一節(jié)免疫細(xì)胞的分類與分離.ppt

免疫細(xì)胞的分離與檢測(cè),第一節(jié) 免疫細(xì)胞的分類與分離,一、免疫細(xì)胞的種類與特征 二、免疫細(xì)胞的分離技術(shù) 三、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,免疫細(xì)胞的特征,1、免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征 理化性狀 生物學(xué)特性 2、免疫細(xì)胞的膜分子特征 CD分子,免疫細(xì)胞的起源與分化,紅細(xì)胞 血小板 肥大細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 漿細(xì)胞 T細(xì)胞 NK細(xì)胞,免疫細(xì)胞的分離技術(shù),1、密度梯度離心法 2、黏附分離法 3、熒光激活分離法 4、磁性分離法 5、其他分離法,密度梯度離心法,離心前,離心后,稀釋抗凝血,淋巴細(xì)胞分離液,血漿,單個(gè)核細(xì)胞,粒細(xì)胞,紅細(xì)胞,沉降速度 =,2r2（QQ0）,9 ,x g,Q =顆粒比重 Q0 =溶質(zhì)比重 r =顆粒半徑 = 形狀因子 = 顆粒摩擦系數(shù)/同體積球型顆粒摩擦系數(shù) = 粘稠度 g = 相對(duì)離心力,人類血液有形成分的平均密度與直徑,密度 直徑（） 血小板 1.041.06 淋巴細(xì)胞 1.061.08 810 粒細(xì)胞 1.081.09 13 紅細(xì)胞 1.091.10 7.5,黏附分離法,尼龍毛法 貼壁法 親和板法 吸附柱法,熒光激活分離法（FACS）,熒光檢測(cè)器,濾光片,透鏡,接物鏡,激光束,偏轉(zhuǎn)板,噴嘴,細(xì)胞收集管,流體護(hù)套,樣品,流式細(xì)胞儀,磁性分離法,磁鐵吸引法 磁式細(xì)胞分類術(shù)法,MACS (陽性選擇法）,N,S,MACS (陰性選擇法）,N,S,其他分離法,花環(huán)沉降法 細(xì)胞活化克隆法 MHC分子四聚體法,抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù),細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇,細(xì)胞凍存的原理與方法 細(xì)胞復(fù)蘇的原理與方法,細(xì)胞凍存罐,第二節(jié) 免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè),一、免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類型 二、免疫細(xì)胞膜分子的檢測(cè)方法,免疫細(xì)胞膜分子檢測(cè)的原理與類型,1、以抗體識(shí)別抗原 2、以配體識(shí)別受體,免疫細(xì)胞膜分子的主要檢測(cè)方法,1、免疫標(biāo)記檢測(cè)方法 熒光抗體法 酶免疫檢測(cè)法 免疫金銀染色法 2、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC） 3、花環(huán)形成試驗(yàn),SmIg的熒光抗體檢測(cè)法,SmIg的酶免疫檢測(cè)法,補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）,染料,補(bǔ)體,E-花環(huán),T細(xì)胞,B細(xì)胞,花環(huán)形成細(xì)胞,綿羊紅細(xì)胞,EA-花環(huán),EAC-花環(huán),第三節(jié) 免疫細(xì)胞功能測(cè)定,一、轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn) 二、細(xì)胞毒試驗(yàn) 三、抗體形成試驗(yàn) 四、細(xì)胞吞噬與殺傷試驗(yàn),1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 2、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),轉(zhuǎn)化、增殖試驗(yàn),放射性測(cè)定,3H-TdR,絲裂原（抗原）刺激,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理示意,1、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn) 2、NK活性測(cè)定 3、ADCC作用測(cè)定,細(xì)胞毒檢測(cè)試驗(yàn),放射性測(cè)定,細(xì)胞毒試驗(yàn)原理示意,靶細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞,分離上清,1、直接溶血空斑試驗(yàn) 2、間接溶血空斑試驗(yàn) 3、SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn),抗體形成試驗(yàn),直接溶血空斑試驗(yàn),間接溶血空斑試驗(yàn),SPA-SRBC溶血空斑試驗(yàn),1、細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn) 2、細(xì)胞殺菌功能試驗(yàn),細(xì)胞吞噬與殺傷功能試驗(yàn),吞噬百分率 =,吞有顆粒的吞噬細(xì)胞數(shù),計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù),吞噬指數(shù) =,吞噬細(xì)胞吞噬的總顆粒數(shù),計(jì)數(shù)的吞噬細(xì)胞數(shù),NBT還原試驗(yàn),原理：,N-N- C + H+ N=N-R-,N-NH2 C N=NH,四氮唑基（淡黃色）,甲月簪基（紫黑色）,NBT還原試驗(yàn),方法：,1、抗凝血 + 硝基藍(lán)四氮唑（NBT），37。C孵育25min。 2、推片染色、鏡檢。,正常值：,NBT陽性細(xì)胞 7.5-15%,第四節(jié) 免疫細(xì)胞凋亡測(cè)定,一、細(xì)胞凋亡的概念與原理 二、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法,細(xì)胞凋亡的概念與原理,1、細(xì)胞凋亡的概念 2、細(xì)胞凋亡的原理 3、細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),細(xì)胞凋亡（apoptosis）,細(xì)胞在內(nèi)源性基因調(diào)控下發(fā)生的主動(dòng)死亡過程，也稱程序性死亡。,細(xì)胞凋亡的過程,凋亡信號(hào)凋亡受體信號(hào)傳導(dǎo)凋亡基因啟動(dòng)編碼程序性死亡蛋白細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡機(jī)制,細(xì)胞凋亡的特點(diǎn),1、細(xì)胞皺縮 2、染色質(zhì)邊集 3、凋亡小體出現(xiàn),細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法,1、形態(tài)觀察法 2、生化檢測(cè)法 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法,形態(tài)觀察法,普通光鏡檢測(cè)HE染色 甲基綠-派諾寧染色 熒光顯微鏡檢測(cè)溴化丙錠染色 透射電鏡檢測(cè)典型形態(tài)改變,生化檢測(cè)法,凝膠電泳法 原位末端標(biāo)記法 二苯胺分光光度法,凝膠電泳法,原理：斷裂DNA在凝膠中呈梯形排列 （DNA ladder） 方法：提取總DNA DNA凝膠電泳 觀察DNA ladder現(xiàn)象,原位末端標(biāo)記法（TUNEL）,原理：利用標(biāo)記的dUTP，在TdT作用 下結(jié)合DNA斷片的3末端羥基， 顯示斷鏈DNA，提示凋亡 方法：制備組織切片 標(biāo)記物結(jié)合 標(biāo)記物顯色 鏡檢,二苯胺分光光度法,原理：細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生低分子量DNA，通過超速離心可與細(xì)胞核的高分子量DNA分離，分別測(cè)定兩種DNA，即可得出凋亡百分率。 方法：裂解細(xì)胞 13000g超速離心 分別提取DNA 使DNA顯色，測(cè)定,凋亡百分率 =,上清液OD值,上清液OD值+沉淀OD值,流式細(xì)胞儀法,原理：PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞，通過FACS可 顯示凋亡細(xì)胞的特征性亞二倍