利用廢菌渣生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料研究

1、 單細(xì)胞蛋白營養(yǎng)物質(zhì)豐富,菌體中蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%80%,其中氨基酸組分齊全,賴氨酸等必需氨基酸含量較高,同時(shí)富含維生素等(徐抗震等,2003。廢菌渣是微生物發(fā)酵后的基質(zhì)廢料,菌渣中含有比較豐富的營養(yǎng)成分,粗蛋白質(zhì)含量為8%,粗脂肪0.8%,粗纖維17%,同時(shí)含有豐富的鈣、鋅、銅、磷、鐵、鎂等元素,如果直接用作飼料,由于其蛋白質(zhì)含量低,生物學(xué)利用率較差(李志香和王一鳴,2007;吳瓊等,2003;汪水平和王文娟,2003。本研究通過直接利用廢菌渣或以廢菌渣為主料,再添加一些輔料和一些氮素養(yǎng)料,采用混合菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵技術(shù),把廢菌渣變成單細(xì)胞蛋白飼料。1材料與方法1.1材料豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基:黃豆

2、芽100g,蔗糖50 g,瓊脂20g,水1000mL,pH自然,在121下,滅菌20min。液體種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,蔗糖20g,水1000mL,pH自然,在121下滅菌20min。黃豆芽100g,蔗糖50g,水1000mL,pH自然,在121下滅菌20min。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:廢菌渣90%,麩皮10%;尿素2%;KH2PO42%,MgSO4·7H2O1%;料水比12.53.0;pH自然,121滅菌20min。固體發(fā)酵培養(yǎng)基:(1不同碳源固體發(fā)酵培養(yǎng)利用廢菌渣生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料研究安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院吳萍李正鵬饒圣宏黃結(jié)貴摘要本文以廢菌渣為主要原料,利用釀酒酵母(Saccha

3、romyces cerevisiae和黑曲霉(Aspergillus niger兩菌株進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)條件,結(jié)果表明,各因素對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響為廢菌渣與麩皮的比例>培養(yǎng)時(shí)間>氮源>水料比;混菌固態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件為廢菌渣80%麩皮20%,硝酸銨2%,尿素1%,KH2PO42%,MgSO4·7H2O1%,水料比為2.51,pH為4,接種量為20%,培養(yǎng)時(shí)間為120h時(shí),此時(shí)粗蛋白質(zhì)含量最高,由發(fā)酵前的9.61%提高到23.28%。關(guān)鍵詞廢菌渣;釀酒酵母;黑曲霉;單細(xì)胞蛋白;正交試驗(yàn)中圖分類號(hào)S816.35文獻(xiàn)

4、標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1004-3314(200822-0038-04 AbstractIn this study,single cell protein feed was produced through the mixed solid-state fermentation of two strains,Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger,using the fungi residues as mainly raw material.The optimum cul-ture conditions were determined by the

5、 methods of single factor and orthogonal test.The results showed that the influences of all the factors on the crude protein content was the ratio of fungi residues to bran>culture time>nitrogen source> water-materials ratio;the best culture conditions of mixed solid-state fermentation were

6、 fungi residues80%,bran20%, NH4NO22%,urea1%,KH2PO42%,MgSO4·7H2O1%,the water-materials ratio2.51,pH4,vaccination20%,the culti-vated time120h.The crude protein content increased from9.61%to23.28%and reached its highest.Key wordsfungi residues;Saccharomyces cerevisiae;Aspergillus niger;single cell

7、 protein;orthogonal experiment注:1.廢菌渣;2.廢菌渣麩皮;3.廢菌渣玉米粉。圖1不同碳源對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響基:將廢菌渣100%,廢菌渣90%玉米芯10%分別代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,其他成分不變。(2不同氮源固體發(fā)酵培養(yǎng)基:將硝酸銨2%,硫酸銨2%,硝酸銨1%+尿素1%,硫酸銨1%+尿素1%分別代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源,其他成分不變。子有限公司,101-3-BS 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠,TH2-82氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠,LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠,JA2003N 電子天平(上海精密科學(xué)儀器有

8、限公司,pHS-3C 精密pH 計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司,SW-主要試劑NaOH (AR 合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠,硼酸(AR 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,濃硫酸(AR 蚌埠市皖達(dá)試劑廠,鹽酸(AR 中國蚌埠化學(xué)試劑廠,蔗糖(AR 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1.2方法1.2.1斜面培養(yǎng)在無菌條件下,將酵母菌和黑曲霉菌種接種至新制的豆芽汁蔗糖斜面培養(yǎng)基和PDA 斜面培養(yǎng)基上,30恒溫培養(yǎng)72h 。無菌水將活化的斜面菌種分別洗下并接種到盛有80mL 液體種子培養(yǎng)基的250mL 三角燒瓶中于30,160r/min 振蕩培養(yǎng)72h 。滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基(10g/250mL 三角燒瓶中,置于30恒溫箱

9、中培養(yǎng)72h 。待培養(yǎng)結(jié)束后,將培養(yǎng)物置于80烘箱中風(fēng)干,測粗蛋白質(zhì)含量。法。將發(fā)酵好的培養(yǎng)基烘干至恒重,準(zhǔn)確稱量0.2g 樣品放入干燥的消化管中,再加入0.4g 的混合催化劑(K 2SO 4CuSO 4=31后,并加20mL 的濃硫酸,然后進(jìn)行消化,直至消化液呈透明淡綠色為止,消化完畢后,靜置,待消化管中液體冷卻后,緩慢沿試管壁加蒸餾水20mL ,然后進(jìn)行蒸餾,在250mL 三角燒瓶中加入2%H 3BO 350mL 和23滴指示劑(0.1%甲烯藍(lán)0.1%甲基紅=14,將該瓶套在接收管上,直至接收瓶液面高于150mL 時(shí),取下接收瓶,用0.05mol/L HCl 滴定接收瓶內(nèi)的溶液,滴定溶液由

10、綠色變成淡紫色時(shí)為止,記下消耗HCl 的毫升數(shù),計(jì)算粗蛋白質(zhì)含量。粗蛋白質(zhì)含量(%=(V -V 0N ×0.014×A ×100/W ;式中V 為消耗HCl 的毫升數(shù),mL ;V 0為空白試驗(yàn)時(shí)消耗HCl 的毫升數(shù),mL ;N 為HCl 的當(dāng)量濃度,mol/L ;0.014為1mL HCl 的克當(dāng)量數(shù);A 為固定系數(shù)(6.25;W 為試樣重量,g 。2結(jié)果與分析2.1不同碳源對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),改變培養(yǎng)基中的碳源,其他條件不變,分析不同碳源對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響,結(jié)果見圖1。由圖1可知,當(dāng)廢菌渣與麩皮以90%與10%的比例混合時(shí)產(chǎn)粗蛋白質(zhì)含量

11、最高,而用廢菌渣或廢菌渣與玉米粉作為碳源產(chǎn)粗蛋白質(zhì)含量次之。這可能是因?yàn)辂熎ぶ?含有混菌發(fā)酵所需多糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)成分,對(duì)混菌生長有促進(jìn)作用。但在廢菌渣加入玉米粉,粗蛋白質(zhì)含量增加不明顯,可能是玉米粉顆粒比較細(xì),造成培養(yǎng)基黏性增大,不利于透氣?；A(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),改變培養(yǎng)基中的氮源,其他成分不變,分析對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響,結(jié)果見圖2。氮源的作用是合成細(xì)胞物質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等主要成分,從生長角度看,微生物生長需要充足的氮源。而廢菌渣中營養(yǎng)成分相對(duì)比較貧乏,尤其氮源含量比較少,所以,以廢菌渣為主123不同碳源粗蛋白質(zhì)含量/%圖5不同pH 值對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響注:1尿素;2硫酸銨;

12、3硝酸銨;4硫酸銨+尿素;5硝酸銨+尿素。圖2不同氮源對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響要發(fā)酵原料的培養(yǎng)基,須添加必要的氮源;另一方面加入無機(jī)氮源并通過微生物代謝使其轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì),能夠使獲得的蛋白質(zhì)絕對(duì)數(shù)量增加,直接有效地提高廢菌渣中的粗蛋白質(zhì)含量。由圖2可見,培養(yǎng)基中的氮源種類,對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的含量具有一定的影響,其中以硝酸銨+尿素影響效果最好,尿素次之。酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),改變培養(yǎng)基的水料比,其他成分不變,分析其對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響,結(jié)果見圖3。菌體生長需要適宜的水分,固態(tài)發(fā)酵物料中的含水量是影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量的重要因素,含水量過高會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基黏結(jié)成塊,多孔性降低;含水量過低會(huì)使培養(yǎng)基膨脹程度降低,影

13、響物料利用和菌體生長。從圖3可見,含水量與料水比為2.81時(shí),粗蛋白質(zhì)含量最高。以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),采用不同的接種量進(jìn)行接種,其他條件不變,分析其對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可知,粗蛋白質(zhì)的含量隨接種量的增加而增加,當(dāng)接種量達(dá)到20%以后粗蛋白質(zhì)含量不再增加,趨于平緩。原因可能是接種量大小可影響微生物生長滯留期的長短,一般接種量越大滯留期越短。相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)滯留期越短,微生物達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí)間越短,進(jìn)而可以獲得更高的微生物細(xì)胞,即菌體蛋白。接種量達(dá)到一定量后繼續(xù)增加接種量,達(dá)到滯留期的時(shí)間基本不變,接種量增大對(duì)微生物菌體獲得量沒有影響,進(jìn)而對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的含量沒有影響,因

14、此選擇接種量為20%最佳。不同pH 值對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響以發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),改變培養(yǎng)基的pH ,其他成分不變,分析其對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響,結(jié)果見圖5。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始pH 值對(duì)微生物的生命活動(dòng)的影響很大,主要的作用是引起微生物細(xì)胞膜電位的變化,從而影響微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,因此,培養(yǎng)基中的pH 值過高或過低時(shí)都不利于細(xì)胞的生長,甚至?xí)鸺?xì)胞的死亡。由圖5可見,培養(yǎng)基中不同pH 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)的含量具有一定的影響,隨著pH 升高,發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量逐漸降低,當(dāng)pH 值為4時(shí)對(duì)菌種的生長有利,粗蛋白質(zhì)含量較多。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ),改變培養(yǎng)時(shí)間,其他成分不變,分析其對(duì)產(chǎn)粗蛋白質(zhì)

15、含量的影響,結(jié)果見圖6。由圖6可知,發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白圖3不同水料比對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響圖4不同接種量對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響19.0023不同氮源粗蛋白質(zhì)含量/%19.504519.002.51不同水料比粗蛋白質(zhì)含量/%2.813.013.313.5119.005不同接種量/%粗蛋白質(zhì)含量/%1015202518.5018.0017.5017.0016.504不同的pH 值粗蛋白質(zhì)含量/%56784872培養(yǎng)時(shí)間/h粗蛋白質(zhì)含量/%120序號(hào)A B C D 粗蛋白質(zhì)含量/%1.951.230.471.27圖6不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響表1正交試驗(yàn)因素水平表2正交試驗(yàn)結(jié)果因素A (廢

16、菌渣麩皮/%B (硝酸銨尿素/%C (水料比D (培養(yǎng)時(shí)間/h1100010 2.51722901011 2.819638020213.01120表3正交驗(yàn)證試驗(yàn)表培養(yǎng)基組合廢菌渣麩皮/%硝酸銨尿素/%水料比培養(yǎng)時(shí)間/h 粗蛋白質(zhì)含量/%A 3B 2C 1D 3(表觀802011 2.5112022.18A 3B 3C 1D 3(最優(yōu)8020212.5112023.28質(zhì)的含量影響較大,培養(yǎng)96h 時(shí)獲得的發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量最高。發(fā)酵時(shí)間再延長,發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量反而降低,分析其原因是由于培養(yǎng)時(shí)間過長導(dǎo)致菌體死亡進(jìn)而自溶所致。2.2固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L 9(3

17、4正交試驗(yàn)法對(duì)碳源及組分配比、水料比、培養(yǎng)時(shí)間、硝酸銨尿素添加量這4個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平見表1。結(jié)果見表2。經(jīng)極差分析可見,各因素對(duì)產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響次序?yàn)锳 >D >B >C ;其中廢菌渣麩皮的比例是主要影響因素。最佳組合為A 3B 3C 1D 3,但該組合不在9次試驗(yàn)內(nèi),而表觀最佳組合是A 3B 2C 1D 3,為驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果,按正交最佳組合和表觀最佳組合的配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表3。從表3可見,按最佳組合進(jìn)行發(fā)酵所產(chǎn)生的粗蛋白質(zhì)含量最高。因而綜合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果可見,最佳發(fā)酵條件是:廢菌渣麩皮為8020,硝酸銨尿素為21,水料比為2.5

18、1,培養(yǎng)時(shí)間為120h ,發(fā)酵物中的粗蛋白質(zhì)含量最高,達(dá)23.28%。3討論廢菌渣中含有較多的營養(yǎng)物質(zhì),但直接作為飼料,其蛋白質(zhì)含量低,如果直接丟棄會(huì)污染環(huán)境,采用混菌發(fā)酵技術(shù)可提升廢菌渣的利用價(jià)值。用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料的微生物種類較多,如木霉、黑曲霉、根霉等霉菌和產(chǎn)阮假絲酵母、白地霉、啤酒酵母等酵母菌。本試驗(yàn)采用了黑曲霉和啤酒酵母兩菌株進(jìn)行了混菌發(fā)酵試驗(yàn),從發(fā)酵結(jié)果顯示,發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量由發(fā)酵前的9.61%提高到23.28%。4結(jié)論4.1廢菌渣經(jīng)不同因素處理后,粗蛋白質(zhì)含量有明顯升高,經(jīng)正交優(yōu)化后,粗蛋白質(zhì)含量由最初的9.61%提高到23.28%。4.2經(jīng)極差分析,得出各因素對(duì)產(chǎn)粗蛋白質(zhì)含量的影響是廢菌渣與麩皮的比例>培養(yǎng)時(shí)間>硝酸銨尿素>水料比。4.3根據(jù)本次試驗(yàn)的研究結(jié)果,綜合考慮各方面因素,確定產(chǎn)粗蛋白質(zhì)的最佳固態(tài)發(fā)酵條件為:廢菌渣80%、麩皮20%,硝酸銨2%,尿素1%,KH 2PO 42%,MgSO 4·7H 2O 1%,水料比為2.51