分子醫(yī)學(xué)技能：ELISA 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 目的和要求目的和要求v掌握ELISA的原理、操作過(guò)程及注意事項(xiàng)v了解ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的讀取和分析實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理v借助酶標(biāo)記抗體（或抗原）在體外與抗原（或抗體）結(jié)合，通過(guò)相應(yīng)底物被酶解后出現(xiàn)顯色反應(yīng)。反應(yīng)顏色深淺與抗原（或抗體）量的多少有關(guān)。v特點(diǎn)：靈敏、特異v類型： 雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法等 雙抗夾心法雙抗夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料vBSA包被的測(cè)定板v酶標(biāo)抗鼠IgG抗體v待檢血清，陽(yáng)性血清，陰性血清v洗滌液： PBS吐溫-20v底物液：鄰苯二胺（OPD）v終止液：10% H2S04實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟加入加入稀釋稀釋好的待測(cè)血清每孔好的待測(cè)血清每孔

2、100100ul， 3737孵育孵育30min30min加入加入100ul100ul酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體, 37, 37孵育孵育30min30min洗板洗板3 3次次, ,每次每次1min1min洗板洗板3 3次次, ,每次每次1min1min實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟加入加入100ul100ul鄰苯二胺底物液鄰苯二胺底物液避光室溫孵育避光室溫孵育10min10min終止反應(yīng)終止反應(yīng): :每孔加每孔加1 1滴滴1010硫酸硫酸結(jié)果觀察結(jié)果觀察注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)u加樣加樣：應(yīng)將所加物加在：應(yīng)將所加物加在ELISAELISA板孔的底部，并板孔的底部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。u洗板

3、洗板：每次洗液加入后，應(yīng)靜置：每次洗液加入后，應(yīng)靜置1 1分鐘使清洗分鐘使清洗更加徹底。末次洗板盡量將水甩干。更加徹底。末次洗板盡量將水甩干。u液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)輕晃動(dòng)3030秒，秒，混勻混勻液體。液體。u底物有底物有毒性毒性，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，盡量避，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，盡量避免接觸。免接觸。將待測(cè)血清將待測(cè)血清1:1001:100稀釋后，再做倍比稀釋到各孔，稀釋后，再做倍比稀釋到各孔，每孔每孔100l100l，見表。注意，見表。注意混勻混勻。1:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001: 256001: 51200陽(yáng)性陽(yáng)性血清血清陰性陰性血清血清100ul血清稀釋及加樣血清稀釋及加樣1:1001:2001:4001:8