水稻小粒密穗突變體sep1的遺傳分析、基因定位與育種利用

1、水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 王躍星,吳昆,方云霞陳紅旗倪深付向東朱旭東,(中國(guó)水稻爭(zhēng)辯所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室,杭州;中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)爭(zhēng)辯所,北京;共同第一作者;通訊聯(lián)系人,Email:ricezxdcom)GeneticAnalysis,GeneMappingandBreedingApplicationofSmallGrainandDensePanicleMutantsepinRiceWANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,CHENHongqi,NIShen,FUXiangdong,ZHUXudong,(StateKeyLaborat

2、oryofRiceBiology,ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou,China;InstituteofGeneticsandDevelopingBiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing,China;Theseauthorscontributedequallytothispaper;Correspondingauthor,Email:ricezxdcom)WANGYuexing,WUKun,FANGYunxia,etalGeneticanalysis,genemappingandbreedingappl

3、icationofsmallgrainanddensepaniclemutantsepinriceChinJRiceSci,():Abstract:ByCorrayradiation,asmallgrainanddensepaniclemutantsepwasobtainedfromtheindicavarietyShuangkezaoComparedtothewildtypeShuangkezao,itwasamutantwithsmallergrain,shorterspikestalkbutmoregrainnumberperpanicleThehistologicalsliceobse

4、rvationofthemainstemshowedthatthemutanthadmorevascularbundlenumberinonecycleandmorecellnumberperunitareathanthewildtypeGeneticandallelismanalysisresultsshowedthatthesmallgrainanddensepaniclemutantwascontrolledbyarecessivegene,anditwasdifferenttothedensepaniclegeneswhichhadbeenalreadyclonedThenbycons

5、tructingthegeneticsegregatedpopulationandusingtheInDelmarkers,thesmallgrainanddensepaniclegenewasmappedonthecentromericregionofchromosomebetweenmarkerXPandXPInaddition,thebreedingapplicationofthemutantwascarriedoutonCMSlinesandthestabilelinesofhighgenerationshadfinallybeenobtainedKeywords:rice;small

6、grainanddensepanicle;geneticanalysis;genemapping;breedingapplication王躍星,吳昆,方云霞,等水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用中國(guó)水稻科學(xué),():摘要:通過Co衰變產(chǎn)生的r射線輻照秈稻品種“雙科早”,獲得小粒密穗突變體sep,該突變體與野生型雙科早相比表現(xiàn)為籽粒變小,穗軸變短,著粒密度增加.主莖切片觀看結(jié)果顯示,突變體維管束數(shù)和單位面積細(xì)胞數(shù)均比野生型多.遺傳分析和等位性分析結(jié)果表明,該突變體為隱性突變,與已克隆的直立密穗基因不等位.利用InDel分子標(biāo)記將小粒密穗基因sep定位在第染色體著絲粒四周的兩個(gè)標(biāo)

7、記XP與XP之間,物理距離約為Mb.此外,還利用該突變體開展了相應(yīng)的育種利用爭(zhēng)辯,已獲得高代穩(wěn)定的不育系材料.關(guān)鍵詞:水稻;小粒密穗;遺傳分析;基因定位;育種利用中圖分類號(hào):Q;S文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):()禾谷類作物穗的構(gòu)成主要包括籽粒大小和穗的形態(tài),二者直接打算最終的產(chǎn)量.穗型是水稻育種上一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀,其主要由一次和二次枝梗的形態(tài)、數(shù)量和長(zhǎng)度打算.粒形和穗型作為水稻抱負(fù)株型的重要性狀,對(duì)于水稻產(chǎn)量增加起到了至關(guān)重要的作用,已受到越來越多育種家的重視.國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道發(fā)覺并完成定位克隆的直立密穗基因有DEP(qPE)、DEP(EP)、DEP和EP等.這些基因大多來自粳稻品種或品系.其中,

8、DEP位點(diǎn)是一個(gè)把握水稻產(chǎn)量性狀的主效QTL,該位點(diǎn)在品種馴化過程中發(fā)生突變,產(chǎn)生的dep能導(dǎo)致稻穗變短、直立、著粒密集.dep收稿日期:;修改稿收到日期:.基金項(xiàng)目:浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(YC);國(guó)家方案資助項(xiàng)目(CBA).中國(guó)水稻科學(xué)(ChinJRiceSci),():http:/wwwricescicnDOI:/jissn歡迎下載是一個(gè)來自中花和日本晴的直立密穗突變體.DEP編碼一個(gè)目前功能未知的植物特有蛋白,主要在幼嫩組織(尤其幼穗)中表達(dá).形態(tài)和表達(dá)分析表明DEP主要影響穗軸和一、二次枝梗的伸長(zhǎng),但并不減弱穗原基的分化和形成.DEP與小圓?；騭rs和EP為等位基因.dep也來

9、自粳稻,其穗從開花到完熟都保持直立狀態(tài),與野生型稻穗在花后就開頭下垂的外形明顯不同.此外,dep突變體的穗長(zhǎng)、粒形以及每穗粒數(shù)等性狀也發(fā)生改變.與野生型相比,dep突變體的維管束更小、莖更粗,這解釋了穗直立的表型.EP是使用N甲基N亞硝基脲處理粳稻品種Hwasunchalbyeo,獲得一個(gè)直立穗突變體hep,遺傳分析表明該表型受一個(gè)隱型突變基因ep把握.ep突變顯著增加了小維管束的數(shù)量和穗軸的粗大度,這是產(chǎn)生直立穗表型的緣由.本爭(zhēng)辯通過r射線輻照秈稻品種“雙科早”獲得了份小粒密穗突變體sep(smallgrainanddensepanicle,sep).本爭(zhēng)辯對(duì)該突變體的表型、生理特征以及主要

10、農(nóng)藝性狀進(jìn)行了觀看,并對(duì)sep進(jìn)行遺傳分析和基因定位,為該基因的克隆、功能分析奠定基礎(chǔ).同時(shí),開展了sep在不育系育種中的應(yīng)用,以期利用該突變等位基因來培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)小粒不育系,起到提高制種效率和節(jié)本增效的作用.材料與方法供試材料利用Co衰變產(chǎn)生的r射線輻照秈稻品種“雙科早”,獲得了大量的形態(tài)突變體.其中,sep突變體表現(xiàn)為小粒和密穗性狀.于和年將sep突變體與野生型種植于中國(guó)水稻爭(zhēng)辯所富陽(yáng)試驗(yàn)基地,成熟期調(diào)查株的株高、穗長(zhǎng)、牢固率、粒長(zhǎng)和粒寬等農(nóng)藝性狀,取平均值.突變體的遺傳分析與育種利用突變體基因遺傳分析群體為sep與粳稻品種日本晴、美國(guó)品種L的F及F群體,配置正、反交.利用sep與光舒(直

11、立穗粳稻)雜交考查其與已經(jīng)定位基因DEP的等位性關(guān)系;利用sep與日本晴的F群體中小粒密穗分別單株對(duì)突變體基因開展定位爭(zhēng)辯.將sep與華粳秈、稻花香號(hào)、中B和中巧B等配組,獲得育種利用群體(F,F和回交群體等).對(duì)上述各世代材料實(shí)行單本移栽,逐株考查單株表型分別狀況,在考查直立密穗突變體的同時(shí)考查分析直立密穗突變體后代分別的遺傳特點(diǎn).突變體組織切片觀看取野生型和突變體的莖稈用FAA固定液固定、保存.石蠟切片制作方法參見文獻(xiàn).突變體的基因定位親本、F及F遺傳群體植株的基因組DNA采用CTAB法提取.通過NCBI(http:/wwwncbinlmnihgov)公布的粳稻日本晴和秈稻的全基因組序列差

12、異查找插入/缺失(InDel)位點(diǎn),利用PrimerPremiers軟件設(shè)計(jì)InDel分子標(biāo)記(表,引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成).將提取的DNA用于PCR擴(kuò)增試驗(yàn),PCR體系如下:DNAL,正反向引物(mol/L)各L,表本爭(zhēng)辯中用于定位的分子標(biāo)記TableMolecularmarkersformappinginthestudy標(biāo)記Marker正向引物序列Forwardprimersequence()反向引物序列Reverseprimersequence()物理位置Physicalposition/bpXPCCACCGAAACATAAACATCATCTGGGTTTGTGAATTGAGA

13、ATXPAAAGCCACCTAATAGAATCAAACCATTTGGAGCGGATAGTCXPTACGAAATGGACAAGATAGCACGCTTACTTTCTTCTGGGTGATAXPGCTTCAAAACAATCATCATATCAGTCAAAACGTAGGTACTTCAGXPAAATTGGTTCGTCGCTGGTTAAAACGGAAAACCAAGGGGAAAXPAATAGTTATTCTAGGGGAGGGGCCATTTCATTCCATTTTCATACTXPGCCAAAGAATCCAGCACCCCTTTTCGTTCCCCACCATCCACXPCTCCCTTCCATCGCCACAATCCAAACT

14、CGAAACCGACAAAXPGATAACCGTGCTGTCTCCCCCGCGATACGTTTGTACACCGXPGGATCGAAAGAAACAAAATAGTAGTCCCACGTAAATACAGAAACXPTCCAGGTGATAAGAAAGTGAATGAATGTTGAGTGGTATGCGATGA中國(guó)水稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)表雙科早及其突變體sep株高和穗相關(guān)性狀TableComparisonofplantheightandpanicletraitsbetweenShuangkezaoandthemutantsep材料Material株高Plantheight/cm穗

15、長(zhǎng)Paniclelength/cm每穗粒數(shù)Noofgrainsperpanicle牢固率Seedsettingrate/粒長(zhǎng)Grainlength/mm粒寬Grainwidth/mm雙科早Shuangkezao±±±±±±sep±±±±±±和兩年數(shù)據(jù)平均.和分別表示野生型與突變體在和水平上差異顯著.Valuesaremeansofandandmeandifferencebetweenwildtypeandthemutantatandsignificancelevel,resp

16、ectively表sep與L、日本晴組合F分別的卡方檢驗(yàn)TableTestofchisquareonsegregationrateofFpopulationbetweensepandL,Nipponbare組合Combination正常表型株數(shù)Normalpanicleplantnumber突變表型株數(shù)Mutantplantnumber總株數(shù)Totalplantnumber分別比例Segregationratio卡平方檢驗(yàn)Chisquaretestsep/L,Psep/日本晴sep/Nipponbare,PdNTPs(mol/L)L,×PCR緩沖液L,Taq酶L,加ddHO補(bǔ)足L.P

17、CR程序如下:下預(yù)變性min;下s,下s,下s,個(gè)循環(huán).PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后在凝膠成像儀拍照并讀膠.統(tǒng)計(jì)分析接受MicrosoftExcel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),用SAS軟件進(jìn)行方差分析.結(jié)果與分析突變體的表型鑒定小粒密穗突變體sep與野生型雙科早相比,表現(xiàn)為籽粒變小,穗型變短,著粒密度增加,植株變矮(圖).此外,生育期、分蘗數(shù)、牢固率等性狀無明顯差異,其小粒密穗性狀能穩(wěn)定遺傳.突變體sep與野生型雙科早株高及穗部考種數(shù)據(jù)見表.突變體的顯微結(jié)構(gòu)從野生型雙科早和小粒密穗突變體sep的成熟植株主莖進(jìn)行切片(圖)可以觀看到,不論是主莖橫切面還是縱切面,野生型植株主莖細(xì)胞均比突變體

18、略大,突變體細(xì)胞排列更緊密,細(xì)胞數(shù)量更多.突變體主莖橫切面維管束數(shù)量(圖C)顯著多于野生型;縱切面單位面積細(xì)胞數(shù)量(圖F)也顯著多于野生型.這一結(jié)果說明突變體植株整體細(xì)胞數(shù)量增多,排列更緊密,且細(xì)胞橫向進(jìn)展明顯,從而造成圖雙科早與突變體sep的表型比較FigComparisonofplants,paniclesandgrainsofShuangkezao(SKZ)andsep了株高降低,同時(shí)也構(gòu)成了突變體每穗粒數(shù)顯著增加的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).突變體的遺傳分析及基因定位在sep與L、日本晴等配組后,雜交F均表現(xiàn)為正常表型,F穗型發(fā)生分別,遺傳比例符合正常表型突變表型(表),表明sep小粒密穗突變表型受

19、單隱性核基因把握.王躍星等:水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 A雙科早橫切;Bsep橫切;C橫切面維管束數(shù)量;D雙科早縱切;Esep縱切;F縱切面虛線框面積中細(xì)胞數(shù).A,CrosssectionofShuangkezao;B,Crosssectionofsep;C,Statisticcomparisonofvascularbundlenumberinonecycle;D,LongitudinalsectionofShuangkezao;E,Longitudinalsectionofsep;F,Cellnumberinthedottedbox圖雙科早和突變體sep莖的顯微結(jié)

20、構(gòu)比較FigMicroscopicstructurecomparisonbetweenShuangkezaoandsep圖sep基因在第染色體上位置FigLocationoftheseponChromosome將突變體sep分別與攜dep基因的光舒雜交,進(jìn)行等位性檢測(cè),結(jié)果表明sep基因與dep不等位,為新的小粒密穗基因.利用本試驗(yàn)室均勻分布于條染色體的對(duì)公共引物對(duì)sep/日本晴的F分別群體進(jìn)行連鎖分析,初步確定目標(biāo)基因位于第染色體著絲粒四周,介于InDel標(biāo)記XP與標(biāo)記XP之間的約Mb區(qū)間內(nèi),在該區(qū)域還未有相關(guān)基因的報(bào)道.進(jìn)一步在連鎖標(biāo)記四周開發(fā)了對(duì)存在多態(tài)的InDel標(biāo)記(表),利用這些標(biāo)

21、記以株分別單株為材料對(duì)突變體基因進(jìn)行進(jìn)一步的定位,最終將sep定位于著絲粒四周的InDel標(biāo)記XP與標(biāo)記XP之間約Mb的區(qū)間內(nèi)(圖).突變體sep的育種利用對(duì)突變體sep與華粳秈、稻花香號(hào)、中B的分別世代重點(diǎn)選擇小粒密穗、異交習(xí)性好、米質(zhì)優(yōu)異的單株,用相應(yīng)的輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交,在中國(guó)水稻科學(xué)(ChinJRiceSci)第卷第期(年月)HJX華粳秈;DHX稻花香號(hào).HJX,Huajingxian;DHX,Daohuaxiang圖NILsep(sep/華粳秈后代株系)、NILsep(sep/稻花香號(hào)后代株系)與親本籽粒、株高及穗部性狀比較FigComparisonofgrain,planthei

22、ghtandpanicletraitsbetweenHJXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/HJX),DHXandNILsep(thenearidenticallinesofsep/DHX)選擇突變性狀同時(shí),兼顧選擇系內(nèi)株間較整齊、花時(shí)較早、柱頭外露的單株,年分別從sep/華粳秈組合和sep/稻花香號(hào)組合獲得了穩(wěn)定不育系NILsep和NILsep.NILsep和NILsep與各自輪回親本籽粒相比(圖),它們的穗長(zhǎng)變短,籽粒變小,植株變矮,但著粒密度增加.爭(zhēng)辯目前在我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)和東北遼寧省、吉林省的部分稻區(qū)種植的直立和半直立穗型的高產(chǎn)粳稻品種都含有D

23、EP突變基因,表明DEP已在我國(guó)水稻增產(chǎn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.大量粳型密穗品種的推廣種植實(shí)踐表明,密穗型品種植株細(xì)胞縱向縮短、橫向變長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)目也同時(shí)增多,表現(xiàn)為株高降低,莖桿更粗大,穗型直立,著粒密度增加,最終也能達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的抱負(fù)狀態(tài).從群體光能利用效率抗倒伏力量來看,密穗型品種也具有肯定的形態(tài)優(yōu)勢(shì).爭(zhēng)辯者利用r射線輻照秈稻品種雙科早時(shí)獲得了大量的形態(tài)突變體,其中共有份密穗型突變體,分別編號(hào)為SKZ、SKZ、SKZ(sep)、SKZ和SKZ.雜交等位性分析和基因定位結(jié)果表明,突變體SKZ、SKZ、SKZ密穗性狀把握基因與已克隆基因DEP等位,基因定位結(jié)果均位于號(hào)染色體相同位置;突變體SKZ密穗

24、性狀把握基因和DEP、DEP、DEP都不等位(該突變體基因的定位工作正在進(jìn)行中);突變體SKZ(sep)密穗性狀把握基因與DEP、DEP、DEP均不等位,且sep和SKZ密穗性狀把握基因間不等位.與其他份突變體相比,sep不但同時(shí)表現(xiàn)出典型的小粒密穗,且牢固率等性狀均未消滅明顯下降(表),因此首先針對(duì)該材料開展遺傳分析,基因定位和育種利用的工作.在雜交稻不育系選育中,為求得到更高的雜交水稻產(chǎn)量潛力,提高千粒重是現(xiàn)行接受的手段之一,但這也同時(shí)導(dǎo)致了稻農(nóng)用種量的增加而投入更多用于購(gòu)種的成本,.以往推廣的不育系中大多為大粒品種,如龍?zhí)馗、A和內(nèi)香A等,只有極少數(shù)小粒不育系如博白A,而且也僅局限在兩

25、廣(廣東和廣西)地區(qū)推廣較多.另一方面,雜交水稻種子生產(chǎn)成本逐年上升,直接導(dǎo)致了雜交種的價(jià)格的快速上漲.年雜交水稻種子市場(chǎng)價(jià)格總體比年上漲了;年雜交水稻種王躍星等:水稻小粒密穗突變體sep的遺傳分析、基因定位與育種利用 子價(jià)格比年上漲了,其中部分市場(chǎng)主導(dǎo)品種價(jià)格上漲幅度遠(yuǎn)大于全國(guó)平均漲幅,甚至有少數(shù)品種價(jià)格漲幅超過;年全國(guó)三系雜交稻均價(jià)元/kg,同比上漲,兩系雜交中稻均價(jià)元/kg,同比上漲.因此,如何提高制種效率,降低制種成本,達(dá)到節(jié)本增效的同時(shí),減輕農(nóng)夫購(gòu)種負(fù)擔(dān),是一個(gè)急需解決的問題.通過小粒密穗突變體sep的發(fā)掘和利用,可以將隱性的小粒密穗基因?qū)氩挥?使籽粒變小同時(shí)每穗粒數(shù)增加,這樣在

26、相同制種面積下,可產(chǎn)出更多粒數(shù)的雜交稻種子,而在雜交稻F代,該隱性性狀又不會(huì)消滅,從而不轉(zhuǎn)變雜交稻生產(chǎn)出的谷粒大小,保持高產(chǎn)農(nóng)藝性狀,最終削減制種面積,提高土地利用效率,降低種子公司制種成本,削減稻農(nóng)購(gòu)種的成本,增加稻農(nóng)的收益.在雜交水稻種子快速上漲的背景下,這不失為一個(gè)有效的策略.當(dāng)然小粒不育系種子在發(fā)芽率,發(fā)芽勢(shì)上,以及葉期前幼苗養(yǎng)分供應(yīng)方面,與大粒品種間是否存在差異,如何在育種實(shí)踐和生產(chǎn)中真正開展運(yùn)用還有待進(jìn)一步爭(zhēng)辯和探討.參考文獻(xiàn):HuangXZ,QianQ,LiuZB,etalNaturalvariationattheDEPlocusenhancesgrainyieldinriceN

27、atGenet,():YanCJ,ZhouH,YanS,etalIdentificationandcharacterizationofamajorQTLresponsibleforerectpanicletraitinjaponicarice(OryzasativaL)TheorApplGenet,():ZhouY,ZhuJY,LiZY,etalDeletioninaquantitativetraitgeneqPEassociatedwithpanicleerectnessimprovesplantarchitectureduringricedomesticationGenetics,():FumioTS,YasushiK,HiroshiK,etalAlossoffunctionmutationofricedensepaniclecausessemidwarfnessandslightlyincreasednumberofspikeletsBreedingSci,():LiF,LiuWB,TangJY,etalRicedenseanderectpanicleisessentialfordetermi