植物體細胞雜交

1、植物體細胞雜交技術(shù)及其在獼猴桃育種中的應(yīng)用中南林業(yè)科技大學(xué)生科院生物工程2班劉朝水20080349摘要: 植物體細胞雜交使遠緣雜交不親和的植物有可能實現(xiàn)遺傳物質(zhì)重組, 創(chuàng)造和培養(yǎng)植物新品種. 獼猴桃現(xiàn)有栽培品種存在一定的缺陷, 利用體細胞雜交技術(shù)對獼猴桃品質(zhì)特性進行改良具有廣闊的應(yīng)用前景. 文章對植物體細胞雜交技術(shù)基本概況、獼猴桃原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)情況以及體細胞雜交技術(shù)在獼猴桃育種工作中取得的進展進行了綜述, 并對植物體細胞雜交技術(shù)在改良獼猴桃種質(zhì)方面的發(fā)展前景進行了展望關(guān)鍵詞: 體細胞雜交 獼猴桃 育種體細胞雜交是細胞生物學(xué)與植物分子遺傳學(xué)相結(jié)合發(fā)展起來的一項育種新技術(shù)。它是指將兩種不同植物

2、的體細胞用酶分解法除去細胞壁，分離成裸露的原生質(zhì)體。再使兩種原生質(zhì)體融合成雜種細胞，然后利用細胞的全能性在培養(yǎng)基上重新增生細胞壁，并進行細胞的分裂、分化與生長發(fā)育，再經(jīng)誘導(dǎo)形成雜種株，從中選優(yōu)去劣按育種目標要求培育出新品種，并創(chuàng)造出新物種。1植物體細胞雜交概述植物體細胞雜交過程包括植物原生質(zhì)體的游離、原生質(zhì)體融合、雜種細胞的篩選和植物的再生及鑒定.2原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體間融合是指雙親的原生質(zhì)體可以是種間、屬間、甚至科間在特定的物理或化學(xué)因素作用下誘導(dǎo)融合成雜種細胞核質(zhì)雜種或胞質(zhì)雜種, 通過細胞分裂形成愈傷組織, 并分化和再生出植株 6 . 原生質(zhì)體間可以發(fā)生自發(fā)融合, 但頻率很低, 目前誘導(dǎo)原

3、生質(zhì)體融合的方法主要有聚乙二醇（ PEG） 法和電融合法兩種. PEG法是20世紀70年代Kao等 7 建立起來的, 該方法融合頻率高, 無種屬特異性, 不需要特殊的儀器, 操作簡單, 是目前使用最廣泛的方法. Senda等 8 首次利用電脈沖誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合成功后, 電融合法已成為目前最熱門的物理誘導(dǎo)融合方式. 較之化學(xué)方法, 電融合法操作更為簡單, 對細胞毒害小, 但由于需要昂貴的儀器, 目前仍不如化學(xué)法普遍.3雜種細胞的篩選由于原生質(zhì)體融合的低效率和非特異性, 融合后的群體中含有未融合體、自體融合及異體融合, 因此需要在培養(yǎng)的時候進行篩選. 遺傳互補是一種很好的篩選方法, 即兩個突變的細

4、胞融合后才能正常生長 , 但由于受到突變體不易獲得的限制, 該法應(yīng)用并不廣泛. 近來在此基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新的方法。通過適當(dāng)?shù)奈锢磔椛? r射線、x射線、紫外線) 能使其核染色質(zhì)受到傷害, 從而也失去持續(xù)分裂的能力.而一些化學(xué)試劑如碘乙酰胺處理能失活胞質(zhì)中的酶, 從而抑制其生長. 這兩類原生質(zhì)體融合后的雜種細胞由于生理互補便能生長并再生為植株 . 當(dāng)不能應(yīng)用這類遺傳標記時, 還可將原生質(zhì)體用不同的活性熒光染料標記, 用流式細胞儀來分離雜種細胞 , 這種方法準確、效率高, 但價格昂貴.4植株的再生及鑒定融合后的原生質(zhì)體, 在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下, 可以再生出新的細胞壁, 進而進行細胞分裂及分化, 形成

5、再生植株. 獲得再生植株后, 還必須對其進行嚴格的鑒定, 可以從基因組DNA和基因表達兩方面來進一步確認. 前者主要是利用各種已知的分子標記如限制性片段長度多態(tài)性、隨機擴增多態(tài)性DNA、簡單重復(fù)序列、擴增片段長度多態(tài)性 進行雜種鑒定, 后者主要是通過同功酶、次生代謝產(chǎn)物的分析來確定雜種植株. 例如Austin等 12 通過對再生植株蘋果酸脫氫酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶等酶的同工酶進行分析獲得了雜種植株. 此外, 形態(tài)學(xué)及細胞學(xué)的觀察和比較也是常用手段.4 體細胞雜交在獼猴桃育種中的應(yīng)用獼猴桃育種研究現(xiàn)狀 實生選種及芽變選種國內(nèi)外大多數(shù)獼猴桃栽培品種均來源于實生選種, 我國從野生資源中選優(yōu),實際上也就是

6、在野生實生群體中進行單株選擇. 國外的主栽品種是新西蘭的“海沃德”, 是奧克蘭市的HaywardWright從40棵實生苗中選育出來的, 另外, 新西蘭還從世界各地大量引進的美味、中華獼猴桃實生苗中進行選種. 我國獼猴桃育種工作者在實生選育工作中也做出了輝煌的成績. 到目前為止, 從自然野生群體及實生群體中選育出了1 000多份優(yōu)良品系, 近100份通過品種審定, 部分品種已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn), 如“秦美”、“米糧1號”、“徐香”、“金冠”、“魁蜜”、“金魁”等. 近年來, 通過實生選種選育了一批具有優(yōu)良性狀的獼猴桃新品種, 如“紅陽”、“金桃”、“豫獼猴桃2號”、“江山”等盡管目前的諸多栽培品

7、種, 尤其是國外的著名主栽品種“海沃德”的優(yōu)點很多, 但仍有需要改進之處, 因而對“海沃德”品種進行芽變選種成為國外獼猴桃育種的另一主要目標. 例如, 新西蘭已從“海沃德”品種中選出多個芽變株系, 包括果心小、果實長芽變品系; 早熟芽變品系; 少毛芽變品系等, 此外, 新西蘭獼猴桃育種家還對“海沃德”品種休眠枝條進行了輻射處理以提高芽變頻率. 此外, 意大利育種學(xué)家還發(fā)現(xiàn)了“海沃德”雌雄同株芽變株系“HE21”與HE22”, 這是獼猴桃芽變選種的重大成果之 體細胞雜交技術(shù)在獼猴桃育種的應(yīng)用目前, 獼猴桃的栽培品種往往存在某些性狀缺陷, 如耐貯藏性和抗逆性較差等. 在過去幾十年中, 對野生資源的

8、開發(fā)利用、實生選種、芽變選種以及常規(guī)雜交育種都取得了許多成果. 但這些育種方式存在這樣或那樣的問題, 如芽變育種在其他果樹上應(yīng)用較多, 但在獼猴桃上應(yīng)用比較困難, 即使“海沃德”某些希望得到改進的性狀有變異, 但在樹上也難以發(fā)現(xiàn), 而有些性狀難以在單獨的枝蔓上進行鑒評, 如豐產(chǎn)性、生長性能等. 獼猴桃屬植物雌雄異株, 倍性復(fù)雜, 雌雄株間花期不遇使種間雜交較困難, 而且育種周期長, 具有不確定. 獼猴桃常規(guī)育種困難, 新興的遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程技術(shù)雖然能直接引入優(yōu)良性狀, 縮短育種時間, 但轉(zhuǎn)基因的安全問題一直是全球關(guān)注的焦點, 人們對轉(zhuǎn)基因食品的疑慮對該技術(shù)的應(yīng)用造成了極大的限制. 隨著植物體

9、細胞雜交技術(shù)在其他物種的巨大成功及獼猴桃原生質(zhì)體制備與再生技術(shù)的成熟, 體細胞雜交為獼猴桃種質(zhì)改良開辟了新的途徑, 為解決獼猴桃育種所面臨的困難提供了新的機遇.體細胞雜交技術(shù)不僅可以進行不同種、屬、科間的遠源雜交, 還可省去有性雜交育種中很多中間環(huán)節(jié), 大大縮短育種周期, 并且同源原生質(zhì)體融合還可實現(xiàn)染色體加倍, 用單倍體融合可獲得純合二倍體植株, 用單倍體和二倍體融合可獲得三倍體植株, 用二倍體融合可獲得同源四倍體, 用其他不同倍性原生質(zhì)體融合可以產(chǎn)生更多染色體組組合. Guo等 34 通過柑橘種內(nèi)體細胞雜交獲得150多個雜種細胞系, 初步篩選發(fā)現(xiàn)78%為四倍體, 其余的為二倍體, 通過流式

10、細胞儀、SSR、(mt) RFLP、( cp) SSR等進一步分析,在8個株系中, 6個為四倍體, 其中4個為異源四倍體, 1個為同源四倍體, 1個為細胞質(zhì)雜種四倍體, 2二倍體株系均是胞質(zhì)雜種. Grosser等 35 通過體細胞雜交獲得抗刺線蟲的砧木, 而且由于這些體細胞雜種的砧木的染色體多倍性, 還可控制柑橘樹的大小, 從而提高產(chǎn)量. Pavan等 36 通過體細胞雜交獲得抗柑桔潰瘍病菌和茍養(yǎng)木桿菌的雜種植株. Filho等 37 通過測試一系列的體細胞雜交植株莖桿和根對黑脛病和柑橘衰退病的抗性, 以期獲得抗黑脛病和柑橘衰退病的體細胞雜種作為砧木, 并篩選到一些抗性株系.Viloria等

11、 38 通過體細胞雜交獲得了無籽三倍體品種. 體細胞雜交技術(shù)在柑橘育種中的巨大成功可為其在獼猴桃中的應(yīng)用提供借鑒.然通過體細胞雜交技術(shù)改良獼猴桃種質(zhì)方面的報道還不多, 但已展示出了其廣闊的應(yīng)用前景. 從遺傳改良上看, 應(yīng)有目的有意識的選擇親本進行原生質(zhì)體融合, 不斷改良獼猴桃的品質(zhì), 如將經(jīng)濟價值高的美味獼猴桃與抗寒性極強的軟棗獼猴桃進行體細胞雜交得到Vc含量高、風(fēng)味佳、品質(zhì)優(yōu), 且能在低溫地區(qū)栽種的新品種 41 . 又如, 中華獼猴桃早熟、果大、形美、味佳, 但果實不耐貯藏、貨架期短、離園價低, 也可通過體細胞雜交技術(shù)淘汰那些極不耐貯藏的品種. 通過不同果肉顏色的優(yōu)良品種進行體細胞雜交還可篩

12、選各種果肉顏色的良種, 并可獲得不同染色體倍數(shù)的品系, 染色體多少往往與果實的大小相關(guān)聯(lián). 同時, 通過體細胞雜交也可以篩選一些其他特異性狀的品種, 如雌雄同株類型、少籽類型、多汁適合加工類型以及食用、藥用、觀賞用一體化類型等. 通過栽培品種和野生近緣種間的體細胞雜交可以有效地將野生種的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)至栽培品種以擴大栽培品種的基因庫.5 展望隨著農(nóng)業(yè)科技進步、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的不斷發(fā)展與人類社會對優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品日益增長的需要，必然要求育成更多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗與用途多樣的農(nóng)作物新品種用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。要實現(xiàn)上述育種目標，就必須采用更為科學(xué)、先進與創(chuàng)新的農(nóng)作物育種新技術(shù)。 通過以上體細胞雜交技術(shù)在國內(nèi)外農(nóng)作物育種上開

13、發(fā)應(yīng)用進展情況的介紹，可以充分肯定，該項技術(shù)不僅可以打破種間雜交障礙，還可以擴大物種雜交范圍，提高物種變異頻率，縮短育種周期，拓寬育種領(lǐng)域，提高育種水平。尤其是國內(nèi)外不同性能的體細胞融合儀的研制成功，為該項技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用提供了更為先進的儀器設(shè)備，創(chuàng)造了更為有利的條件。因此可以預(yù)測并展望，在未來加速農(nóng)作物育種與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的進程中，體細胞雜交育種技術(shù)必將具有更為廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。6 參考文獻:1 肖尊安, 沈德緒, 林伯年. 美味獼猴桃子葉愈傷組織的原生質(zhì)體培養(yǎng)和再生植株 J . 武漢植物學(xué)研究, 1993, 11 (3) :247 - 251.2 張遠記, 母蝎金, 蔡起貴, 等. 毛花獼猴

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