細胞遷移侵襲實驗操作步驟(Transwell)

1、遷移試驗（cell migration assay）試驗介紹細胞遷移與侵襲試驗將Transwell小室放入培育板中，小室內(nèi)稱上室，培育板內(nèi)稱下室，上下層培育液以聚碳酸酯膜相隔，將爭辯的細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培育液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培育、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的爭辯。試驗步驟：1材料預備：可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8m，沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移試驗的細胞培育板24孔板。細胞培育板應當與購買的Transwell小室相配套，B

2、D公司的Matrigel，無血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培育基，DMEM完全培育基，1640完全培育基（也可加到20%血清），無菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS結(jié)晶紫）2步驟和流程2.1基質(zhì)膠鋪板：用BD公司的Matrigel 1：8（依據(jù)細胞產(chǎn)生mmp的量來打算）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置3730min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。2.2制備細胞懸液制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓1224h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必需的。消化細胞，終止消化后離心棄去培育液

3、，（用PBS洗12遍），用含BSA的無血清培育基重懸。調(diào)整細胞密度至5105/ml。2.3接種細胞取細胞懸液100l加入Transwell小室。24孔板下室一般加入600l含20%FBS的培育基，特殊留意的是，下層培育液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培育液的趨化作用就減弱甚至消逝了，在種板的時候要特殊留心，一旦消滅氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培育板。培育細胞：常規(guī)培育1248h（主要依癌細胞侵襲力量而定）。24h較常見，時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不行忽視。2.4結(jié)果統(tǒng)計直接計數(shù)法，“貼壁”細胞計數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細胞穿

4、過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去，通過給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞。取出Transwell小室，棄去孔中培育液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨即五個視野觀看細胞，記數(shù)。試驗材料（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-m pore membranes (Corning) （2）細胞培育相關試劑：無血清培育基，10血清培育基，PBS，0.02EDTA（3）固定液：甲醇（4）染色液：Giemsa染液（5）封片劑：中性樹膠（6）其他：小

5、鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片操作步驟（1）全部細胞培育試劑和Transwell chamber 放在37溫育；（2）待測細胞培育至對數(shù)生長期，消化細胞，用PBS和無血清培育基先后洗滌一次，用無血清培育基懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2105 /ml；（3）在下室（即24孔板底部）加入600800l 含10血清的培育基，上室加入100150l細胞懸液，連續(xù)在孵箱培育24小時；（4）用鑷子當心取出chamber，吸干上室液體，移到預先加入約800l甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到預先加入約800l Giemsa染液的孔中，室溫染色1530分鐘；（6）輕輕用清水

6、沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒當心擦去上室底部膜表面上的細胞；（7）用小鑷子當心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；（8）顯微鏡下取9個隨機視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。留意事項（1）依據(jù)待測細胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-m孔徑（如AGS細胞），假如細胞體積較大可以考慮用10-m孔徑；（2）依據(jù)待測細胞的遷移力量強弱調(diào)整細胞數(shù)和遷移時間。常規(guī)24-well chamber接種細胞數(shù)約為25104/well，遷移時間1236小時；（3）由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個獨立的chamber，為了避開操作污染，每次試

7、驗可預先另預備一塊24孔一般培育板（Corning）；（4）假如細胞遷移力量較弱，下室液體可用3T3細胞無血清培育24小時獲得的上清加50g/ml FN（Fibronectin），具體可查閱相關文獻；（5）細胞懸液加入膜中心，盡量保證液面水平；（6）固定染色擦洗時動作當心，避開擦去膜底面的細胞。但肯定要充分擦凈膜表面上未遷移的細胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要當心避開將膜戳破；（7）Chamber和膜上都無法標記，操作時應當心避開混淆試驗組和對比組；（8）充分晾干，避開殘留水分導致鏡下聚焦不全都。細胞侵襲試驗 （cell invasion assay）試驗

8、材料（1）Matrigel (BD 5mg/ml)，-20保存（2）其余材料同遷移試驗操作步驟（1）Matrigel在4過夜溶化；（2）用4預冷的無血清培育基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml，冰上操作；（3）在chamber上室底部中心垂直加入100l稀釋后的Matrigel，37溫育45小時使其干成膠狀；（4）后續(xù)步驟同遷移試驗（1-8）。留意事項（1）Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應提前在4預冷；（2）鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻全都，切勿產(chǎn)生氣泡；（3）其他留意事項同遷移試驗。其他Transwell做腫瘤侵襲試驗的具體步驟(1) 基質(zhì)膠預

9、備：將凍存于80度冰箱的BD matrigel 4度過夜（24h），變成液態(tài)；（2）取300ul無血清培育基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel ，混勻，（ 4操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3個室）；放入37培育箱中，孵育4-5h（5h）；此間經(jīng)常觀看，當消滅“白色層”時，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。注釋：無血清培育基和基質(zhì)膠按1：5稀釋，每孔加50ul，在37培育箱中1-2h。（3）消化細胞，無血清培育基洗3次，計數(shù)，配成細胞懸液；（4）用無血清培育基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100ul細胞懸液；（5）下腔室中加入500ul含有20FBS條件培育基；（6）37培育

10、箱中，孵育20-24h；（7）取出transwell用PBS洗2遍， 5%戊二醛固定，4；（8）加入結(jié)晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（510min），室溫0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀看。 遷移試驗transwell在24孔板中浸泡1小時；消化細胞，無血清培育基 洗 2 次，計數(shù)，配成 細胞懸液，每孔加入100ul細胞懸液；加藥刺激；下腔室中加入條件培育基或其他刺激因子；37培育箱中，孵育 20-24h；取出 transwell用 PBS洗2遍，5% 戊二醛固定， 4；PBS洗2遍，加入結(jié)晶紫（0.1%）染色，室溫0.5h，PBS 洗 2 遍，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀看計數(shù) 10 照相，記錄。侵襲試驗取 300ul 無血清培育基 ，加入 30ul （或 50ug/ 每室） Matrigel ，混勻，（ 4 操作，最好在冰浴上），加入上室各 100ul （ 3 個室）； 放入 37 培育箱中，孵育 4-5h （ 5h ）； 消化細胞，無血清培育基洗 3 次，計數(shù)，配成 細胞懸液 ；用無血清培育基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔加入 100ul 細胞懸液；下腔室中加入 600ul 無血清 條件培育基；37 培育箱中，孵育 20-24h；取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍， 5% 戊二醛固定， 4 ；PBS 洗 2 遍，