分子腫瘤課件

1、 COX-2抑制劑塞來昔布誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制 目的: 探討環(huán)氧合酶-2( cyclooxygenase-2, COX-2)抑制劑塞來昔布(celecoxib) 誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系SMMC7721凋亡的作用及其可能機(jī)制。2方法: 以10、25、50、75、100mol/L的塞來昔布處理SMMC-7721細(xì)胞, MTT法檢測腫瘤細(xì)胞增殖, Hoechst 33342/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征, 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化。RT-PCR 法檢測Fas和Bcl-2mRNA 的表達(dá),Western blotting檢測細(xì)胞Fas和Bcl-2蛋白的表達(dá)。3 環(huán)氧合酶(cycloo

2、xygenase, COX)是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶。目前發(fā)現(xiàn)的環(huán)氧合酶主要有兩種, 即環(huán)氧合酶1(cyclooxygenase-1, COX-1)和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)。其中, COX-2與腫瘤關(guān)系密切。COX-2在肝炎、肝硬化及肝癌組織中均呈高表達(dá), 且COX-2與肝癌的分化程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后均密切相關(guān) 。4 Fas /FasL Fas 介導(dǎo)凋亡先由不同的胞質(zhì)蛋白與受體(FasL)的死亡域結(jié)合，然后連接蛋白即Fas 相關(guān)死亡域蛋白(Fasassociated death domain protein，F(xiàn)ADD)直接與Fas死亡域結(jié)合，F(xiàn)ADD激

3、活上游Caspase(如Caspase 8，10)，進(jìn)而活化下游效應(yīng)Caspase(如Caspase3，7)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。5 Bcl2家族分兩大類，一類是抗凋亡蛋白，主要包括Bcl2，BclXL，Bclw，Mcl1 等; 另一類是促凋亡蛋白，主要包括Bax，Bak，Bad，Bid，BclXS，Bik /Nbk，BNIP3，Bim和Blk等。Bcl2基因及其表達(dá)蛋白可抑制多種組織細(xì)胞的凋亡和延長細(xì)胞壽命，故將其稱為凋亡抑制基因。Bax是與Bcl2共免疫沉淀的蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞色素c 的釋放，激活caspase3蛋白酶，引起細(xì)胞凋亡，因此認(rèn)為bax是重要的促凋亡基因之一。Bax定位于胞質(zhì)溶膠中，自

4、身形成同源二聚體或與Bcl 2形成異源二聚體。研究表明Bcl2 /bax的比值對細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有決定性作用。Bcl2表達(dá)bax表達(dá)時，Bcl2與Bax的異源二聚體增多，細(xì)胞趨于存活; Bcl2 表達(dá)bax表達(dá)時，則Bax本身形成同源二聚體占主導(dǎo)，細(xì)胞趨于凋亡。7方法1. 1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)在含10% 熱滅活小牛血清、100/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的RPM1640培養(yǎng)液中, 于37、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng), 取指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。1.2 MTT法檢測塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞生長的抑制作用 將SMMC-7721細(xì)胞密度調(diào)整至5104/m ,l接

5、種96孔板,每孔100l,培養(yǎng)24 h后分別加入塞來昔布,使終濃度分別為10、25、50、75、100mo l/L。設(shè)對照組(不加藥) 和空白組(培養(yǎng)液中無細(xì)胞),每組設(shè)8個復(fù)孔。在藥物作用24 h時,加入MTT(5mg/ml)20l繼續(xù)培養(yǎng)4h后離心,棄上清,加DMSO150l,避光振蕩15 min, 在全自動酶標(biāo)儀上測定570nm處光密度度(D) 值。生長抑制率(% ) =(對照組D-實驗組D )/(對照組D-空白組D )*100% 。81. 4 Hoechst 33342 /PI 雙熒光染色法檢測塞來昔布作用后SMMC-7721細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變 25、50、100mol/L塞來昔布處

6、理SMMC-7721細(xì)胞24h,收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,移入Eppendorf管中, 用200lPBS懸浮細(xì)胞,加入Hoechst33342/PI染液(1：1) 40l，37染色8 min, 1 000*g離心10 min, 棄上清,用PBS 吹打混勻,涂片,在熒光顯微鏡下觀察并照相。101.5 RT-PCR法檢測塞來昔布作用后SMMC-7721細(xì)胞Fas、Bcl-2基因的表達(dá) 以-actin作為內(nèi)標(biāo);應(yīng)用Omiga2.0設(shè)計Fas、Bcl-2的引物(Fas上游引物為5GACCCAGAATAC-CAAGTGCAGATGTA-3,下游引物為5CT-GTTTCAGGATTTAA GGTT GGA

7、GATT-3,擴(kuò)增產(chǎn)物為296 bp; Bcl-2上游引物為5-CTTCACTTGTGGC-CCAGATAGG-3,下游引物為5-GGTGCCACCTGT-GGTCCACCT-3;擴(kuò)增產(chǎn)物為450 bp)。以25、50、100mol /L塞來昔布處理SMMC-7721細(xì)胞24h,用TRIzo l法提取細(xì)胞總RNA, 以紫外分光光度計測RNA 的含量和純度( RNA 在260 nm 和280nm的光密度比值在1.8 2.0),以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性( 28 S和18 S RNA 條帶比值2.0),11用1g細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 條件如下: 30、10min, 42、30 min,

8、99、5 min, 5、5 min。將上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng), 循環(huán)條件: 預(yù)變性94、2 min,變性94、30s, 退火58、1min, 延伸72、1min。33個循環(huán)后72延伸5 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳, 結(jié)果用凝膠自動成像2000系統(tǒng)掃描,取其積分值作為量化指標(biāo),以特異性基因條帶與-actin基因條帶的積分比值表示樣本的相對量。以3次實驗結(jié)果的均值做統(tǒng)計學(xué)分析。121. 7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有用SPSS12.0軟件處理, 兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗, 多組比較采用單因素方差分析。P 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。142 結(jié)果2.1 塞來昔布對SMMC

9、-7721細(xì)胞生長的抑制作用 10、25、50、75、100mol /L 塞來昔布作用SMMC-7721細(xì)胞24h, 對細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量依賴性, 細(xì)胞生長抑制率分別為( 6.980.61)% 、(32.612.42)% 、(50.424.15 )% 、(68. 146. 50)% 和(88. 157. 15)%。塞來昔布作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h的半數(shù)抑制劑量約為50mol / L。15172. 3 塞來昔布濃度依賴性誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(圖2、表1)顯示, 25、50、100mo l /L 塞來昔布處理SMMC-7721細(xì)胞24

10、h即可明顯誘導(dǎo)凋亡, 隨藥物濃度增加, 細(xì)胞凋亡率也顯著增加; 細(xì)胞周期隨藥物濃度增加也發(fā)生明顯改變, 其中G0 /G1 期細(xì)胞比例明顯增加, G2 /M 期細(xì)胞比例逐漸減少, 可見細(xì)胞被阻滯于G0 /G1 期。1819202. 4 塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞Fas、Bcl-2基因表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果(圖3、表2)顯示, 不同濃度塞來昔布作用細(xì)胞24 h后, Bcl-2 mRNA 表達(dá)強(qiáng)度無明顯改變; 25mol/L塞來昔布作用24 h后, Fas mRNA表達(dá)即顯著增加(P 0.05), 而100mol/L塞來昔布可明顯降低Bcl-2 蛋白表達(dá)強(qiáng)度(P 0. 01)。25mol

11、/L、50mol/L和100mol/L塞來昔布作用于SMMC7721細(xì)胞24 h后, Fas蛋白表達(dá)強(qiáng)度較對照組均明顯升高(P 0.01)。2425討論 近期的研究表明：COX-2抑制劑具有抗腫瘤作用, 其具體機(jī)制包括抗血小板作用、抑制瘤組織血管生成 、 抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，COX-2抑制劑以上作用的機(jī)制均通過COX-2途徑來實現(xiàn)。 COX-2抑制劑對多種人類腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用, 如前列腺癌、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞, 但對其分子機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究仍然較少, 值得進(jìn)一步研究。27 在我們觀察的這個實驗中，選用人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721為靶細(xì)胞, 探討了COX-2抑

12、制劑塞來昔布對肝癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制。 而塞來昔布作為一種臨床常用的藥物，價格并不昂貴，對于臨床來講，有著良好的應(yīng)用前景。28 本實驗顯示, 塞來昔布對SMMC-7721具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用, 25mo l/L 的塞來昔布作用于SMMC-7721后即出現(xiàn)染色體濃集、細(xì)胞皺縮、凋亡小體形成等凋亡特征, 且隨藥物濃度增高, 出現(xiàn)部分細(xì)胞壞死, 而細(xì)胞增殖率明顯下降。29 為進(jìn)一步探討塞來昔布對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,本研究選擇了與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的Fas和Bcl-2為靶分子, 檢測塞來昔布作用對細(xì)胞內(nèi)F as和B cl-2基因表達(dá)與蛋白表達(dá)的改變。 目前認(rèn)為, 細(xì)胞凋亡途

13、徑可分為依賴于caspase途徑和非依賴caspase途徑 , 而前者又分為細(xì)胞凋亡的外在途徑和細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑。30關(guān)于Fas和Bcl-2 Fas又稱作APO-1/CD95, 屬TNF受體家族, 是細(xì)胞最基本的死亡配體之一, 主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的外在途徑。在腫瘤細(xì)胞中, Fas表達(dá)下調(diào)且對其特異性配體敏感性下降, 使腫瘤細(xì)胞得以逃避凋亡程序的啟動。 Bcl-2家族是最重要的凋亡調(diào)節(jié)因子之一, 其中Bcl-2是主要的抗凋亡和促凋亡成員, 它通過改變線粒體膜通透性來調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。在細(xì)胞中Bcl-2主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑, 在許多腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá)。31塞來昔布對Fas-2的影響 本研究發(fā)現(xiàn), 利用塞來昔布干預(yù)肝癌SMMC-7721 細(xì)胞24 h后, 細(xì)胞內(nèi)Fas mRNA 及蛋白表達(dá)明顯提高, 呈濃度依賴性, 提示塞來昔布可能通過上調(diào)Fas蛋白表達(dá),增加細(xì)胞對凋亡信號的敏感性, 并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的外在途徑來啟動凋亡程序, 從而達(dá)到其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。32塞來昔布對Bcl-2的影響 RT-PCR 實驗發(fā)現(xiàn), 不同濃度的塞來昔布對Bcl-2mRNA 表達(dá)無顯著影響; Western blotting 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 25及50mol/L塞來昔布對Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯影響, 但100 mol/L的塞來昔布可下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。提