同種移植激活的宿主樹(shù)突狀細(xì)胞能介導(dǎo)免疫耐受

1、同種移植激活的宿主樹(shù)突狀細(xì)胞能介導(dǎo)免疫耐受                 作者:許奇齊，李玫，王松霞，薛殷彤【摘要】 目的 依據(jù)T細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制理論，誘導(dǎo)針對(duì)移植物特抗原的異性免疫耐受。方法 先用致死劑量的射線，將受者的T細(xì)胞及干細(xì)胞去除，形成了一個(gè)不具干細(xì)胞、前T細(xì)胞和T細(xì)胞的受者模型，稱受者模型。同時(shí)經(jīng)同種皮膚移植制造正常的受者對(duì)供者器官的免疫排斥反應(yīng)的模型，稱模型。從模型中經(jīng)免疫磁珠分選取得被供者抗原所激活的、具有抗原提呈功能的

2、樹(shù)突狀細(xì)胞，與正常的事先準(zhǔn)備好的受者骨髓細(xì)胞在體外混合后回輸至受者模型中。受者完成免疫造血功能重建后，再對(duì)其行同種皮膚移植。分5組，分別觀察移植皮片的存活時(shí)間，并常規(guī)病理組織切片和流式細(xì)胞分析檢測(cè)。結(jié)果 由T細(xì)胞發(fā)育的上游誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的免疫移植耐受，比較對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組皮片存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P0.005），流式細(xì)胞分析和病理組織學(xué)分析差異也有顯著性。結(jié)論 在所建立的模型和系統(tǒng)中，能誘導(dǎo)移植物特異性的免疫耐受，也進(jìn)一步驗(yàn)證了胸腺的陰性選擇理論?！娟P(guān)鍵詞】 樹(shù)突狀細(xì)胞；移植；耐受；胸腺；T細(xì)胞發(fā)育Induction of transplantation tolerance with allogra

3、ft-activated host dendritic cells【Abstract】 Objective The negative thymic selection is critical for the maturation of bone marrow derived cells to T cells.Negative selection occurs in thymic medulla and is normally mediated by bone marrow derived APC，like dendritic cells (DC) or macrophages.Immunodo

4、minant allopeptide-pulsed host dendritic cells can successfully induce transplantation tolerance.Methods Host dendritic cells were activated by allo-skin transplantation on day -10 to present the donor-specific antigens.Murine recipients of allogeneic skin grafts on day 0 were given transfusion of t

5、hese activated dendritic cells and isogeneic bone marrow cells after lethal irradiation.Results Transfusion of donor-antigen-specific activated host dendritic cells plus isogeneic bone marrow cells led to prolonged skin allograft survival in recipients treated with lethal irradiation.In contrast，bon

6、e marrow cells transfusion alone failed to induce donor-specific tolerance.Conclusion In the absence of chronic immunosuppression，transfusion of donor antigens activated dendritic cells can prolong skin allograf'' >同種移植激活的宿主樹(shù)突狀細(xì)胞能介導(dǎo)免疫耐受 t survival markedly.【Key words】1 材料與方法1.1 動(dòng)物 雌性BALB/

7、c（H2d，受者）、雄性C57BL/6（H2b，供者）和雄性129（H2k，特異性對(duì)照供者）鼠，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供，均為6周齡，全部的動(dòng)物都飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF-II級(jí)動(dòng)物房。1.2 試劑硫酸新霉素和小鼠淋巴細(xì)胞分層液HISTOPAQUER-1083購(gòu)自Sigma-Aldrich，Inc公司。DynabeadsR小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠標(biāo)記的抗體購(gòu)自Dynal，Inc.公司。PE標(biāo)記抗小鼠CD4抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗小鼠CD8抗體由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系提供。DMEM和PBS由北京大學(xué)人民醫(yī)院提供。1.3 激活并分選宿主樹(shù)突狀細(xì)胞 為激活宿主樹(shù)突狀細(xì)胞（D

8、Cs），在分選細(xì)胞前的第天，給BALB/c宿主動(dòng)物行同種異體皮膚移植，皮片供者為C57BL/6鼠。然后于收獲細(xì)胞的當(dāng)天處死這些BALB/c宿主動(dòng)物，取它們的脾臟，通過(guò)HISTOPAQUER-1083小鼠淋巴細(xì)胞分層液離心分層收獲單核細(xì)胞，再使用DynabeadsR小鼠pan T (Thy 1.2)磁珠抗體通過(guò)陰性分選去除小鼠Thy 1.2陽(yáng)性的細(xì)胞，最終得到含激活DCs的小鼠脾細(xì)胞，用DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度到3.0×107 cells/ml。1.4 宿主骨髓細(xì)胞分選 用注射器使用DMEM沖洗BALB/c宿主動(dòng)物的股骨和脛骨骨髓腔，收集細(xì)胞，離心洗滌一遍，然后用DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度到5.

9、0×106 cells/ml。1.5 受者動(dòng)物的準(zhǔn)備 在接受皮膚移植前的第天，BALB/c受者首先接受900rad致死量的伽瑪射線照射，射線源為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部鈷-60照射室，然后于照射后的h內(nèi)，每只BALB/c受者，通過(guò)尾靜脈，或者輸入1.0×106骨髓細(xì)胞，或者輸入1.0×106骨髓細(xì)胞和5.0×106激活的宿主DCs細(xì)胞的混合細(xì)胞。1.6 移植和耐受誘導(dǎo) 在回輸細(xì)胞后的第天，不同處理的BALB/c受者給予同種異體皮片移植，取自小鼠尾巴的皮膚剪裁成大小為0.9cm×0.9cm的皮片11，如表所示，接受來(lái)自C57BL/6鼠的皮片的動(dòng)物作為耐受誘

10、導(dǎo)組，接受來(lái)自129鼠的皮片的動(dòng)物作為特異性對(duì)照組。1.7 病理組織學(xué)分析 于空白對(duì)照組排斥的時(shí)間，即皮片移植后第天取材，取材部位是移植皮片及其周邊范圍內(nèi)的皮膚組織，在北京大學(xué)干細(xì)胞中心處做石蠟切片，HE染色，光鏡分析。1.8 流式細(xì)胞分析 分別于皮片移植術(shù)后第、天取移植受者外周血，溶解紅細(xì)胞后，使用標(biāo)記抗小鼠CD4抗體和標(biāo)記抗小鼠CD8抗體，雙標(biāo)直染；然后使用FACScan (Becton Dickinson)行流式細(xì)胞分析外周血CD4+或者CD8+T細(xì)胞以及兩者的比例。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS軟件，使用配對(duì)檢驗(yàn)來(lái)比較各組      間皮片存活時(shí)

11、間差異，P0.05認(rèn)為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 致死量照射后宿主動(dòng)物的免疫造血功能重建 實(shí)驗(yàn)組受者動(dòng)物（BALB/c鼠）在移植前30天，首先給予致死量伽瑪射線（900rad）照射，同時(shí)在6h內(nèi)通過(guò)尾靜脈混合回輸激活的DCs（去除T細(xì)胞的脾細(xì)胞）和同基因骨髓細(xì)胞，或者僅回輸同基因骨髓細(xì)胞；隨后受者動(dòng)物將開(kāi)始免疫造血功能重建。30天后進(jìn)行小鼠尾部皮片移植（供者分別為C57鼠和特異性對(duì)照129鼠）。在照射后的3個(gè)月的觀察期間， ( 同種移植激活的宿主樹(shù)突狀細(xì)胞能介導(dǎo)免疫耐受(3) ) 各組動(dòng)物均存活良好。2.2 接受回輸激活的DCs的移植模型中，皮片存活時(shí)間延長(zhǎng) 如表1所示，不同分組間，皮片存活

12、時(shí)間存在明顯差異。其中，組0為受者未接受任何特殊處理，直接行皮片移植的結(jié)果，其皮片中數(shù)存活時(shí)間（MST）為11天；組1為受者經(jīng)致死量伽瑪射線照射后給予激活的DCs和同基因骨髓細(xì)胞經(jīng)免疫造血功能重建30天后，行皮片移植的結(jié)果，MST=20天；兩者相比，組1受者皮片存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為差異有顯著性（P0.005）。圖1為第11天組0（左）和組1（右）的移植皮片的照片，組0受者的移植皮片完全被排斥脫落，而組1的皮片存活良好；圖2為組1受者移植皮片第15(A)，17(B)，19(C)，21(D)，23(E)天的照片，可見(jiàn)第21天前皮片均生長(zhǎng)良好，第23天時(shí)皮片顏色加深，出現(xiàn)邊緣結(jié)痂，排斥的跡

13、象。注：受者鼠在皮片移植前天給予900rad致死量伽瑪射線照射，同時(shí)如表1所示，于照射后h內(nèi)回輸不同的細(xì)胞。表中的計(jì)算基于次不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；*P0.005組和組間；P0.0001組和組間。MST，Median Survival Time，即中數(shù)存活時(shí)間。DC，指經(jīng)同種移植激活的樹(shù)突狀細(xì)胞，即BALB/c小鼠先接受同種皮片移植（供者為C57鼠），10天后取脾細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分層離心得到單核細(xì)胞，并用磁珠標(biāo)記的抗小鼠pan-T抗體陰性分選去除細(xì)胞后得到的細(xì)胞。BMC，為同品系的BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞2.3 激活的DC細(xì)胞誘導(dǎo)供者特異性移植耐受 為證實(shí)激活的DC細(xì)胞誘導(dǎo)的是供者特異性的耐受，

14、我們?nèi)o(wú)關(guān)的供者129鼠的尾部皮片，如表1組3所示，與組1相比，受者的處理完全相同，但皮片來(lái)自無(wú)關(guān)的129鼠，該移植皮片在第10天均被完全排斥，MST=10天，與組1相比，差異有顯著性（P0.001）。相反，供者照射后僅給予骨髓細(xì)胞，產(chǎn)生的耐受是非特異性的，如組2、組4所示，受者對(duì)C57鼠和129鼠的皮片均產(chǎn)生耐受，兩者M(jìn)ST均達(dá)到28天，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。2.4 移植皮片部位病理組織學(xué)分析 如圖3所示，第11天，組0(A)，組3（C）受者皮片完全被排斥，鏡下觀察見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組0(A)皮片和受者移植部位相分離；相反，此時(shí)組1(B)皮片生長(zhǎng)良好，鏡下見(jiàn)移植皮片和受者移植部位

15、沒(méi)有脫離傾向，也未 ,同種移植激活的宿主樹(shù)突狀細(xì)胞能介導(dǎo)免疫耐受(4) 見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。2.5 實(shí)驗(yàn)組的免疫學(xué)功能狀態(tài)的流式細(xì)胞分析結(jié)果 分別于皮片移植術(shù)后第11、19、23天，取組0、組1移植受者外周血，用流式細(xì)胞分析外周血CD4+或者CD8+T細(xì)胞以及兩者的比例。如表2所示，于第11天，組0和組1間，CD4+、CD8+細(xì)胞以及兩者的比例差異有顯著性；第11、19、23天，CD4+、CD8+細(xì)胞以及兩者的比例在組1受者組內(nèi)差異也有顯著性（P0.01）?？梢?jiàn)在免疫重建過(guò)程中，組1的CD4+輔助性T細(xì)胞于移植后30天，在比例和絕對(duì)數(shù)目上已經(jīng)完全恢復(fù)；從CD4+/CD8+細(xì)胞比值看，骨髓移植后

16、，比值明顯升高了，一方面是CD4+的T細(xì)胞比例增加了，同時(shí)，CD8+T細(xì)胞比例減少了，CD8+的T細(xì)胞減少的幅度超過(guò)了CD4+的T細(xì)胞增加的幅度，結(jié)果CD4+/CD8+的比值，組1與組0相比，增加了3倍左右。在完全排斥的23天，其值達(dá)到最高峰（7.87）。注：于第11天，組0和組1間，CD4+、CD8+細(xì)胞以及兩者的比例差異有顯著性；第11、19、23天，CD4+、CD8+細(xì)胞以及兩者的比例在組1受者組內(nèi)差異也有顯著性3 討論皮膚移植是非常嚴(yán)格的移植排斥動(dòng)物模型，皮膚是全身各種器官組織中最容易被排斥的組織，而且皮膚移植直觀，操作相對(duì)簡(jiǎn)單11，所以我們選擇它作為動(dòng)物模型。在不使用系統(tǒng)性免疫抑制劑

17、的情況下，我們?cè)谛∈笃つw移植模型中成功誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受，使皮片存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，對(duì)于C57BL/6來(lái)源的皮片，其MST達(dá)20天；相反，對(duì)于無(wú)關(guān)129鼠來(lái)源的皮片，其MST=10天?？赡艿哪褪軝C(jī)制是復(fù)雜的：（1）可能是由于經(jīng)同種移植激活的DCs攜帶供者特異性抗原，經(jīng)尾靜脈回輸進(jìn)入受鼠體內(nèi)，然后隨血液循環(huán)歸巢到受者胸腺中，提呈供者抗原參與陰性選擇過(guò)程，使受者在免疫重建過(guò)程中，大部分供者反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞在胸腺水平經(jīng)陰性選擇由誘導(dǎo)凋亡克隆清除和克隆無(wú)能等機(jī)制去除掉，從而誘導(dǎo)對(duì)供者皮片的耐受，同時(shí)，在免疫重建的過(guò)程中，受者能保持對(duì)其他抗原的正常免疫應(yīng)答；（2）也可能是供者抗原進(jìn)入胸腺后，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)

18、性T細(xì)胞Treg細(xì)胞對(duì)供者產(chǎn)生特異性的免疫耐受。（3）還可能是由于同種移植激活的DCs攜帶供者特異性抗原進(jìn)入體內(nèi)后，激活同種反應(yīng)性T細(xì)胞回流入胸腺所致。從組3的結(jié)果可知，接受了致死量照射的受鼠在經(jīng)過(guò)30天的免疫重建后，于第10天就完全排斥了無(wú)關(guān)129鼠的皮片，一方面說(shuō)明該耐受誘導(dǎo)方案的特異性；同時(shí)也表明，受鼠具備了完整的免疫功能，流式細(xì)胞分析的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了受鼠的免疫功能，如表2所示，在免疫重建過(guò)程中，組1的CD4+輔助性T細(xì)胞于移植后30天，在比例和絕對(duì)數(shù)目上已經(jīng)完全恢復(fù)；從CD4/CD8細(xì)胞比值看，由于外周CD4/CD8的比值是由胸腺的微環(huán)境決定的，胸腺的輸出對(duì)于該比值有決定性的影響，

19、在正常的成年小鼠，其值介于24之間12；骨髓移植后，比值明顯升高了。由于CD4+的細(xì)胞識(shí)別MHC Class II分子和外源性的抗原肽形成的復(fù)合體，因此推斷可能是由于同種激活的DCs攜帶同種異型抗原分子進(jìn)入胸腺后，一方面通過(guò)胸腺的陰性選擇誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的CD8+T細(xì)胞凋亡，因此外周CD8+T細(xì)胞的比例減少了近一半；同時(shí)，由于該方案誘導(dǎo)的是不完全的耐受，其MST=20天，移植術(shù)后不可避免的發(fā)生排斥反應(yīng)，將導(dǎo)致了CD4+的T細(xì)胞數(shù)目增加，在完全排斥的23提 （，。）天，其值達(dá)到最高峰。皮膚移植有高排斥性且操作簡(jiǎn)單，是良好的移植動(dòng)物模型，但是在臨床上多為自體皮膚移植，因此，我們也設(shè)想在今后的實(shí)驗(yàn)中嘗試

20、心臟移植、腎臟移植等其他的移植模型來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，期待能對(duì)將來(lái)的臨床實(shí)體器官移植提供更有意義的參考；對(duì)于激活的DC細(xì)胞呈遞的供者抗原，我們也希望能在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步提取、純化，以期待分析誘導(dǎo)移植耐受的優(yōu)勢(shì)表位；同時(shí)，我們也在設(shè)計(jì)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證前文所述的誘導(dǎo)該免疫耐受方案的可能機(jī)制。(致謝：感謝北京大學(xué)人民醫(yī)院肝病研究所的魏來(lái)教授，高燕教授提供指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)的部分場(chǎng)所；叢旭老師提供實(shí)驗(yàn)的技術(shù)支持)                              1 Sou