、 在等電點時蛋白質(zhì)溶解度為什么最低？請結(jié)合你的實驗結(jié)果和蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)加以說

3、明。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在等電點時分子所帶凈電荷為零，分子間因碰撞而聚沉傾向增加，溶液的粘度、滲透壓減到最低，溶解度最低。結(jié)果中pH約為4.9時，溶液最渾濁，達到等電點。答：2、在分離蛋白質(zhì)的時候，等電點有何實際應(yīng)用價值？答: 在等電點時，蛋白質(zhì)分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以處于等電點的蛋白質(zhì)最容易沉淀。在分離蛋白質(zhì)的時候，可以根據(jù)待分離的蛋白質(zhì)的等電點，有目的地調(diào)節(jié)溶液的pH使該蛋白質(zhì)沉淀下來，從而與其他處于溶液狀態(tài)的雜質(zhì)蛋白質(zhì)分離。實驗七 氨基酸的分離鑒定紙層析法1、如何用紙層析對氨基酸進行定性和定量的測定？答: 將標準的已知氨基酸與待測的未知氨基酸在同一張層析紙上進行紙層析

4、，顯色后根據(jù)斑點的Rf值，就可以對氨基酸進行初步的定性，因為同一個物質(zhì)在同一條件下有相同的Rf值；將點樣的未知氨基酸溶液和標準氨基酸溶液的體積恒定，根據(jù)顯色后的氨基酸斑點的面積與點樣的氨基酸質(zhì)量成正比的原理，通過計算斑點的面積可以對氨基酸溶液進行定量測定。3、紙層析、柱層析、薄層層析、高效液相層析各有什么特點？答:  支持介質(zhì)層析原理層析方向上樣量分離效率紙層析濾紙分配上行（多）或下行小低薄層層析玻璃板或塑料板分配、吸附上行較大較高柱層析玻璃柱分配、吸附、離子交換、分子篩、親和層析等下行可小可大較高高效液相層析不銹鋼柱分配、吸附-可小可大高實驗八 蛋白質(zhì)含量的測定(1) 簡述紫外分光

5、光度法測定蛋白質(zhì)濃度的原理及優(yōu)點。答：原理：由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（OD280）與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。優(yōu)點：迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。實驗十 影響酶活性的因素（1）本實驗中如何通過淀粉液加碘后的顏色的變化來判斷酶促反應(yīng)快慢的？答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，經(jīng)過一系列被稱為糊精的中間產(chǎn)物，最后生成麥芽糖和葡萄糖。變化過程如下：淀粉紫色糊精紅色糊精麥牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、紅色糊精遇碘后分別呈藍色、紫色與紅色。麥芽糖和葡萄糖遇

6、碘不變色。因此反應(yīng)后顏色如為藍色說明酶活力低，淡黃色則說明酶活力高。（2）如何通過加入班氏試劑后生成沉淀多少來反映酶促反應(yīng)快慢的？答：淀粉與糊精無還原性，或還原性很弱，對本尼迪克特試劑呈陰性反應(yīng)。麥芽糖、葡萄糖是還原糖，與本尼迪克特試劑共熱后生成紅棕色氧化亞銅的沉淀。因此，產(chǎn)生紅棕色氧化亞銅的沉淀越多說明酶活力越高。（3）通過本實驗，結(jié)合理論課的學(xué)習(xí)，小結(jié)出哪些因素影響唾液淀粉酶活性？是如何影響的？答：溫度、pH、激活劑、抑制劑等。高于或低于最適溫度或pH，酶活力都會降低；激活劑和抑制劑不是絕對的，只是相對而言，隨著濃度的變化而變化。實驗十二 堿性磷酸酶的分離提取及比活力的測定(1) 試說明用

7、硫酸銨分級分離酶的方法及應(yīng)注意的事件。答：用鹽分級沉淀是一種應(yīng)用非常廣泛的方法。由于硫酸銨在水中溶解度很大（20，每升可溶760克），并且對許多酶沒有很大的影響，因此它是最常用的鹽。例如：某酶（或蛋白質(zhì)）發(fā)生鹽析的范圍為35-65%飽和硫酸銨的濃度，因此可先選擇30%飽和硫酸銨濃度，去沉淀雜蛋白，然后選擇70%飽和硫濃度酸銨，留沉淀（含所要的酶）。注意事項：在用硫酸銨沉淀酶蛋白時，要注意緩沖液的pH值和溫度，鹽的溶解度隨溫度不同而有較大的變化，同時酶的溶解度亦隨溫度的改變而改變。在加硫酸銨時，需事先將硫酸銨粉末研細。加入過程需緩慢并及時攪拌溶解。攪拌要緩慢，盡量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液

8、中表面變性。(2) 用正丁醇處理勻漿液可以有效地使堿性磷酸酶酶蛋白釋放，使酶的產(chǎn)量大大提高，這是為什么？答：因為堿性磷酸酶酶是一種膜蛋白，正丁醇處理后可使結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)更多地釋放出來。(3) 酶活力測定時，為什么必需先將酶液對緩沖液透析后才測定？答：去除鹽離子的影響。實驗十三 凝膠過濾層析純化堿性磷酸酶1. 在本實驗中要注意哪些重要環(huán)節(jié)？答：1） 注意區(qū)分柱子的上下端。2） 各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。3） 裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此凝膠。4） 始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也

9、要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動。5） 核酸蛋白檢測儀，記錄儀，部分收集器要正確連接。6） 要控制一定流速。7） 收集得到的液體要進行酶活力的檢測。實驗十四 底物濃度對酶活力的影響（米氏常數(shù)的測定）1. 在測定酶催化反應(yīng)的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm時，應(yīng)如何選擇底物濃度范圍？答：底物濃度選擇范圍 S»0.2-5.0 Km為宜。底物濃度選取還應(yīng)該注意其倒數(shù)能均勻分布。1/v 1/v 0 1/S 0 1/S 底物濃度太大 底物濃度太小2. 試說明米氏常數(shù)Km的物理意義和生物學(xué)意義。答： (1) Km是酶的一個極重要的動力學(xué)特征常數(shù)， Km物理含義：ES絡(luò)合物消

10、失速度常數(shù)與形成速度常數(shù)之比；其數(shù)值相當于酶活性部位的一半被底物占據(jù)時所需的底物濃度。(2) 可根據(jù)Km估計底物濃度的水平。(3) Km可作為同工酶的判斷依據(jù)。(4) 鑒別最適底物。(5) 有助于在酶學(xué)研究中對底物濃度的選擇。選用S>10Km濃度進行活力測定 3. 為什么說米氏常數(shù)Km是酶的一個特征常數(shù)而Vm則不是？答：某種酶的Km在給定的體系中不隨酶濃度改變而改變，也與酶的純度無關(guān)，因此是酶的一個特征常數(shù)。但Vm隨酶濃度改變而改變。實驗十七 SDS-PAGE電泳(1) 簡述SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量的原理;答：1）SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋

11、白質(zhì)SDS復(fù)合物。 2）SDS帶有大量負電荷，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物都帶上相同密度的負電荷。 3）SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的形狀一樣，都是近似于雪茄煙形的長橢圓棒。 4）不同的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負電荷，并具有相同形狀；因此在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。(2) 是否所有的蛋白質(zhì)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定得到的分子量都完全可靠？答：不是。 如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。 例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是35,000。實驗十八 維生素C的定量測定（1）簡述本法測定VC的利與弊。答：碘量法測定VC相比其它方法傳統(tǒng)的碘滴定法迅速、簡捷，但易受到待測物顏色干擾而不易判斷滴定終點；只能測定待測溶液還原型的Vc