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免疫沉淀技術(shù) 免疫沉淀技術(shù) 免疫沉淀反應(yīng)定義免疫化學(xué)基礎(chǔ)免疫沉淀技術(shù)分類免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用 免疫沉淀技術(shù) 免疫沉淀反應(yīng)定義免疫化學(xué)基礎(chǔ)免疫沉淀技術(shù)分類免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用 免疫沉淀反應(yīng) 可溶性抗原與相應(yīng)抗體在液相或凝膠中特異性結(jié)合后 形成的免疫復(fù)合物在一定條件下出現(xiàn)的蛋白質(zhì)析出現(xiàn)象 與凝集反應(yīng) 中和反應(yīng) 補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)并稱經(jīng)典免疫學(xué)技術(shù) 免疫沉淀技術(shù) 免疫沉淀反應(yīng)定義免疫化學(xué)基礎(chǔ)免疫沉淀技術(shù)分類免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用 沉淀反應(yīng)原理 沉淀原 precipitinogen 沉淀素 precipitin 抗原抗體間的力 疏水性的改變電荷的改變分子量及結(jié)構(gòu)的改變 沉淀的發(fā)生 抗原的價(jià) 抗體的價(jià) IgG IgA IgD和IgE類抗體 兩價(jià)分泌型IgA 四價(jià)IgM類抗體 十價(jià) 親和力和親合力 affinity avidity 抗原抗體反應(yīng)的特異性 特異性的物質(zhì)基礎(chǔ) epitope 交叉反應(yīng) 交叉反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ) 1 抗原異質(zhì)性 antigenheterogeneity 2 共同抗原決定簇 commonantigenicdeterminant 3 決定簇相似 共同抗原的類型 1 同種抗原2 嗜異性抗原 又稱Forssman抗原 抗原抗體反應(yīng)的最適比例 抗原抗體反應(yīng)的階段性 抗原抗體結(jié)合階段2 抗原抗體反應(yīng)階段 抗原抗體反應(yīng)的影響因素 1 中性鹽的作用2 pH3 溫度4 離子強(qiáng)度 中性鹽的作用 加入高濃度鹽 如硫酸銨 以脫水 或者用分子量大約6000 濃度3 4 聚乙二醇 PEG6000 以其多聚物孔隙排阻脫水來(lái)大大降低抗原抗體復(fù)合物的溶解度 pH值 盡可能調(diào)節(jié)pH至復(fù)合物的等電點(diǎn)附近 通常此pH值是介于IgG等電點(diǎn) 約pH 7 和抗原等電點(diǎn)之間 也依賴于抗原與抗體的比例 溫度 溫度與抗原抗體反應(yīng)有密切的關(guān)系溫度升高可促使分子運(yùn)動(dòng)加快 抗原與抗體碰撞機(jī)會(huì)多 容易結(jié)合 但也容易再解離 溫度低 分子運(yùn)動(dòng)慢 撞擊機(jī)會(huì)少 但一旦結(jié)合后則不易再分開(kāi) 離子強(qiáng)度 1 有利于抗原抗體結(jié)合的條件 中等或較低離子強(qiáng)度 2 有利于抗原抗體解離的條件 高離子強(qiáng)度 免疫沉淀技術(shù) 免疫沉淀反應(yīng)定義免疫化學(xué)基礎(chǔ)免疫沉淀技術(shù)分類免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用 沉淀反應(yīng)的種類 1 溶液中沉淀反應(yīng)2 凝膠中沉淀反應(yīng) 溶液中沉淀反應(yīng) 是指在清徹透明的液體中 呈溶解狀態(tài)的抗原與抗體在試管內(nèi)或凹玻片上混勻 可凝聚成為肉眼可見(jiàn)的絮狀或顆粒狀的不溶性沉淀物 絮狀沉淀試驗(yàn) 康氏反應(yīng) Kahn stest 心肌提取的類脂質(zhì)抗原 反應(yīng)素 Aegagin 敏感性高 特異性差 易出現(xiàn)假陽(yáng)性 1991年首批淘汰 性病研究實(shí)驗(yàn)室法 venerealdiseaseresearchlaboratory VDRL 心擬脂及卵磷酯 反應(yīng)素 Aegagin 不需加熱的血清反應(yīng)素試驗(yàn) unheatedserumreagin 心擬脂及卵磷酯 氯化膽堿 反應(yīng)素 Aegagin 反應(yīng)最適比測(cè)定 1 抗原稀釋法 Dean Webb法 2 抗體稀釋法 Ramon法 3 方陣法或棋盤格滴定法 checkerboardtitration 環(huán)狀沉淀試驗(yàn) ringprecipitationtest Ascoli于1902年建立用于檢查獸類內(nèi)臟 毛皮浸液等標(biāo)本中的炭疽桿菌抗原 優(yōu)點(diǎn) 校正曲線穩(wěn)定 簡(jiǎn)便快速 易于自動(dòng)化 無(wú)放射性核素污染缺點(diǎn) 特異性 靈敏度稍差 免疫比濁法的分類 1 透射比濁法 transmissionturbidimetry 2 散射比濁法 nephelometry 3 免疫膠乳濁度測(cè)定法 immunolatexturbidimetry 4 速率抑制免疫比濁法 rateinhibitionimmunoturbidimetry 免疫沉淀技術(shù) Immunoprecipitationassay 關(guān)鍵因素 抗原的豐度抗體的結(jié)合能力蛋白和抗體的可接觸性 應(yīng)用范圍 免疫共沉淀技術(shù) Co Immunoprecipitationassay 結(jié)果分析 NatImmunol 2008Apr 9 4 369 77 GSTPULLDOWN 結(jié)果分析 PNASFebruary26 2008vol 105no 82836 2841 應(yīng)用范圍 尋找新的相互作用蛋白驗(yàn)證目的蛋白和待測(cè)蛋白是否有相互作用 免疫共沉淀的局限性 1 難以檢測(cè)低親和力和短暫的相互作用 2 不能夠確切分辨第三種蛋白的橋聯(lián)作用 3 靈敏度不如親和色譜高 4 需對(duì)未知蛋白的相關(guān)信息有一定了解 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 染色質(zhì)免疫共沉淀 染色質(zhì)免疫共沉淀 結(jié)果分析 MolCancerTherJune2010vol 9no 61764 1774 RNA免疫沉淀 在生理狀態(tài)下對(duì)結(jié)合在RNA上的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫沉淀 然后通過(guò)基因芯片或者其它手段檢測(cè)目的RNA的含量 應(yīng)用范圍 研究蛋白與DNA的動(dòng)態(tài)作用研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)之間的關(guān)系研究蛋白與RNA的相互作用 免疫沉淀中抗體的選擇 免疫共沉淀技術(shù)的應(yīng)用 凝膠中沉淀反應(yīng) 以一定濃度 1 2 的瓊脂 或瓊脂糖 凝膠作為介質(zhì) 將抗原 抗體溶液分別放在瓊脂凝膠板上并使它們彼此在凝膠中自由擴(kuò)散 形成濃度梯度 當(dāng)抗原與抗體相遇且比例適當(dāng)時(shí) 在相應(yīng)位置即可出現(xiàn)可見(jiàn)的沉淀環(huán)或沉淀線 沉淀線特點(diǎn) 形成沉淀線的特異性抗原抗體無(wú)法通過(guò)沉淀線 只能在沉淀線周圍形成沉淀與沉淀線無(wú)關(guān)的抗原和抗體分子則可以自由通過(guò)沉淀線的位置與抗原抗體的濃度和遷移率有直接關(guān)系 單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn) singleimmunodiffusion 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) doubleimmunodiffusion 沉淀線分析 沉淀線分析 免疫電泳 immunoelectrophoresis 對(duì)流免疫電泳 counterimmunoelectrophoresis 火箭免疫電泳 rocketimmunoelectrophoresis 交叉免疫電泳 crossedimmunoelectrophoresis 免疫固定電泳 immunofixationelectrophoresis 首先將蛋白質(zhì)抗原進(jìn)行電泳分離 電泳后直接將抗體加于蛋白質(zhì)區(qū)帶表面 抗體與對(duì)應(yīng)的抗原就會(huì)直接結(jié)合 形成的復(fù)合物嵌于固相支持物中 UrineImmunofixationElectrophoresis 免疫印跡技術(shù) immunoblotting 基本流程 一 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS PAGE 1 收集蛋白樣品 貼壁細(xì)胞 組織 藥物處理細(xì)胞2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 BCA3 電泳 10 分離膠 4 的濃縮膠