乳酸脫氫酶ldh試劑盒對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞毒性

乳酸脫氫酶ldh試劑盒對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的細胞毒性

血管內(nèi)皮細胞的損傷和功能異常與動脈樣硬化（as）密切相關(guān)。過度死亡被認為是內(nèi)皮細胞過度死亡的最初環(huán)節(jié)。H2O2被認為是引起血管損傷的首要成分,它在代謝過程中產(chǎn)生活性氧和自由基,引起血管內(nèi)皮發(fā)生氧化損傷而導(dǎo)致細胞凋亡,促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。高血糖則能夠引起葡萄糖及糖化蛋白發(fā)生自身氧化,抗氧化能力下降,發(fā)生氧化應(yīng)激,引起內(nèi)皮細胞膜脂質(zhì)過氧化,從而導(dǎo)致內(nèi)皮細胞膜功能障礙和內(nèi)皮功能紊亂。因此,防止血管內(nèi)皮細胞氧化損傷是防治血管性疾病發(fā)生的重要手段,且對改善心血管等疾病具有積極意義。王不留行為石竹科植物麥藍菜Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟種子,藥典記載其具有活血痛經(jīng),下乳消腫,利尿通淋的作用,用于經(jīng)閉,痛經(jīng),乳汁不下,乳癰腫痛,淋證澀痛。文獻報道王不留行中含多種皂苷、黃酮苷、環(huán)肽、類脂、脂肪酸、單糖、生物素及香豆素類化合物等成分。王不留行黃酮苷(vaccarin)是從王不留行中提取出來的一種黃酮三糖苷,為淡黃色顆粒狀結(jié)晶,易溶于甲醇、甲醇-水、乙醇、乙醇-水、正丁醇等,難溶于氯仿、乙酸乙酯、石油醚等,結(jié)構(gòu)如圖1所示。目前,王不留行黃酮苷在心血管系統(tǒng)方面的研究尚處于空白階段,本研究以H2O2和高糖建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷模型,探討王不留行黃酮苷對其保護的作用。為保護內(nèi)皮細胞的相關(guān)疾病提供新的治療方法與應(yīng)用。探討其是否可開發(fā)成為新的治療血管性疾病的藥物。1材料和機器1.1試劑與儀器王不留行黃酮苷,純度>98%,購自上海士峰生物科技有限公司;胎牛血清(GibcoBRL公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(cellgro,美國Mediatech公司);青霉素(華北制藥股份有限公司),鏈霉素(大連美羅大藥廠);磺酰羅丹明B(SRB)試劑(美國Sigma公司);葡萄糖(國藥集團);維生素C(國藥集團);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號:20130620)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號:20130608)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號:20130618)、BCA試劑盒(批號:20130619)均購自南京建成生物工程研究所。CO2細胞培養(yǎng)箱(ThermoForma公司,型號:SY18-WJ2/3);紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司,型號:UV-2100);自動酶標(biāo)儀(Labsystem公司,型號:MultiskanMK3);分析天平(METTLERTO-LEDO,型號:AL104);超凈工作臺(青島丹佳凈化設(shè)備有限公司,型號:SW-CJ-IF)。1.2細胞植物人臍靜脈內(nèi)皮細胞(EA·hy926)由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。2實驗方法2.1dmem傳代培養(yǎng)EA·hy926細胞用含1mmol/L谷氨酰胺,100U/L雙抗和100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,于37℃,50mL/LCO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。2.2黃酮苷釋放量測定選擇對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化制成細胞懸液,按每孔1×105個接種于24孔板,每孔接種450μL,24h后隨機分成4組:除正常對照組加入50μL無血清培養(yǎng)基外,3個給藥組分別加入相應(yīng)濃度等體積王不留行黃酮苷藥液,使藥物終濃度分別為13.76、6.88、3.44μmol/L,每組設(shè)3個復(fù)孔,37℃孵育12h后,取上清液,按照試劑盒方法測定LDH釋放量。2.3黃酮類化合物不會對b22和aeh12細胞的損傷產(chǎn)生影響2.3.1各組細胞活力檢測選擇對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化制成細胞懸液,調(diào)整細胞濃度,按每孔8000個細胞接種于96孔板,每孔接種160μL,每組設(shè)4個復(fù)孔,24h后隨機分6組:正常組和模型組加入20μL無血清培養(yǎng)基,陽性對照組加入終濃度為100μmol/L的維生素C溶液(溶于無血清培養(yǎng)基中),3個給藥組分別加入相應(yīng)濃度等體積王不留行黃酮苷的藥液,使藥物終濃度分別為13.76、6.88、3.44μmol/L,于37℃孵育預(yù)保護12h后,模型組、維生素C組和王不留行黃酮苷組每孔加入20μLH2O2,其終濃度為1000μmol/L,正常對照組加入20μL無血清培養(yǎng)基,于37℃孵育2h后,SRB法檢測細胞活力。2.3.2模型設(shè)和給藥回復(fù)突變實驗mda和ldh選擇對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化制成細胞懸液,調(diào)整細胞濃度,按每孔4×104個接種于24孔板,每孔接種800μL,每組設(shè)3個復(fù)孔,24h后隨機分6組:正常組和模型組加入100μL無血清培養(yǎng)基,陽性對照組加入終濃度為100μmol/L的維生素C溶液100μL,三個給藥組分別加入相應(yīng)濃度等體積王不留行黃酮苷藥液,使藥物終濃度分別為13.76、6.88、3.44μmol/L,于37℃孵育預(yù)保護12h后,除正常組加入100μL無血清培養(yǎng)基外,模型組、維生素C組和王不留行黃酮苷組每孔加入100μLH2O2,其終濃度為1000μmol/L,正常對照組加入100μL無血清培養(yǎng)基,于37℃孵育2h后,取細胞上清液測定LDH和MDA的釋放量;裂解細胞,BCA法測定蛋白含量,測定胞內(nèi)SOD活力。2.4黃酮類化合物對高糖的誘導(dǎo)作用于aeh122.4.1模型,分組,給藥,定功選擇對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化制成細胞懸液,調(diào)整細胞濃度,按每孔8000個細胞接種于96孔板,每孔接種160μL,24h后隨機分6組:正常組和模型組加入20μL無血清培養(yǎng)基,陽性對照組加入終濃度為100μmol/L的維生素C溶液(溶于無血清培養(yǎng)基中),3個給藥組分別加入相應(yīng)濃度等體積王不留行黃酮苷的藥液,使藥物終濃度分別為13.76、6.88、3.44μmol/L,于37℃孵育預(yù)保護12h后,模型組、維生素C組和王不留行黃酮苷組每孔加入20μL葡萄糖(終濃度180mmol/L),正常對照組加入20μL無血清培養(yǎng)基,每組設(shè)4個復(fù)孔,37℃孵育24h后,SRB法檢測細胞活力。2.4.2各組大鼠細胞內(nèi)sod活性的檢測選擇對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化制成細胞懸液,調(diào)整細胞濃度,按每孔為8×104個接種于24孔板,每孔接800μL,每組設(shè)3個復(fù)孔,24h后,隨機分6組:正常組和模型組加入20μL無血清培養(yǎng)基,陽性對照組加入終濃度為100μmol/L的維生素C溶液(溶于無血清培養(yǎng)基中),3個給藥組分別加入相應(yīng)濃度等體積王不留行黃酮苷的藥液,使藥物終濃度分別為13.76、6.88、3.44μmol/L,于37℃孵育預(yù)保護12h后,模型組、維生素C組和王不留行黃酮苷組每孔加入20μL葡萄糖(終濃度180mmol/L),正常對照組加入20μL無血清培養(yǎng)基,于37℃孵育24h后,取細胞上清液測定LDH和MDA的釋放量,裂解細胞,BCA法測定蛋白含量,測定胞內(nèi)SOD活力。2.5統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)均以ue0af±s表示,統(tǒng)計處理采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件,兩組間均數(shù)比較用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果與討論3.1黃酮類化合物對正常aeh126細胞的ldh釋放量的影響加藥孵育12h后,與正常對照組比較,王不留行黃酮苷各濃度對細胞LDH釋放量無明顯影響,見表1。3.2黃酮類化合物對b282、hy926細胞損傷模型的影響3.2.1對h0誘導(dǎo)的細胞活力的影響與正常組比較,模型組細胞活力顯著下降(P<0.01);而與模型組比較,陽性對照組(維生素C)與王不留行黃酮苷的高劑量組對H2O2誘導(dǎo)的細胞活力有明顯改善(P<0.01),而王不留行黃酮苷中、低劑量組對細胞活力沒有改善作用。見表2。3.2.2對ldh的釋放量有與正常組比較,模型組LDH和MDA水平顯著升高(P<0.01),SOD活性顯著下降(P<0.01);而與模型組比較,維生素C組與王不留行黃酮苷中、高劑量組LDH釋放量顯著下降(P<0.01);而在MDA水平上,維生素C組和王不留行黃酮苷給藥組均能使之顯著降低(P<0.01);SOD活性中,維生素C組和王不留行黃酮苷高劑量組均能使之顯著升高(P<0.05),見表3。3.3黃酮類化合物對高糖誘導(dǎo)aehy926細胞損傷模型的影響3.3.1各組eahy626細胞活力比較與正常組比較,模型組細胞活力顯著下降(P<0.01);而與模型組比較,維生素C組與王不留行黃酮苷中、高劑量組對高糖誘導(dǎo)的EA·hy926細胞活力有明顯改善(P<0.05或P<0.01),見表4。3.3.2維生素c對王不留行黃酮苷高劑量對大鼠ldh和mda的影響,0.與正常組比較,模型組LDH和MDA水平顯著升高(P<0.01),SOD活性顯著下降(P<0.05);而與模型組比較,維生素C組與王不留行黃酮苷高劑量組LDH和MDA水平顯著降低(P<0.01),SOD活性顯著升高(P<0.05);同時,王不留行黃酮苷中、低劑量組也可顯著降低細胞的MDA水平(P<0.01),見表5。3.4王不留行黃酮苷對eahy626細胞凋亡的影響內(nèi)皮細胞在管理血管功能和炎癥的生理學(xué)和病理生理學(xué)方面的發(fā)展有著關(guān)鍵的作用。內(nèi)皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素,H2O2被認為是引起血管損傷的首要成分。同時,越來越多證據(jù)表明糖尿病也可以引起廣泛的血管并發(fā)癥,而其中之一主要的危險因素是心血管動脈粥樣化。本實驗利用H2O2氧化和高糖損傷EA·hy926細胞造成內(nèi)皮細胞凋亡模型,SRB法檢測其OD值,發(fā)現(xiàn)其細胞活力與正常組對比有顯著差異。王不留行黃酮苷預(yù)處理后可明顯改善細胞活力的下降,顯示王不留行黃酮苷對H2O2和高糖誘導(dǎo)的EA·hy926細胞凋亡具有明顯的抑制作用。H2O2和高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基在許多生物分子方面有著不可逆轉(zhuǎn)的作用,比如脂肪,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物酶。不可控的脂質(zhì)過氧化物酶是一個已知的細胞氧化損傷的臨床表現(xiàn)。LDH泄露,相當(dāng)于膜損傷,MDA,是通過過多的氧自由基(ROS)誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物酶的一個副產(chǎn)物,這兩個都廣泛用于氧化應(yīng)激損傷的生物標(biāo)記。為了防御ROS可能的毒害作用,細胞維持胞內(nèi)抗氧化能力包括結(jié)合SOD和其他內(nèi)源性抗氧化物質(zhì),不僅可以直接給ROS解毒或者間接調(diào)節(jié)它們的水平?？寡趸镔|(zhì)比如SOD在抵御輻射中發(fā)揮著重要作用,在這些特殊細胞中與整個有