八血糖的測定葡萄糖氧化酶法

1、實驗十 血糖的測定血液中的葡萄糖稱血糖。正常人血糖濃度較恒定，維持在39mmolL61mmolL之間。血糖濃度的相對恒定是機體進行正常生理活動的前提條件之一，有著雙重實際意義：其一，維持穩(wěn)定的能源供給，滿足機體在各種生理狀態(tài)下對能量的需求。其二，保證機體不因進食致血糖濃度過高，導致糖的丟失。因此，血糖的測定是臨床生化檢驗實驗室的常規(guī)檢測項目。血糖測定按其發(fā)展過程及反應原理的不同，大致分三類：氧化還原法 ，縮合法（主要有鄰甲苯胺法），酶法（主要有己糖激酶法和葡萄糖氧化酶法）。下邊介紹兩種方法供選擇。一、葡萄糖氧化酶法【目的】1. 了解葡萄糖氧化酶法測定血糖的原理，能進行血糖測定的操作。2. 掌握

2、血糖測定的臨床意義?！驹怼科咸烟茄趸?(glucose oxidase，GOD) 能將葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過氧化氫。后者在過氧化物酶 (peroxidase，POD)作用下，分解為水和氧的同時將無色的4-氨基安替比林與酚氧化縮合生成紅色的醌類化合物，即 Trinder 反應。其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與葡萄糖濃度成正比，在505nm波長處測定吸光度，與標準管比較可計算出血糖的濃度。反應式如下：【器材】試管、吸管、試管架、恒溫水浴箱、分光光度計【試劑】1. 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）稱取無水磷酸氫二鈉8.67g及無水磷酸二氫鉀5.3g溶于800ml蒸餾水中，用1mol/L氫氧

3、化鈉（或1mol/L鹽酸）調(diào)節(jié)pH至7.0，然后用蒸餾水稀釋至1L。2. 酶試劑稱取過氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，疊氮鈉100mg，溶于上述磷酸鹽緩沖液80ml中，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，加磷酸緩沖液至100ml。置冰箱保存，4可穩(wěn)定3個月。3. 酚溶液稱取重蒸餾酚100mg溶于100ml蒸餾水中（酚在空氣中易氧化成紅色，可先配成500g/L的溶液，貯存于棕色瓶中，用時稀釋），用棕色瓶貯存。4. 酶酚混合試劑取上述酶試劑與酚溶液等量混合，4可以存放一個月。5. 12mmol/L苯甲酸溶液溶解苯甲酸1.4g于蒸餾水約800ml中，加溫助溶

4、，冷卻后加蒸餾水至1L。6葡萄糖標準貯存液（100mmol/L） 稱取已干燥恒重的無水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液約70ml中，并移入100ml容量瓶內(nèi)，再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml。7.葡萄糖標準應用液（5mmol/L） 吸取葡萄糖標準貯存液5.0ml 于100ml 容量瓶中，加12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。 【操作】取3 支試管,編號，按下表操作。 表3-12 血糖測定操作步驟加入物 (ml)空白管標準管測定管血清0.02葡萄糖標準液0.02蒸餾水0.02酶酚混合液3.03.03.0混勻，置 37 水浴中保溫 15分鐘，在波長 505nm 處比色

5、，以空白管調(diào)零，讀取標準管及測定管吸光度。 【計算】 測定管吸光度 血糖（mmol/L）= ×5  標準管吸光度【注意事項】1測定結(jié)果如超過20mmolL，應將標本用生理鹽水稀釋后再測定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。2若酶酚混合試劑呈紅色，應棄之重配。因標本和標準用量少，其加量是否準確對測定結(jié)果影響較大，故其加量必須準確。3GOD-POD法的第一步反應特異性高，而由POD催化的第二步指示反應是非特異性的，易受標本中尿酸、維生素C、谷胱甘肽、膽紅素等還原物的干擾，這些物質(zhì)與色素原競爭H202，使測定結(jié)果偏低。4Trinder反應由Trinder于1969年提出。后經(jīng)許多學者改進，采用2

6、，4-二氯酚、2-羥-3，5-二氯苯磺酸等代替苯酚，由于這些化合物氧化生成的色素的摩爾吸光系數(shù)均高于苯酚，使反應靈敏度得以提高?！菊⒖挤秶?.96.1mmol/L【臨床意義】1. 生理性高血糖 可見于攝入高糖飲食或注射葡萄糖后，或精神緊張、交感神經(jīng)興奮，腎上腺分泌增加時。 2. 病理性高血糖糖尿?。翰±硇愿哐浅Ｒ娪谝葝u素絕對或相對不足的糖尿病患者。對抗胰島素的激素分泌過多：如甲狀腺功能亢進、腎上腺皮質(zhì)功能及髓質(zhì)功能亢進、腺垂體功能亢進、胰島-細胞瘤等。顱內(nèi)壓增高：顱內(nèi)壓增高（如顱外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等）刺激血糖中樞，出現(xiàn)高血糖。脫水引起的高血糖：如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖輕度增高

7、。3. 生理性低血糖 饑餓或劇烈運動、注射胰島素或口服降血糖藥過量。4. 病理性低血糖胰島素分泌過多：由胰島細胞增生或胰島細胞瘤等引起。對抗胰島素的激素分泌不足：如腺垂體功能減退、腎上腺皮質(zhì)功能減退和甲狀腺功能減退等。嚴重肝病患者：肝貯存糖原及糖異生功能低下，不能有效調(diào)節(jié)血糖?！窘Y(jié)果及分析】【思考題】1. 血糖有哪些來源和去路，機體是如何調(diào)節(jié)血糖濃度恒定的？2. 酶試劑為什么要用磷酸緩沖液配制，用蒸餾水是否可以，為什么？二、鄰甲苯胺法【目的】了解測定血糖的原理和方法，要求在實驗中培養(yǎng)學生嚴謹?shù)淖黠L和準確地進行實際操作的能力?！驹怼科咸烟窃跓岬拇姿崛芤褐信c鄰甲苯胺縮合生成葡萄糖鄰甲苯胺，后者脫

8、水生成雪夫（Schiff）堿，再經(jīng)結(jié)構(gòu)重排，生成有色化合物。顏色的深淺與葡萄糖含量成正比。其反應式如下：葡萄糖 + 鄰甲苯胺 葡萄糖鄰甲苯胺-H2O 葡萄糖鄰甲苯胺 雪夫堿【器材】試管、吸管、試管架、恒溫水浴箱、分光光度計【試劑】1鄰甲苯胺試劑 于940ml冰醋酸中加入硫脲1.5g, 鄰甲苯胺60ml,混合,直至硫脲完全溶解,置棕色試劑瓶中,室溫保存。新配試劑應放置24小時后（待老化）使用。此試劑腐蝕性強，避免接觸皮膚，應用自動吸管加液。212mmol/L苯甲酸溶液 于900ml 蒸餾水中加入苯甲酸1.4g,加熱助溶,冷卻后置于1L容量瓶中,加蒸餾水至刻度。3葡萄糖標準儲存液（100

9、mmol/L） 稱取無水葡萄糖（預先置80烤箱干燥至恒重，移置干燥器內(nèi)保存）1.802g,溶解于80ml苯甲酸溶液中,移置100ml容量瓶中,再加苯甲酸溶液至刻度。4葡萄糖標準應用液（5mmol/L） 取葡萄糖標準儲備液5ml，置于100ml容量瓶中，加苯甲酸溶液至刻度。【操作】1取16×150mm試管3支按下表進行操作：表3-13 血糖測定操作步驟試劑（ml）測定管標準管空白管血清或血漿0.1葡萄糖標準應用液0.1蒸餾水0.1鄰甲苯胺試劑3.03.03.0 2將上述各管混勻放入沸水浴中加熱12分鐘，取出用自來水冷卻5分鐘。注意在煮沸時水浴中的水面必須高于試管內(nèi)的液面。否則則溫度不均而影響比色。3用波長630nm分光光度計進行比色，空白管調(diào)零點，讀取測定管