流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用概述

1、流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用概述流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用概述流式細(xì)胞術(shù)系列講座之流式細(xì)胞術(shù)系列講座之概述概述=流式細(xì)胞術(shù)的一般介紹流式細(xì)胞術(shù)的一般介紹=流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢測和科研中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢測和科研中的應(yīng)用=免疫學(xué)檢測和科研應(yīng)用=腫瘤學(xué)檢測和科研應(yīng)用=凋亡分析=血液學(xué)檢測和科研應(yīng)用=其它應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容 流式細(xì)胞術(shù)的一般介紹流式細(xì)胞術(shù)的一般介紹第第 一一 部部 分分什么是流式細(xì)胞術(shù)？什么是流式細(xì)胞術(shù)？ 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer): 是集合光電子物理，光電測量技術(shù)， 液流技術(shù)，計(jì)算機(jī)技術(shù)等現(xiàn)代高科技技術(shù)為一體的細(xì)胞測量和分析儀器。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytomet

2、ry，F(xiàn)CM):是應(yīng)用流式細(xì)胞儀，對處于快速流動(dòng)液體中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速測量和定量分析，以及分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀特點(diǎn)n多參數(shù)測量和分析（散射光和熒光）；多參數(shù)測量和分析（散射光和熒光）；n快速測量和分析快速測量和分析n每秒可達(dá)1000-10000個(gè)細(xì)胞n分選純度可達(dá)99%以上。n獲取的數(shù)據(jù)分析結(jié)果更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；獲取的數(shù)據(jù)分析結(jié)果更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；n通常測量的對象如各種細(xì)胞細(xì)胞必須處在單個(gè)細(xì)胞懸液通常測量的對象如各種細(xì)胞細(xì)胞必須處在單個(gè)細(xì)胞懸液中。此外，也可測量微生物等生物顆粒，或者工合成微中。此外，也可測量微生物等生物顆粒，或者工合成微球非生物顆粒球非生物顆粒FACSCal

3、ibur流式細(xì)胞儀可檢測的細(xì)胞參數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞顆粒性程度細(xì)胞顆粒性程度=細(xì)胞表面面積細(xì)胞表面面積=核漿比例核漿比例=DNADNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期=RNARNA含量含量細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面蛋白抗原細(xì)胞表面蛋白抗原=細(xì)胞胞漿內(nèi)蛋白性細(xì)胞胞漿內(nèi)蛋白性抗原抗原=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖=細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：（二維）點(diǎn)陣圖 (Dot Plot)適用于：雙參數(shù)分析適用于：雙參數(shù)分析流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形： 直方圖(Histogram Plot)適用于：適用于：單參數(shù)分析單參數(shù)分析僅需要觀察某僅需

4、要觀察某個(gè)熒光強(qiáng)度的個(gè)熒光強(qiáng)度的變化變化流式細(xì)胞儀分析圖譜nSSC（側(cè)向散射光）（側(cè)向散射光）-反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)顆粒多少反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)顆粒多少FSC（前向散射光）（前向散射光）-反應(yīng)細(xì)胞大小反應(yīng)細(xì)胞大小散射光信號散射光信號 特征信息熒光（特征信息熒光（FluorescenceFluorescence）信號）信號nFL1 （第一熒光）（第一熒光） -FITC(異硫氰酸熒光素）異硫氰酸熒光素）nFL2 （第二熒光）（第二熒光） -PE（藻紅蛋白）（藻紅蛋白）nFL3 （第三熒光）（第三熒光） -PerCP, PeCy5等等nPL4 （第四熒光）（第四熒光） -APC（藻青蛋白）（藻青蛋白）流式細(xì)胞儀分析圖譜

5、雙色直接染色雙色直接染色設(shè)門：選擇要分析的細(xì)胞群體設(shè)門：選擇要分析的細(xì)胞群體設(shè)定陰性、陽性范圍設(shè)定陰性、陽性范圍流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢測和科研中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在臨床檢測和科研中的應(yīng)用第第 二二 部部 分分一、免疫學(xué)檢測和科研應(yīng)用一、免疫學(xué)檢測和科研應(yīng)用1、細(xì)胞表面分子標(biāo)記、細(xì)胞表面分子標(biāo)記（以淋巴細(xì)胞亞群檢測為例）（以淋巴細(xì)胞亞群檢測為例）原理n人的淋巴細(xì)胞根據(jù)其生物功能和細(xì)胞表面抗原的表達(dá)可分為三大類：T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK自然殺傷細(xì)胞。nT淋巴細(xì)胞特異性標(biāo)志為CD3，包括CD4和CD8T細(xì)胞兩個(gè)亞群；nB淋巴細(xì)胞特異性標(biāo)志為CD19；nNK自然殺傷細(xì)胞表達(dá)CD56或CD16，并且不表達(dá)

6、CD3n利用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞表面抗原結(jié)合，再配多色熒光染料，即可以把淋巴細(xì)胞區(qū)分為各種亞型。進(jìn)而得到各亞群的比例。 T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群檢測：淋巴細(xì)胞亞群檢測： T cells, T subsets, NK cells, B cellsT cells, T subsets, NK cells, B cells淋巴細(xì)胞亞群及功能淋巴細(xì)胞亞群及功能T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(CD3+)名名 稱稱功功 能能輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和

7、體液免疫抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時(shí)升高 CD3+CD4-CD8- 表達(dá) / T細(xì)胞受體(TCR / ) CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細(xì)胞 病菌感染時(shí)升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細(xì)

8、胞, 感染時(shí)升高 感染時(shí)升高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg)具有免疫抑制作用活化活化T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞名名 稱稱功功 能能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差CD19+CD23+ 活化的B細(xì)胞過敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞 自身免疫性疾

9、病時(shí)降低, 而病毒感染時(shí)升高 CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆 淋巴細(xì)胞亞群及功能淋巴細(xì)胞亞群及功能淋巴細(xì)胞亞群與疾病淋巴細(xì)胞亞群與疾病疾疾 病病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 自身免疫性溶血性貧血 重癥肌無力免疫缺陷病 愛滋病病毒感染 傳染性單核細(xì)胞增多癥慢性活動(dòng)性肝炎活動(dòng)性肝硬化腫瘤 消化道癌, 肝癌, 肺癌再生障礙性貧血粒細(xì)胞減少癥淋巴細(xì)胞亞群檢測意義淋巴細(xì)胞亞群檢測意義疾病機(jī)理研究 疾病輔助診斷移植后免疫檢測治療方案的確定及療效評價(jià)CD25高于正常值5-10%, 表明即將或已發(fā)生排斥CD4/CD8比值下降提示并發(fā)兇

10、險(xiǎn)感染 2CG2/MG2/M期細(xì)期細(xì)胞胞,DNA,DNA含量開含量開始增加至始增加至4C4C1、正常細(xì)胞、正常細(xì)胞DNA含量穩(wěn)定在含量穩(wěn)定在2C水平水平2、性細(xì)胞、性細(xì)胞DNA含量為含量為1C3、處于增殖期至分裂期細(xì)胞由、處于增殖期至分裂期細(xì)胞由 2C增加至增加至4C4、凋亡細(xì)胞、凋亡細(xì)胞DNA斷裂斷裂,含量含量2C細(xì)胞經(jīng)熒光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量，可得到細(xì)胞周期三個(gè)時(shí)相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（），可以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)和非二倍體（異倍體）的DNA含量 Channels (FL2-A-FL2-Area)020406080100120Dip

11、loid: 100.00 % Dip G1: 54.38 % at 46.90 Dip G2: 15.91 % at 91.61 Dip S: 29.71 % G2/G1: 1.95 %CV: 5.23DebrisAggregatesApoptosisDip G1Dip G2Dip SG0/G1SG2/MChannels (FL2-A-FL2-Area)020406080100120Diploid: 64.50 % Dip G1: 92.45 % at 49.24 Dip G2: 2.30 % at 98.48 Dip S: 5.26 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.21Aneupl

12、oid 1: 35.50 % An1 G1: 97.69 % at 58.53 An1 G2: 0.00 % at 123.89 An1 S: 2.31 % G2/G1: 2.12 %CV: 3.14 DI: 1.19DebrisAggregatesDip G1Dip G2Dip SAn1 G1An1 G2An1 S可檢測標(biāo)本可檢測標(biāo)本n新鮮的血液、骨髓、體液、灌洗液、手新鮮的血液、骨髓、體液、灌洗液、手術(shù)活檢、細(xì)針穿刺物等。術(shù)活檢、細(xì)針穿刺物等。n冰凍或固定（酒精或甲醛）保存的組織冰凍或固定（酒精或甲醛）保存的組織n常規(guī)固定常規(guī)固定/包埋用于組織檢查的樣本（蠟包埋用于組織檢查的樣本（蠟塊）。

13、塊）。n通常最好的結(jié)果來自新鮮或冰凍的標(biāo)本。通常最好的結(jié)果來自新鮮或冰凍的標(biāo)本。n蠟塊包埋的標(biāo)本需進(jìn)行特殊處理蠟塊包埋的標(biāo)本需進(jìn)行特殊處理 意義意義70%人類癌癥中存在著異倍體或細(xì)胞周期的改變?nèi)祟惏┌Y中存在著異倍體或細(xì)胞周期的改變1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍體和倍體和S期比例期比例-指導(dǎo)治療指導(dǎo)治療2 卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌，原發(fā)部位不明的癌癥卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌，原發(fā)部位不明的癌癥 -早期早期 (I/I

14、I期期)DNA倍體和倍體和DNA指數(shù)指數(shù)-預(yù)后長期和無病生存期預(yù)后長期和無病生存期2 卵巢癌卵巢癌-晚期晚期 2. The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry. HCFA Website,1999 2、腫瘤相關(guān)基因編碼蛋白檢測P53乳腺癌 與病理學(xué)分級有關(guān), 并與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān) 大腸腫瘤 早期發(fā)現(xiàn)大腸癌胃 癌 與預(yù)后相關(guān)肝細(xì)胞癌 與組織分級, 腫瘤預(yù)后, 轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)Bcl-2Bcl-2在正常組織中的表達(dá) 造血系統(tǒng)細(xì)胞 淋巴, 單核細(xì)胞等 受激素或生長因子調(diào)節(jié)的腺上皮 前列腺上皮,

15、子宮內(nèi)膜等 干細(xì)胞或增值細(xì)胞 皮膚的基底細(xì)胞, 腸上皮 壽命長的分裂細(xì)胞 神經(jīng)元 胚胎組織Bcl-2在腫瘤組織中的表達(dá) 腎臟腫瘤 腎癌, 腎盂乳頭瘤, Wilms瘤, 腎嗜酸細(xì)胞瘤 前列腺癌 B細(xì)胞性淋巴瘤 乳腺癌 (43%) 甲狀腺癌nm23nm23與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān) 肝細(xì)胞癌 甲狀腺腫瘤 乳腺癌 結(jié)腸癌 肉瘤CD44(CD44s/CD44v)人人 體體 腫腫 瘤瘤CD44 亞亞 型型與腫瘤的臨床相關(guān)性與腫瘤的臨床相關(guān)性肺癌非特異總 CD44 表達(dá)的下調(diào)與較差的預(yù)后相關(guān)胃腸道癌CD44v9胃腸道腫瘤的獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)CD44v8-v10與肝轉(zhuǎn)移相關(guān),并為結(jié)直腸癌的獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)CD44

16、v6與腸癌的浸潤相關(guān)惡性黑色素瘤CD44v5與侵潤性相關(guān)乳腺癌CD44v6受雌激素和孕激素調(diào)控CD44v3/v4, CD44v6腫瘤分級,但不是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)CD44s, CD44v6腫瘤分級,但不是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)甲狀腺癌(乳頭型)CD44v6與淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)非何杰金氏淋巴瘤CDv3, v6, v9與較差預(yù)后相關(guān)神經(jīng)母細(xì)胞瘤CD44s總 CD44 表達(dá)的下調(diào)與較差的預(yù)后相關(guān)3、 Cyclin(細(xì)胞周期蛋白)檢測P-gp在腫瘤組織中的表達(dá) 乳腺癌, 膀胱癌, 胃癌, 食管癌, 卵巢癌, 前列腺癌等 化療前高表達(dá)化療后高表達(dá) 腎細(xì)胞癌, 結(jié)腸癌, 肝癌,腎上腺皮質(zhì)癌, 胰腺癌等 化療前低表達(dá) 非何

17、杰金氏淋巴瘤, 成神經(jīng)細(xì)胞瘤, 急性髓白血病等 化療不敏感化療敏感化療不敏感4、腫瘤多藥耐藥性(MDR)檢測4、凋亡檢測詳見下一部分三、三、流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡 細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系 該該“死死”的細(xì)胞不死，的細(xì)胞不死，不該不該“死死”的細(xì)胞卻死了，也就是說的細(xì)胞卻死了，也就是說無論凋亡過度無論凋亡過度或凋亡不足或凋亡不足都可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。都可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。n細(xì)胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病細(xì)胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病n細(xì)胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過度：心肌缺血，心力衰竭，神經(jīng)元 退行性疾病，病毒感染退行性疾病，病毒感染n不足與過

18、度并存：動(dòng)脈粥樣硬化不足與過度并存：動(dòng)脈粥樣硬化凋亡與疾病凋亡與疾病細(xì)胞凋亡過程細(xì)胞凋亡過程 在凋亡誘導(dǎo)因素的作用下線粒體的膜電位改變caspase家族激活磷脂酰絲氨酸外翻DNA斷裂形成凋亡小體凋亡的檢測方法凋亡的檢測方法1. 形態(tài)學(xué)檢測形態(tài)學(xué)檢測n光學(xué)顯微鏡 n熒光顯微鏡 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI )n電子顯微鏡 2.磷脂酰絲氨酸外翻分析（可用FCM）3.線粒體膜勢能的檢測 （可用FCM）4. DNA片斷化檢測 （可用FCM）5. TUNEL法 （可用FCM）6. Caspase-3活性的檢測 （可用FCM）7. 凋亡相關(guān)分子的檢測（可用FCM）n

19、促凋亡分子: Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid 等n抑凋亡分子: Bcl-2, Bcl-XL和bcr/abl kinase等8. 相關(guān)信號通路分子的檢測（可用FCM）1.磷脂酰絲氨酸外翻分析磷脂酰絲氨酸外翻分析(ANNEXIN V標(biāo)記法標(biāo)記法)【原理】1. 細(xì)胞凋亡的早期，磷脂酰絲氨酸（PS）外翻；2. Annexin-V能與PS高親和力特異性結(jié)合 ；3. 碘化丙啶(propidine iodide, PI)可以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。 結(jié)果分析結(jié)果分析結(jié)果分析結(jié)果分析-優(yōu)優(yōu)結(jié)果分析結(jié)果分析-差差如何獲得好的結(jié)果如何獲得好的結(jié)果n細(xì)胞狀態(tài)要好；細(xì)胞狀態(tài)要好；n細(xì)胞處理的火候問題

20、：藥物濃度、時(shí)間需要摸索；細(xì)胞處理的火候問題：藥物濃度、時(shí)間需要摸索；n染色后，不能固定細(xì)胞，應(yīng)盡快檢測。染色后，不能固定細(xì)胞，應(yīng)盡快檢測。2.線粒體膜勢能的檢測線粒體膜勢能的檢測 【原理【原理】n線粒體跨膜電位的下降，是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生線粒體跨膜電位的下降，是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體膜電位崩潰，的事件，一旦線粒體膜電位崩潰，細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡則不可逆轉(zhuǎn)。則不可逆轉(zhuǎn)。n線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減

21、弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。增高或降低。n常用染料有：常用染料有：Rhodamine 123 、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide DiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等等 結(jié)果分析結(jié)果分析3.DNA片斷化檢測片斷化檢測n通過PI染色，分析亞二倍體峰（凋亡峰），方法同“DNA倍體分析和細(xì)胞周期分析”Channels (FL2-A-FL2-Area)020406080100120

22、Channels (FL2-A-FL2-Area)0204060801001204.TUNEL法法n流式也能進(jìn)行流式也能進(jìn)行TUNEl檢測，檢測，其檢測原理與經(jīng)典其檢測原理與經(jīng)典TUNEl原原理基本一致。利用理基本一致。利用TdT能將能將熒光素標(biāo)記的熒光素標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到標(biāo)記到斷裂的斷裂的DNA末端，從而使凋末端，從而使凋亡的細(xì)胞具有熒光。亡的細(xì)胞具有熒光。n流式檢測后，可以進(jìn)行精確流式檢測后，可以進(jìn)行精確的計(jì)算凋亡百分比。這一點(diǎn)，的計(jì)算凋亡百分比。這一點(diǎn)，經(jīng)典經(jīng)典TUNEl是做不到的。是做不到的。 經(jīng)典經(jīng)典TUNEL法原理法原理結(jié)果分析結(jié)果分析結(jié)果分析結(jié)果分析結(jié)合細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞DNA含量分

23、析效果更佳含量分析效果更佳5.Caspase-3活性的檢測活性的檢測 nCaspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。nCaspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。n用熒光標(biāo)記的抗活化Caspase-3的抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色，可以通過流式細(xì)胞術(shù)分析其活性n在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降 四、四、流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用1、流式

24、細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型白血病細(xì)胞起源、分化和生物學(xué)行為不同，構(gòu)成了白血病細(xì)胞起源、分化和生物學(xué)行為不同，構(gòu)成了白血病的異質(zhì)性，因此急性白血病的全面、正確分白血病的異質(zhì)性，因此急性白血病的全面、正確分型是準(zhǔn)確、及時(shí)治療的前提。型是準(zhǔn)確、及時(shí)治療的前提。急性白血病的分型基本上分三個(gè)階段：急性白血病的分型基本上分三個(gè)階段：FAB分型分型(1976)(morphology，M )MIC分型分型（1986）(morphology，M )(immunology， I ) ( cytogenetics，C )WHO分型分型(2001)（MICM）(morphology，M )(immu

25、nology， I ) ( cytogenetics，C)(molecular biology, M) 急性白血病分型歷史急性白血病分型歷史急淋急淋（ALL）急性白細(xì)胞急性白細(xì)胞FAB分型分型急非淋急非淋（ANLL）急性髓細(xì)胞白急性髓細(xì)胞白血病血病(AML)L1型型L2型型L3型型M0: 微分化型髓系白血?。?M1：未分化的原粒細(xì)胞白血??；M2：部分分化的原粒細(xì)胞白血病；M3：急性早幼粒細(xì)胞白血?。籑4：急性粒、單核細(xì)胞白血病；M5：急性單核細(xì)胞白血?。籑6：急性紅血病或紅白血?。籑7：急性巨核細(xì)胞白血病。MIC分型以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)作補(bǔ)充，分型以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳

26、學(xué)作補(bǔ)充，相互結(jié)合，使分型更趨精確。其中免疫學(xué)分型是另外兩種相互結(jié)合，使分型更趨精確。其中免疫學(xué)分型是另外兩種方法的重要補(bǔ)充。方法的重要補(bǔ)充。MIC分型分型形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué) (morphology， M ) ：傳統(tǒng)的骨髓片檢查免疫學(xué)免疫學(xué) (immunology， I ) ：免疫組化 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞遺傳學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué) ( cytogenetics，C ) ：染色體分型利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體鑒定細(xì)胞表面或細(xì)胞利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體鑒定細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的免疫標(biāo)志，可準(zhǔn)確反映白血病細(xì)胞的所屬系列內(nèi)的免疫標(biāo)志，可準(zhǔn)確反映白血病細(xì)胞的所屬系列（TB髓）及分化程度。髓）及分化程度。檢測分析時(shí)，首先根據(jù)

27、檢測分析時(shí)，首先根據(jù)CD45表達(dá)強(qiáng)弱和細(xì)胞顆粒表達(dá)強(qiáng)弱和細(xì)胞顆粒度，在度，在CD45-SSC圖中確定幼稚或異常的細(xì)胞群體。圖中確定幼稚或異常的細(xì)胞群體。然后分析檢測各種標(biāo)志的表達(dá)情況及其陽性率。然后分析檢測各種標(biāo)志的表達(dá)情況及其陽性率。白血病免疫分型原理白血病免疫分型原理流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型優(yōu)點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞形態(tài)學(xué)，免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)三者相結(jié)合是當(dāng)今公認(rèn)的白血病分型方案，其中免疫學(xué)分型是另外兩種方法的重要補(bǔ)充。流式細(xì)胞儀可方便、快速、準(zhǔn)確地完成白血病的免疫學(xué)分型，其意義在于： 準(zhǔn)確尋找和計(jì)數(shù)幼稚或異常的細(xì)胞群體； 用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源的白血?。?形態(tài)學(xué)

28、為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL），但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記； 混合性白血?。?幫助確定髓系白血病所屬類型； 慢性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤； 微小殘留白血病。 CD4、CD8、CD61、CD56、CD38本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的白血病免疫分型抗體組合本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的白血病免疫分型抗體組合CD3CD79aMPO可以確定白血病分別屬于可以確定白血病分別屬于T/B/髓系髓系表面染色表面染色胞內(nèi)染色胞內(nèi)染色T系：系：CD2、CD5、CD7B系：系：CD10、CD19、CD20髓系：髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33非系列特異的抗體：非系列特異的抗體：CD34、HLA-DR全全套套進(jìn)一步進(jìn)一

29、步細(xì)分細(xì)分其它其它必要時(shí)可以加用必要時(shí)可以加用泛白細(xì)胞標(biāo)志：泛白細(xì)胞標(biāo)志：CD45標(biāo)本來源（1 1）外周血）外周血（2 2）骨髓穿刺液，）骨髓穿刺液，（3 3）骨髓活檢標(biāo)本）骨髓活檢標(biāo)本（4 4）淋巴組織穿刺）淋巴組織穿刺樣本保存 要要 求：求：n室溫條件室溫條件(16 -28 )存放；存放；n 如非液態(tài)標(biāo)本，則要在標(biāo)本中加入足量的等滲液如非液態(tài)標(biāo)本，則要在標(biāo)本中加入足量的等滲液體（如體（如 生理鹽水或組織培養(yǎng)液）。生理鹽水或組織培養(yǎng)液）。保存時(shí)間n肝素抗凝的外周血和骨髓標(biāo)本，存放時(shí)限為肝素抗凝的外周血和骨髓標(biāo)本，存放時(shí)限為4872小小時(shí)；時(shí)；nEDTA抗凝標(biāo)本，存放時(shí)限只有抗凝標(biāo)本，存放時(shí)限

30、只有12 24小時(shí)，因?yàn)樾r(shí)，因?yàn)樗杓?xì)胞在此條件下會(huì)裂解；髓細(xì)胞在此條件下會(huì)裂解；n檸檬酸（檸檬酸（ACD）抗凝的外周血標(biāo)本可存放）抗凝的外周血標(biāo)本可存放72小時(shí)以上。小時(shí)以上。但此方法不推薦用于骨髓穿刺標(biāo)本，因?yàn)楦邼舛鹊牡朔椒ú煌扑]用于骨髓穿刺標(biāo)本，因?yàn)楦邼舛鹊腁CD會(huì)引起會(huì)引起pH值變化而導(dǎo)致骨髓細(xì)胞死亡值變化而導(dǎo)致骨髓細(xì)胞死亡正常骨髓流式分析圖CD45/SSC 圖中可見：nCD45 強(qiáng)陽性SSC 低信號的細(xì)胞群為淋巴細(xì)胞(褐色細(xì)胞群體)n中等強(qiáng)度的CD45 表達(dá)SSC 信號最強(qiáng)的細(xì)胞群體為粒細(xì)胞(藍(lán)色及紅色細(xì)胞群體)nCD45 表達(dá)與SSC 信號介于淋巴細(xì)胞與粒細(xì)胞之間的是單核細(xì)胞群體

31、(綠色細(xì)胞群體)nCD45 陰性SSC 信號最低的有核紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片n根據(jù)骨髓細(xì)胞CD45/SSC 圖中分布情況設(shè)門圈定各類細(xì)胞nR1 門為成熟淋巴細(xì)胞nR2 門為正常單核細(xì)胞位置nR3 門正常粒細(xì)胞位置nR4 門為幼稚淋巴細(xì)胞出現(xiàn)位置nR5 門為有核紅細(xì)胞或細(xì)胞碎片位置nR6 門為幼稚髓細(xì)胞出現(xiàn)位置n白血病細(xì)胞通常會(huì)在R4 R6 兩門位置處出現(xiàn)舉例B-ALLCD19、CD20、CD10、cCD72、CD34、HLA-DR陽陽性性M3:nCD13和和/或或CD33陽性，陽性，CD15陽性，陽性，CD34、HLA-DR、CD14陰性，偶陰性，偶爾表達(dá)爾表達(dá)CD2。MPO陽性。陽性?；旌媳硇突旌?/p>

32、表型n目前急性白血病的分類仍較復(fù)雜，目前急性白血病的分類仍較復(fù)雜，流式細(xì)胞術(shù)免疫分流式細(xì)胞術(shù)免疫分型能提高分型的準(zhǔn)確性，但不是疾病的診斷型能提高分型的準(zhǔn)確性，但不是疾病的診斷。n理想分類法應(yīng)該以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合免疫學(xué)和細(xì)胞理想分類法應(yīng)該以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)提供信息。遺傳學(xué)、分子生物學(xué)提供信息。n國際血液學(xué)家及血液病理學(xué)家國際血液學(xué)家及血液病理學(xué)家20012001年年3 3月里昂會(huì)議上的月里昂會(huì)議上的造血和淋巴組織腫瘤的造血和淋巴組織腫瘤的WHOWHO分類法，應(yīng)用分類法，應(yīng)用MICMMICM分類技術(shù)分類技術(shù)力求反映疾病本質(zhì)，成為國際上一種新的分類標(biāo)準(zhǔn)。力求反映疾病

33、本質(zhì)，成為國際上一種新的分類標(biāo)準(zhǔn)。白血病免疫分型總結(jié)白血病免疫分型總結(jié)2、流式細(xì)胞術(shù)多發(fā)性骨髓瘤免疫檢測流式細(xì)胞術(shù)多發(fā)性骨髓瘤免疫檢測正常漿細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在免疫表型上存在明顯差異，前正常漿細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在免疫表型上存在明顯差異，前者為者為CD38+CD19+CD56-，而后者則為，而后者則為CD38+CD19-CD56+/-。此外，此外，B系的其他標(biāo)志（如系的其他標(biāo)志（如CD10、CD20等），非等），非B系標(biāo)系標(biāo)志（如志（如CD2、CD5、CD7、CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD14等）在骨髓瘤細(xì)胞中也可能有異常表達(dá)。等）在骨髓瘤細(xì)胞中也可能有異常表達(dá)。因此，通過多參數(shù)流

34、式細(xì)胞術(shù)，進(jìn)行多種表面標(biāo)志標(biāo)記，因此，通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，進(jìn)行多種表面標(biāo)志標(biāo)記，可以很方便地區(qū)分正常漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，對可以很方便地區(qū)分正常漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，對MM的診斷的診斷和預(yù)后判斷有重要價(jià)值。和預(yù)后判斷有重要價(jià)值?！驹怼驹怼?、網(wǎng)織紅細(xì)胞血小板檢測n計(jì)數(shù)外周血中檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)織血小板4、血小板自身抗體檢測n血小板自身抗體檢測：血小板自身抗體識別人血小板抗原，會(huì)引起各種臨床相關(guān)癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。n血小板活化實(shí)驗(yàn)血小板活化實(shí)驗(yàn)n活化標(biāo)志：活化標(biāo)志：CD62P（P選擇素）、選擇素）、PAC-1（IIbIIIa復(fù)合物）復(fù)合物）n血小板特

35、異性標(biāo)志：血小板特異性標(biāo)志：CD615、血小板功能分析 6、夜間陣發(fā)性血紅蛋白尿正常人正常人CD55和和CD59表達(dá)完全陽性。表達(dá)完全陽性。PNH表達(dá)分三型（以表達(dá)分三型（以CD59為例）：為例）：I型，型，CD59表達(dá)完全陽性，熒光強(qiáng)度同正常人；表達(dá)完全陽性，熒光強(qiáng)度同正常人；II型，型， CD59表達(dá)部分陽性，熒光強(qiáng)度介于表達(dá)部分陽性，熒光強(qiáng)度介于I和和III型型之間；之間；III型，型， CD59表達(dá)完全陰性。表達(dá)完全陰性。7、造血干細(xì)胞檢測、造血干細(xì)胞檢測干細(xì)胞的特征干細(xì)胞的特征細(xì)胞特征細(xì)胞特征祖細(xì)胞的流式細(xì)胞儀特征祖細(xì)胞的流式細(xì)胞儀特征CD34CD34表達(dá)表達(dá)對對CD34CD34的反

36、應(yīng)性：強(qiáng)的反應(yīng)性：強(qiáng)CD45CD45表達(dá)表達(dá)對對CD45CD45的反應(yīng)性：弱的反應(yīng)性：弱陰性陰性DNA/RNADNA/RNA含量，核酸染料含量，核酸染料攝取量攝取量祖細(xì)胞祖細(xì)胞DNA/RNADNA/RNA含量較多，染色性較強(qiáng)含量較多，染色性較強(qiáng)大小（前向散射光）大?。ㄇ跋蛏⑸涔猓┳婕?xì)胞直徑約祖細(xì)胞直徑約8 810m10m，與大淋巴細(xì)胞，與大淋巴細(xì)胞前向散射光位置相同，也可能伸入單核前向散射光位置相同，也可能伸入單核細(xì)胞區(qū)域。細(xì)胞區(qū)域。粒度（側(cè)向散射光）粒度（側(cè)向散射光）祖細(xì)胞的側(cè)向散射光弱，與淋巴細(xì)胞、祖細(xì)胞的側(cè)向散射光弱，與淋巴細(xì)胞、大淋巴細(xì)胞相似。大淋巴細(xì)胞相似。CD34、CD45與核酸染

37、料聯(lián)合應(yīng)用，通過合理的設(shè)門策與核酸染料聯(lián)合應(yīng)用，通過合理的設(shè)門策略才能夠準(zhǔn)確檢測略才能夠準(zhǔn)確檢測CD34+干細(xì)胞比例；干細(xì)胞比例；也可以用相關(guān)試劑盒進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)也可以用相關(guān)試劑盒進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)五、五、流式細(xì)胞術(shù)在科研中的其它應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在科研中的其它應(yīng)用1、流式細(xì)胞術(shù)檢測吞噬細(xì)胞的吞噬活性、流式細(xì)胞術(shù)檢測吞噬細(xì)胞的吞噬活性吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞小吞噬細(xì)胞小吞噬細(xì)胞大吞噬細(xì)胞大吞噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞舉例舉例流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞吞噬功能流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞吞噬功能熒光素標(biāo)記細(xì)菌熒光素標(biāo)記細(xì)菌中性粒細(xì)胞吞噬熒光素標(biāo)記的細(xì)菌中

38、性粒細(xì)胞吞噬熒光素標(biāo)記的細(xì)菌快速、客觀、快速、客觀、重復(fù)性好重復(fù)性好 大腸埃希菌 金葡菌85.5445.6154.9593.6440.4553.1088.7593.865min10min15min20min 表示表示表示表示37 吞噬率吞噬率- 表示表示0 15min吞噬率。吞噬率。人人PMN吞噬熒光素標(biāo)記細(xì)菌的時(shí)間動(dòng)力學(xué)流式分析圖吞噬熒光素標(biāo)記細(xì)菌的時(shí)間動(dòng)力學(xué)流式分析圖Cayman吞噬功能檢測試劑盒吞噬功能檢測試劑盒（可采用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡等檢測）（可采用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡等檢測） 分析分析PMA刺激增加刺激增加THP-1細(xì)胞株的細(xì)胞吞噬功能細(xì)胞株的細(xì)胞吞噬功能方便！直觀！快速！方

39、便！直觀！快速！ 細(xì)胞吞噬功能涉及多發(fā)性硬化、細(xì)胞吞噬功能涉及多發(fā)性硬化、Alzheimer、動(dòng)脈粥樣、動(dòng)脈粥樣硬化，細(xì)菌，霉菌等眾多疾病的研究，是細(xì)胞功能變硬化，細(xì)菌，霉菌等眾多疾病的研究，是細(xì)胞功能變化的一個(gè)重要方面。化的一個(gè)重要方面。pHrodo 噬菌作用流式分析試劑盒（噬菌作用流式分析試劑盒（100 assays）n快速標(biāo)記生物微粒，用于細(xì)菌和全血的噬菌作檢測?？焖贅?biāo)記生物微粒，用于細(xì)菌和全血的噬菌作檢測。2、免疫細(xì)胞細(xì)胞毒活性流式檢測、免疫細(xì)胞細(xì)胞毒活性流式檢測細(xì)胞毒活性檢測方法MTT法法3H-TdR攝入法攝入法 流式法流式法CFSE/PI雙標(biāo)記法雙標(biāo)記法實(shí)驗(yàn)原理1.1.羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯( (CFDA-SECFDA-SE、CFSECFSE) ) 是一種膜通透性的熒光素染料，是一種膜通透性的熒光素染料， 能與胞內(nèi)蛋白中的氨基反應(yīng)能與胞內(nèi)蛋白中的氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的染料蛋白加合物（綠色）形成穩(wěn)定的染料蛋白加合物（綠色）2.2.碘化丙啶碘化丙啶 ( (PIPI) ) 是一種膜非通透性的熒光素染料，不能通過活