毛細管電泳原理及分析策略ppt課件

1、毛細管電泳分別原理及分析戰(zhàn)略貝克曼高效毛細管電泳儀毛細管電泳是帶電粒子在電場力的驅動下，在毛細管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進展高效、快速分別的電泳新技術，也稱為高效毛細管電泳(Capillary Electrophoresis, CE)。 毛細管電泳的原理1 安裝 毛細管 數(shù)據(jù)處置 電極 檢測器 電極 試樣 緩沖液 高壓電源 可高至30KV 2 電泳和電滲 電泳是指在電場作用下，溶液中的帶電粒子作定向挪動的景象。電滲是指在電場作用下，毛細管或固相多孔物質內液體沿固體外表挪動的景象。 2 電泳和電滲 電泳行為與特性運用淌度描畫 即單位場強(E)下離子的平均電泳速度 ep=/E實驗中，只發(fā)生電泳時

2、有效淌度 ef =ef (L /V) =( l / tm )(L /V) 毛細管有效長度 遷移時間 毛細管總長度 電壓 2 電泳和電滲 電滲與固液界面的雙電層有著親密的關系 在毛細管壁雙電層的分散層中的陽離子，相對于毛細管壁的負電荷外表，構成一個圓筒形的陽離子鞘，在電場作用下，溶劑化了的陽離子，沿滑動面與嚴密層作相對運動，攜帶著溶劑一同向陰極遷移，便構成了電滲流electroosmotic flow ,EOF。 固液兩相間的總電勢-熱力學電勢-0 Zeta電勢- 2 電泳和電滲 電滲流的流型特點電滲流 HPLC塞流 層流 2 電泳和電滲 電滲流的表示電滲流的大小可用淌度(eo)或電滲流系數(shù)表示

3、 eo =eo / E = l /( teoE )電滲流速度 毛細管有效長度 電滲流流出時間 電場強度 第22章 毛細管電泳 221 毛細管電泳的原理2 電泳和電滲 電滲流的意義電泳過程中，伴隨著電滲景象電滲流的速度比電泳速度快57倍利用電滲流可將正、負離子或中性分子一同向同一方向，產(chǎn)生差速遷移，在一次電泳操作中同時完成正、負離子的分別分析電滲流是毛細管電泳分別的重要參數(shù)控制電滲流的大小和方向，可提高毛細管電泳分別的效率、重現(xiàn)性、分別度。 分情況而論2 電泳和電滲 改動電滲流的方法改動外加徑向電場改動緩沖液成分和濃度 Zeta電勢改動緩沖液pH參與添加劑改動溫度 粘度 鹽-離子強度外表活性劑e

4、o正比于Zeta電勢和介質的介電常數(shù) 反比于介質的黏度Zeta電勢正比于雙電層厚度和界面有效電荷密度 反比于介質的介電常數(shù)表觀電泳淌度 apap=ap/E ap為離子的表觀遷移速度 ap=ef +eo ap= ef + eo2 電泳和電滲 3 分別效率和分別度 分別效率柱效可以用實際塔板數(shù)n表示 n = (ep+eo) V l /(2DL) 毛細管電泳分別的柱效方程 實際塔板高 H =L / n n = 5.54(/ W)2 實驗上可按上式求出實際塔板數(shù) 為電泳圖上從起點至電泳峰最大值之間的間隔 W為電泳峰的半頂峰寬 3 分別效率和分別度 分別度電泳中兩峰的分別度Rs，也稱為分辨率，它表示了淌

5、度相近的組分分開的才干，可表達為 Rs= n 1/2/4 /平 相鄰兩區(qū)帶的遷移速度差平為兩者的平均速度 / 平表示分別選擇性n為柱效分別度計算式Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 )tm1、tm2 分別為兩個組份的遷移時間W 為峰底的寬度3 分別效率和分別度 4 區(qū)帶寬度及其展寬要素 區(qū)帶寬度展寬要素 焦耳熱 進樣電泳分散毛細管壁對組分的吸附 焦耳熱 細內徑100m，粗外徑的毛細管柱 溫度輪廓 - 黏度輪廓 -速度輪廓4 區(qū)帶寬度及其展寬要素 進樣 試樣導入毛細管柱時，總有一定的試樣區(qū)帶長度。 細內徑的毛細管柱時，進樣操作的要求更為嚴厲。 普通進樣區(qū)帶控制在柱長的

6、1%電泳分散 試樣區(qū)帶中的緩沖溶液濃度或電阻率與毛細管其它地方的濃度或電阻率不相等時，因兩個區(qū)域電場強度的差別，而引起區(qū)帶電分散。 s-b 峰前展或拖尾？4 區(qū)帶寬度及其展寬要素 毛細管壁對組分的吸附 電泳峰拖尾或變形，甚至消逝。抑制吸附作用常用的方法有： 運用極端pH條件 參與中性鹽或兩性離子化合物 對毛細管內壁進展涂層處置 需求留意：方法也會抑制或改動電滲流 4 區(qū)帶寬度及其展寬要素 CE分別原理-與方式有關毛細管區(qū)帶電泳CZE毛細管膠束電動色譜MECC/MCKC毛細管凝膠電泳CGE毛細管等電聚焦cIEF親和毛細管電泳ACE毛細管電色譜CEC第一章 毛細管區(qū)帶電泳樣品在電解液中泳動,根據(jù)物

7、質的荷/質比差別來進展分別，比值愈大,跑得愈快進樣方式壓力進樣電動進樣濃縮進樣毛細管種類非涂層毛細管裸管內壁涂層毛細管涂層管非涂層毛細管-電滲流的概念- H+高pH低pH電滲流的特點EOF-+純電泳形狀-+EOF電泳+電滲流0tm (min)電滲流的作用電滲流的活塞流特點Hydrodynamic flowParabolicResistance to flow at surfaceMore diffusion/broader detection zoneEOF gives plug flowMinimizes band broadeningNarrows detection zoneHydrod

8、ynamic flowParabolicResistance to flow at surfaceMore diffusion/broader detection zoneEOF gives plug flowMinimizes band broadeningNarrows detection zone電滲流的活塞流特點電滲流是CE中最大的驅動力來源之一電滲流的正面及負面作用正面作用添加分別速度使得正、負電荷物質同時分別負面作用減少分別時間和分別有效間隔電滲流的動搖極大的影響了遷移時間的反復性影響電滲流的要素pH值 pH越高，電滲流越大離子強度 離子強度越高，電滲流越小緩沖溶液添加劑 離子型外

9、表活性劑、有機溶劑、環(huán)糊精電滲流隨pH的變化情況控制電滲流的三個重要手段采用涂層毛細管，消除電滲流的影響改動pH，從而調整電滲流的大小。pH10以后，電滲流根本不添加添加劑：有機溶劑可以降低電滲流的大小，從而添加分別的有效間隔；外表活性劑可以徹底改動電滲流的方向和大小，主要是在陰離子分析時運用緩沖溶液的影響和選擇在CE中應該根據(jù)以下性質來選擇緩沖溶液：在所選的pH范圍內有較強緩沖才干；在檢測波優(yōu)點有低的紫外吸收；小的淌度即大體積、低電荷離子以降低所產(chǎn)生的電流。 那些被稱為生物“優(yōu)良緩沖液的，如Tris, borate, CAPS等特別有用，由于這些緩沖溶液中的離子普通較大，可以在較高濃度下運用

10、而不會產(chǎn)生大的電流，但一個潛在的缺陷是這些大的緩沖離子有強的紫外吸收。常用的CE緩沖體系磷酸鈉體系 寬緩沖范圍硼酸鈉體系 高pH范圍Tris-HCl體系 低pH范圍醋酸-醋酸銨體系 CE/MS常用體系CZE分別條件的選擇毛細管類型-涂層還是非涂層？毛細管長度-長毛細管還是短毛細管？緩沖液體系-種類和pH值添加劑類型-甲醇|環(huán)糊精|乙腈檢測器選擇-紫外|二極管陣列|激光誘導熒光緩沖溶液的選擇 可先用磷酸緩沖體系為搜索根底，初步確定最正確pH范圍后，再進一步細選出更好pH和緩沖試劑。磷酸鹽是毛細管電泳中最常用的緩沖體系之一，它的紫外吸收低，pH緩沖范圍比較寬pH=1.513，但電導也比較大。緩沖溶

11、液及pH值的選擇 研討閱歷闡明：對于蛋白質、肽和氨基酸等兩性樣品，采用酸性pH 2或堿性pH9分別條件，比較容易得到好的分別結果；糖類樣品通常在pH=911之間能獲得最正確分別；羧酸或其他樣品多在pH=59之間選擇分別條件。緩沖溶液及pH值的選擇 pH 的選擇也和所用的毛細管種類有關，許多涂層毛細管只能在一定的pH范圍內任務，例如聚丙烯酰胺涂層毛細管，在3pH8的范圍以外任務，其涂層容易水解失效。緩沖溶液及pH值的選擇 在一樣的 pH下，不同緩沖體系的分別效果不盡一樣，有的能夠相差甚遠。普通的閱歷是，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑，有能夠就是最好的試劑。一個典型的例子是，在分別糖類和DNA等分子時

12、優(yōu)先運用硼酸鹽緩沖體系，由于硼酸根能與糖羥基構成配位鍵，從而添加糖的負電荷和分別度。硼酸緩沖試劑也適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分別。緩沖溶液及pH值的選擇 緩沖試劑及pH調理劑的濃度也需求優(yōu)化。緩沖試劑的濃度普通控制在10200 mmol/L之間。電導率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼砂等，其濃度多控制在20 mmol/L附近，而電導小的試劑如硼酸及HEPES等，其濃度可在100 mmol/L以上。有時為了抑制蛋白質吸附等特殊目的，可采用很高0.5mol/L的試劑濃度，此時要留意減少分別電壓，分析速度自然也將隨之降低。添加劑的選擇目的：改善分別抑制分析物在毛細管上的吸附添加劑的選擇甲醇|乙腈5

13、-50%降低電滲流，添加分別有效間隔，從而改善分別效果添加非極性物質的水溶性環(huán)糊精|SDS等外表活性劑添加分別選擇性，提高分析效果降低電滲流，添加分別有效間隔，從而改善分別效果非極性高分子聚合物掩蔽毛細管內壁電荷，抑制分子吸附降低電滲流構成一定的分子篩，提高分子大小選擇性第二章 毛細管膠束電動色譜 電解質中參與外表活性劑(surfactant，例如SDS)，使之構成膠束Micelle，樣品根據(jù)其疏水性(Hydrophobicity)強弱的差別，在膠束與電解質的分配系數(shù)有所不同來進展分別 ，樣品疏水性愈強，那么進入膠束的時機愈大。通常物質進入膠束后，泳動的速度會變慢，因此疏水性愈強的物質那么愈慢

14、出來。毛細管膠束電動色譜原理SDS-+EOFMicellar Electrokinetic Chromatography (MEKC)七種青霉素的分別CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 膠束電動色譜的特點優(yōu)點添加對弱極性物質分別的分別度在中藥分析、天然產(chǎn)物分析、農(nóng)藥分析中經(jīng)常運用缺陷穩(wěn)定性不佳，到達好的反復性比較困難第三章 毛細管凝膠電泳 毛細管內先填充凝膠(例如polyacrylamide或cellulose)，此時凝膠會在毛細管內構成分子篩，樣品依分子量的大小在毛細管內挪動速度不同而進展分別。主要用于核

15、酸片斷及蛋白分子量分析毛細管凝膠電泳CE雙鏈及單鏈核酸分析45-寡核苷酸質控 1.0 2.0 3.0123456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS21 10.0 15.0Relative Fluorescence IntensitydsDNA片段 (72 bp-12 Kbp)CE-SDS蛋白分子量分析第四章 毛細管等電聚焦第五章 親和毛細管電泳-分別條件基于CZE 當在CZE樣品或緩沖液中引入抗原或抗體時，便可以用于研討和分析抗體或抗原，也可以利用這種方法對電泳峰進展特異性定性。顯然除抗原與抗體的選擇需求運用生化知識外，其

16、他方面的選擇與CZE等一樣。用于研討分子間相互作用測定，分子構型變化特定物質檢測活性物質挑選ACE測定分子間結合常數(shù)與解離速率JAK2與SH2-B之間的相互作用研討CE藥物挑選ACE用于相互作用挑選適體Aptamer類似于抗體，但可以體外合成，結合常數(shù)比抗體更高，有廣泛的藥物挑選和臨床診斷運用潛力 目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法挑選得到的IgEHIV type 1 reverse transcriptaseThrombinAnti-thrombin IIITaq DNA polymeraseACE用于相互作用挑選傳統(tǒng)挑選方法如親和色譜或者CEC挑選一個Aptamer需求4

17、-6周而CE只需求幾天就可以了，大大提高了挑選速度-MicroScale Bioseparations 2006第六章 檢測器選擇小分子檢測大分子檢測CE檢測器種類及性能小分子檢測有紫外吸收首先選擇二極管陣列檢測器或紫外檢測器無紫外吸收可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外檢測器檢測，如氨基酸、復原性糖等不可以衍生化的，可采用間接紫外法用紫外檢測器檢測，也可以嘗試電化學檢測器有熒光或需求高靈敏度檢測的可采用LIF檢測器需求測定構造或者難以用光學檢測器檢測的，可以思索質譜檢測大分子檢測蛋白、核酸可以首先選擇紫外檢測器假設需求高靈敏度檢測可以采用柱前或者柱上衍生的方法標志熒光，然后用LIF檢

18、測假設需求特異性檢測，可運用特異性熒光探針，標志后再LIF檢測需求測定分子量或氨基酸序列，可采用質譜檢測多糖含量較高的多糖可以采用末端吸收法以紫外檢測器檢測含量較低的復原性多糖可用衍生試劑標志后以LIF、UV的方式檢測第七章 分別條件選擇流程 分別條件的選擇是毛細管電泳中最重要但也是最難之處。不同的專業(yè)研討任務者能夠會有各自不同的選擇戰(zhàn)略和流程，我們提出如下九步選擇流程，僅供參考： 第一步，盡能夠多地了解分別樣品的類型、來源、組成及其性質； 第二步，根據(jù)樣品的能夠性質和來源，選擇分別方式，假設無樣品信息可先選CZE；條件選擇流程 第三步，根據(jù)樣品性質確定檢測方法，普通先選直接紫外吸收； 第四步

19、，確定樣品處置方式，包括衍生方案以及離心過濾除蛋白等； 第五步，根據(jù)樣品解離常數(shù)計算最正確pH，或利用75mID毛細管和磷酸緩沖體系確定pH范圍;條件選擇流程 第六步，根據(jù)所需pH構建緩沖體系，包括進一步優(yōu)化pH、緩沖試劑濃度等； 第七步，優(yōu)化其他操作參數(shù)，如毛細管尺寸、分別電壓和溫度等； 第八步，確定能否需求運用添加劑和運用非水溶劑； 第九步，確定能否需求換用其他分別方式。條件選擇流程 在毛細管電泳條件選擇中，還應充分留意以下操作事項： 最好對樣品和緩沖液進展過濾或離心處置。 毛細管的洗滌或平衡，與緩沖體系、pH以及柱子有關。磷酸根與石英和玻璃之間存在慢相互作用，需求延伸平衡或沖洗時間，處置

20、的時間應由分別重現(xiàn)性決議。條件選擇流程 欲降低緩沖液的電導，應盡量運用所謂的“生物緩沖試劑；欲降低檢測背景，那么應盡量運用無機緩沖試劑。 欲堅持分別重現(xiàn)，要盡量采用一樣的條件，包括毛細管、緩沖液、溫度、電壓、洗滌等。第八章 各類物質的分別要點陰離子及有機酸此類物質沒有紫外吸收，要采用間接檢測法間接紫外法普通以鉻酸鈉等物質作為背景吸收物CTAB通常用作電滲流反向劑，以加速出峰，提頂峰的鋒利度要運用反向極性分別各類物質的分別要點陽離子及金屬離子的分別此類物質沒有紫外吸收，要采用間接檢測法間接紫外法普通以氨基吡啶等物質作為背景吸收物與陰離子不同的是陽離子的分析不需求在緩沖溶液中添加電滲流反向試劑也不需求運用