正交設(shè)計(jì)重復(fù)實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選丹參骨寶酸提取工藝的最佳條件

1、正交設(shè)計(jì)重復(fù)實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選丹參骨寶酸提取工藝的最佳條件                           作者：劉力名，呂應(yīng)年，崔燎，吳鐵【摘要】  目的采用正交實(shí)驗(yàn)考察丹參骨寶的酸提取液制備工藝的最佳條件。方法以丹參素鈉與丹酚酸B含量之比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)溶劑（A）、溶劑量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）等4個(gè)因素的3個(gè)水平

2、進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果直觀分析和方差分析顯示酸提取工藝因素的影響大小依次是：溶劑>溶劑量>提取時(shí)間>提取次數(shù)，最佳提取工藝條件為A3B2C1D3，即5 g丹參粗粉加4%鹽酸50 ml回流提取0.5 h，共提取3次。結(jié)論通過正交實(shí)驗(yàn)篩選出了丹參骨寶最佳的酸提條件。 【關(guān)鍵詞】  丹參骨寶正交設(shè)計(jì) 高效液相色譜法Abstract：ObjectiveTo obtain the optimization condition for preparation of Danshen Gubao acid extraction solution using orthogon

3、al design.MethodsUsing the ratio of  contents of DanshensuNa and Salvianolic Acid B as an evaluation standard,the L9(34) experiment was carried out in consideration of 3 levels of 4 factors including solvent(A),dosage of solvent(B),extraction time(C,h),number of extraction times(D).ResultsThe o

4、ptimized extraction conditions calculated by the intuitive analysis and ANOVA was A3B1C1D3,5 g SM power was added in 50 ml 4% hydrochloric acid water solution，backstreaming and boiling for 0.5 h. The gruffs was extracted three times according to above procedure.ConclusionThe optimization conditions

5、for acid extraction of Danshen Gubao was sieved by orthogonal test.Key words： Danshen Gubao;   Orthogonal design;  HPLC    丹參(Radix Salviae Mihiorrhiza,SM)為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根莖，具有祛淤止痛，活血通經(jīng)，清心除煩的功效1。丹參的主要成分按照極性可分為脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物。丹參水溶性有效成分一般采用傳

6、統(tǒng)的水煎煮法提取，提取液中一般含有較多的丹酚酸B（約為生藥量的2.7%），而丹參素的含量則較少（約為生藥量的0.4%），此外還含有原兒茶醛等有效成分2。    近年來，我們課題組發(fā)現(xiàn)丹參水溶性有效成分尤其是丹參素和丹酚酸B及原兒茶醛可促進(jìn)成骨細(xì)胞活性從而有效預(yù)防糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨質(zhì)疏松3，4。進(jìn)一步的體外研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的水提法制備的丹參提取液相比，通過酸提法制備的丹參骨寶提取液對(duì)成骨細(xì)胞的活性顯著增強(qiáng)5。    目前丹參水溶性成分的提取方法主要有水煎回流法、超聲提取法等，通過這些提取方法制備的提取液中丹酚酸B的含量均比丹參素的含

7、量高。通過解析丹酚酸B和丹參素的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B為三分子丹參素與一分子咖啡酸的縮合物6。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間加熱或者酸性環(huán)境均會(huì)使丹酚酸B水解，導(dǎo)致丹酚酸B含量降低而丹參素含量增加。從節(jié)省時(shí)間考慮，本實(shí)驗(yàn)采用酸回流提取法制備丹參骨寶提取液。    為了保證丹參骨寶提取液中丹參素與丹酚酸B的含量相當(dāng)以及提取工藝的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)采用有重復(fù)的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以丹參素與丹酚酸B含量之比為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察溶劑、溶劑加入量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響，確定了丹參骨寶提取液的合理可行的酸提取制備工藝。1  材料與儀器1.1  藥品與試劑

8、 丹參素鈉（批號(hào)110855200507）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)111562200403），由藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用；丹參飲片（產(chǎn)地河北，湛江市恒生藥業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純（天津四友試劑公司）；水為實(shí)驗(yàn)室自制三蒸水；其余試劑均為分析純。2  方法與結(jié)果2.1  色譜條件色譜柱為Thermo Hypersil C18(5 m，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為以甲醇（A相）1%冰醋酸水溶液（V/V，B相）為流動(dòng)相進(jìn)行線性梯度洗脫:09 min:10%A，927 min:10%A64%A,2730 min:64% A10%A，流速為1 ml

9、83;min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫30。2.2  對(duì)照品溶液的制備精密稱取丹參素鈉對(duì)照品0.001 5 g，丹酚酸B對(duì)照品0.002 5 g，溶于2 ml 20%甲醇水溶液中，超聲助溶5 min，即得儲(chǔ)備液，其中丹參素鈉及丹酚酸B濃度分別為0.75 mg·ml-1，1.25 mg·ml-1。2.3  供試品溶液的制備丹參飲片放烘箱于60干燥12 h后粉碎成40目粗粉。稱取5 g丹參粉，加入適量的溶劑，置于電熱恒溫加熱套上回流加熱，提取結(jié)束后過濾，濾液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，0.45 m濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。2.4  線性關(guān)系

10、的考察將儲(chǔ)備液用20%甲醇水溶液逐次等倍稀釋，配制成一系列含有丹參素鈉和丹酚酸B的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 l，注入高效液相色譜儀。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，丹參素鈉的回歸方程為：Y=13.018X-22.913（r=1），表明丹參素鈉在8.4750 g·ml-1之間有良好的線性關(guān)系。丹酚酸B的回歸方程為：Y=18.028X-61.656（r=0.999 9），說明丹酚酸B在9.81.25 g·ml-1之間有良好的線性關(guān)系。1         

11、2.5  精密度試驗(yàn)精密吸取同一對(duì)照品溶液20 l,連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積精密度，丹參素鈉和丹酚酸B的RSD分別為1.8%，2.1%。2.6  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)將正交實(shí)驗(yàn)2號(hào)平行6份,制成供試品溶液,測(cè)定峰面積并計(jì)算濃度，丹參素鈉和丹酚酸B的RSD分別為2.0%，0.58%。2.7  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取正交實(shí)驗(yàn)2號(hào)樣品，分別于0，2，4，8，10 h測(cè)定丹參素鈉及丹酚酸B峰面積并計(jì)算濃度。丹參素鈉和丹酚酸B的RSD分別為3.14%，0.93%。結(jié)果表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。2.8  加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的供試品溶液，分別添加丹參素鈉及丹酚酸B對(duì)照品溶液，同法制備

12、成供試品溶液并按上述色譜條件測(cè)定其丹參素鈉及丹酚酸B濃度，計(jì)算加樣回收率為分別為97.1%，98.1%。結(jié)果表明，本法具有良好的回收率。2.9  正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果采用正交實(shí)驗(yàn)法，選取溶劑（A）、溶劑加入量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）等4個(gè)因素進(jìn)行考察，各因素為3水平。實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表23。表1  丹參酸提取實(shí)驗(yàn)影響因素與水平（略）表2  L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果（略）表3  方差分析（略）    表2及表3顯示，以丹參素鈉與丹酚酸B含量之比為考察指標(biāo)，4個(gè)因素的影響大小依次為A&g

13、t;B>C>D；方差分析表明只有溶劑因素對(duì)該指標(biāo)的影響有顯著性意義。從專業(yè)上看最佳條件為A3B2C1D3，即5 g丹參粉，加入到4%鹽酸50 ml中，回流加熱煮沸30 min，提取3次。2.10  重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取10 g丹參粉，按照A3B2C1D3最佳條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本次實(shí)驗(yàn)得到的最佳組合條件與試驗(yàn)結(jié)果一致，可實(shí)際應(yīng)用。表4  重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）3  討論    采用傳統(tǒng)的水煎煮法或回流提取法制備的丹參水提液中，丹參素的含量較低，丹酚酸B的含量則較高，因此不能制備出二者含量相當(dāng)?shù)奶崛∫?。本研究?chuàng)新之處在于采用酸回流提取的方法，分解一定量的丹酚酸B，使丹參素的含量較水提取增加3倍左右，最終與丹酚酸B含量相當(dāng)，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的最佳藥效?！尽?#160; 1國(guó)家藥典委員會(huì).藥典，部S. 北京:化學(xué)出版社，2005: 52.2劉敏彥，趙韶華，蓋瀟樺，等. 丹參不同提取方法中水溶性成分含量的比較研究J. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2007,18(5):1186.3崔燎， 鄒麗宜，