植物原生質體的分離與融合

1、實驗九實驗九 植物原生質體分離及融合植物原生質體分離及融合制作人：眼睛咪咪制作人：眼睛咪咪 學習植物原生質體的分離及學習植物原生質體的分離及融合的原理，掌握其操作方法。融合的原理，掌握其操作方法。一、實驗目的一、實驗目的 植物原生質體是具有質膜，但去掉植物原生質體是具有質膜，但去掉了細胞壁的植物細胞，分離的原生質體在了細胞壁的植物細胞，分離的原生質體在培養(yǎng)條件下具有再生新壁，進行連續(xù)的細培養(yǎng)條件下具有再生新壁，進行連續(xù)的細胞分裂并分化成完整植株的能力，即具胞分裂并分化成完整植株的能力，即具有細胞全能性。細胞壁的主要成份是纖維有細胞全能性。細胞壁的主要成份是纖維素和果膠質，它們分別經纖維素酶，果

2、膠素和果膠質，它們分別經纖維素酶，果膠酶處理即可分解，從而脫去細胞壁。酶處理即可分解，從而脫去細胞壁。 二、實驗原理二、實驗原理 由于質膜完全暴露，原生質體具有攝取由于質膜完全暴露，原生質體具有攝取大分子大分子(如核酸如核酸)，細胞器，細胞器(如核、葉綠體如核、葉綠體)和細和細菌，病毒的能力，因此是進行遺傳操作，基菌，病毒的能力，因此是進行遺傳操作，基因轉移的好材料。而原生質體融合是實現上因轉移的好材料。而原生質體融合是實現上述目的的一個極為重要的手段。同種或異種述目的的一個極為重要的手段。同種或異種原生質體可在聚乙二醇原生質體可在聚乙二醇(PEG)誘導下產生異核誘導下產生異核體，實現體細胞雜

3、交，實現廣泛的遺傳重組，體，實現體細胞雜交，實現廣泛的遺傳重組，創(chuàng)造新的生物類型。創(chuàng)造新的生物類型。 (一)材料：植物葉片(菠菜葉片) (二)用具：倒置顯微鏡，離心機。過濾篩(100目)，漏斗，燒杯，吸管，長注射 針，注射器(5-10m1)等；三、實驗用品三、實驗用品 1纖維素酶纖維素酶2，果膠酶，果膠酶l ，在在0.65M甘露醇甘露醇，0.05MCaCl22H20和和0.1MES中，中，PH調至調至5.6-6.0。 20.16M CaCl22H20溶液溶液(內含內含0.1MES)PH5.6。 322蔗糖溶液。蔗糖溶液。 430聚乙二醇聚乙二醇(PEG)溶液溶液 5高高PH高鈣洗脫液高鈣洗脫液

4、(PH=9) 0.1M CaCl22H20 0.1M梨酶醇梨酶醇 0.5ml100ml 1M Tris 60.24M CaCl22H20 (三三)試劑：試劑： (一一)原生質體的分離收集：原生質體的分離收集： 1.取菠菜葉片撕去下表皮，每小組稱取菠菜葉片撕去下表皮，每小組稱0.2g切成小塊放切成小塊放到到10ml酶液中，在酶液中，在26下酶解下酶解4-5小時，或酶含量減半過小時，或酶含量減半過夜，期間輕輕搖動幾次。夜，期間輕輕搖動幾次。 2用用100目的過濾篩過濾。目的過濾篩過濾。 3用與濾液等體積的用與濾液等體積的0.16M CaCl22H20溶液沖洗過濾篩，溶液沖洗過濾篩，使沖洗液沖入過濾

5、液。使沖洗液沖入過濾液。四、實驗方法四、實驗方法 4.濾液用離心機濾液用離心機100-300rpm，離心，離心5分鐘棄上清。分鐘棄上清。 5.沉淀中加入沉淀中加入0.16M CaCl22H20溶液溶液1-2ml于沉淀，于沉淀，輕搖使之懸浮，用帶長針輕搖使之懸浮，用帶長針頭的注射器自離心管底部頭的注射器自離心管底部輕輕地加入輕輕地加入6-8ml 22蔗糖溶液，使之形成界面。蔗糖溶液，使之形成界面。 6靜置待原生質體形成一條帶時棄去上、下液及靜置待原生質體形成一條帶時棄去上、下液及殘渣，用吸管吸取收集原生質體。殘渣，用吸管吸取收集原生質體。 7用用0.24M CaCl22H20溶液洗滌一次，離心吸

6、去溶液洗滌一次，離心吸去上清液。上清液。 8沉淀中加入沉淀中加入l-2ml O.16M CaCl22H20溶液懸溶液懸浮沉淀，用血球計數板計數，使原生質體密度為浮沉淀，用血球計數板計數，使原生質體密度為2105個個ml。 9取一滴于載玻片上，低倍鏡觀察原生質體的取一滴于載玻片上，低倍鏡觀察原生質體的純度和完整性，也可用熒光顯微鏡檢查。純度和完整性，也可用熒光顯微鏡檢查。 1取上述原生質體液兩滴，間隔取上述原生質體液兩滴，間隔5mm滴于滴于載玻片上，靜置載玻片上，靜置l0分鐘，使原生質體分鐘，使原生質體沉淀在載沉淀在載玻片上。玻片上。 2在兩滴懸液之間加在兩滴懸液之間加1滴滴30PEG液，使液，