雷公藤紅素的硅膠吸附柱柱分離工藝研究 藥學專業(yè)畢業(yè)設計 畢業(yè)論文

1、目錄中文摘要1英文摘要2第一章緒論31.1雷公藤紅素的理化性質(zhì)及結構31.2雷公藤紅素的藥理作用41.3 雷公藤紅素研究進展41.4論文研究的意義及目的5第二章雷公藤紅素定性定量分析方法62.1薄層色譜定性分析方法6儀器與材料6對照品溶液的制備6 供試品溶液的制備62.2高效液相色譜定量方法7儀器與材料72.2.2 HPLC色譜條件72.2.4 雷公藤紅素對照品的紫外掃描圖譜82.2.3 標準曲線的繪制82.3樣品中含量的計算方法9第三章南蛇藤中雷公藤紅素的柱分離工藝考察103.1雷公藤紅素超聲波提取103.2 甲醇超聲波提取物浸膏預處理10水-氯仿萃取實驗10水-乙酸乙酯萃取實驗103.3柱

2、分離梯度洗脫系統(tǒng)探索11硅膠吸附層析石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)考察11硅膠吸附層析氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)考察13全文結論14參考文獻15致謝17中文摘要本文確立了南蛇藤中雷公藤紅素的薄層定性分析方法。層析條件為：硅膠GF254，氯仿-甲醇(71)為展開劑。展槽中上行展開后在紫外檢測器365nm和254nm下觀測。采用高效液相色譜進行定量分析。色譜柱為Kromasil C18柱（200mm4.6mm i.d.，5m），流動相為甲醇1醋酸（8713，v/v），等度洗脫，檢測波長為425nm，流速1.0mL/min，柱溫25，r=0.9999，在150g/mL范圍內(nèi)線性良好，方法學檢測符合要求。探索了南蛇

3、藤藥材中雷公藤紅素的硅膠吸附柱層析工藝條件。對比甲醇-氯仿系統(tǒng)和石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)的洗脫結果，確定了以石油醚-乙酸乙酯為洗脫系統(tǒng)，洗脫順序為10(2V0)，51(2V0)，11(10V0)。用薄層層析條件進行檢測，判定含有雷公藤紅素的流分。高效液相檢測可以得到純度90.6的雷公藤紅素。關鍵詞：南蛇藤；雷公藤紅素；薄層層析;高效掖相色譜；吸附柱層析ABSTRACTThin-layer chromatography (TLC)of tripterinewas studied. TLC condition was: silica gel GF254 as adsorbent, chloroform

4、methanol (71) as developer. Tripterine was developed upwards in the separation chamber and detected under 365nm and 254nm. The quantitative analysis of tripterine by HPLC was studied.An external standard method by HPLC with Zorbax C18 column as fixed phase andmethano l-1% HAc (8713) as mobile phase

5、was adopted. The detecion wavelength was 425 nm and theflow rate was 1.0 mL /min.The establishment of concentration and the peak area of the standard equation and samples of the formula, were the methods to establish Celastrus in tripterine.Silica gel adsorption chromatographyof tripterine was studi

6、ed.Eluant of silica gel adsorption column was petroleum ether-ethyl acetate. Elution gradient was 10(2V0), 51(2V0)，11(10 V0). The purity of tripterine obtained was 90.6%.Keywords: Celastrus;tripterine; ThinLayer Chromatography; HighPerformanceLiquid Chromatography ; adsorption column chromatography第

7、一章 緒論從中藥特別是有毒中藥中尋找抗腫瘤有效成分具有廣闊的前景。南蛇藤系衛(wèi)矛科南蛇騰屬植物，分布廣泛，藥性辛溫、其全草均可入藥，有清熱、祛風、除濕、活血、解毒、消腫等功效，常用于治療風濕性關節(jié)炎、腰腿痛、筋骨痛、牙痛、閉經(jīng)、痢疾跌打損傷、腸風痔漏、毒蛇咬傷等癥。現(xiàn)代藥理證實南蛇藤具有強大的抗炎鎮(zhèn)痛和抗菌、抗病毒作用1，更重要的是一些初步的實驗證實其中的三萜類成分雷公藤紅素具有較強的抗腫瘤活性，且抗腫瘤機理不同于現(xiàn)有抗腫瘤化療藥物，是通過抑制泛素-蛋白酶通道來阻止腫瘤的生長，是繼紫杉醇之后又一高效低毒的抗腫瘤植物藥2。但在現(xiàn)階段，獲得雷公藤紅素的主要方法是從衛(wèi)矛屬植物藥材中提取純化。其提取物的

8、成分復雜，除了目標成分外，還含有大量的其他成分。而用于藥劑研究及醫(yī)藥生產(chǎn)的原料藥需要高純度的化合物。為了獲得純度高的組分，就需要對提取物進行進一步的分離純化。1.1雷公藤紅素的理化性質(zhì)及結構雷公藤紅素又名南蛇藤素、南蛇藤醇(Celastrol)，屬于三萜類化合物，性質(zhì)穩(wěn)定，是南蛇藤及雷公藤藥材中的主要有效成分之一。雷公藤紅素主要存在于根皮中，去皮的飲片中雷公藤紅素含量很低。結構式如下圖1-1：圖1-1 雷公藤紅素結構式Fig.1-1 Structural formula of tripterine其在甲醇中溶解(室溫)和易溶解(加熱)。溶解度大小順序為：甲醇95%乙醇無水乙醇水丙酮乙酸乙酯石油

9、醚，石油醚：乙醚(1:2)，氯仿3。最大吸收波長：max= 425nm1.2 雷公藤紅素的藥理作用目前雷公藤紅素的藥理研究比較多，其主要藥理作用有抗炎、抗氧化作用，抗菌、抗病毒作用，抗生育活性，調(diào)節(jié)自身免疫及抗腫瘤活性。張麗娟4等報道了南蛇藤素對腫瘤血管抑制作用。通過建立動物腫瘤模型，對南蛇藤素予以實驗治療，結合免疫組化，檢測其抑制腫瘤率和腫瘤內(nèi)血管密度，以及瘤體VEGF和bFGF的表達的改變。實驗研究發(fā)現(xiàn)南蛇藤素具有明顯抑制S180肉瘤作用，降低VEGF、bFGF的表達可能是其抑制腫瘤血管形成的機制之一。中國科學院武漢植物園的袁曉副研究員與美國韋恩大學研究人員合作，利用無毛裸鼠為實驗動物，研

10、究證實雷公藤中含量較高的一種單體成分雷公藤紅素具有抗腫瘤作用，且抗腫瘤機理不同于現(xiàn)有抗腫瘤化療藥物。據(jù)美國三位諾貝爾醫(yī)學/ 生理學獎獲得者共同提出的新理論，泛素-蛋白酶是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的重要通道，它在腫瘤生長與轉移中起著關鍵性作用。據(jù)細胞分子學理論，調(diào)節(jié)細胞生長、信號轉移、基因轉錄和凋亡等均由蛋白酶負責降解。故抑制泛素-蛋白酶通道即可阻止腫瘤的生長。根據(jù)上述新理論，美國一些制藥公司率先開發(fā)出“蛋白酶抑制劑”類全新抗癌藥物，而且在臨床使用后療效良好5,6,7。1.3 雷公藤紅素研究進展1936年趙承暇等首次發(fā)現(xiàn)雷公騰紅素，1998年WeiHe8等報道了雷公藤紅素類似物的合成工藝，而成熟的雷公藤

11、紅素合成工藝仍沒有報道。目前獲得雷公藤紅素的主要方法是從衛(wèi)矛屬植物藥材中提取純化。袁曉9等報道了從毛枝南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的工藝。將南蛇藤根皮用丙酮冷浸，回收溶劑，所得的浸膏用氯仿回流提取，將所得的氯仿提取液再進行下一步的純化。苗抗立10對雷公藤根皮中三萜類化合物的研究中采用丙酮浸提、多次層析得到了雷公藤紅素單體。夏焱11等研究了從雷公藤中提取雷公藤紅素的工藝。雷公藤藥材粉末，用10倍量的甲醇索氏提取。提取液濃縮后加入3倍量的硅藻土拌樣，烘干后，用氯仿超聲提取3次，濾液合并。硅膠干法裝柱，少許氯仿溶解樣品，上樣。用氯仿洗脫除雜后，用氯仿:甲醇(955)洗脫，流分合并濃縮，得雷公藤紅素。S

12、hihua W12等考察了逆流色譜(Counter-current Chromatography,CCC)分離純化工藝。將雷公藤的提取物上硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯洗脫，流分再經(jīng)逆流色譜進一步純化得雷公藤紅素純品。1.4 論文研究的意義及目的據(jù)文獻報道，雷公藤紅素的抑瘤作用為6593，超過美國科學家在20 世紀70 年代初發(fā)現(xiàn)了來自太平洋紫杉樹皮中的紫杉醇。在雷公藤紅素單獨服用及與其它化療藥配伍使用中，尚未見不良反應的報道。據(jù)業(yè)內(nèi)人士預測：雷公藤紅素一旦獲準上市，它將成為繼紫杉醇之后又一個高效低毒的抗腫瘤植物藥13,14,15。隨著雷公藤紅素抗癌機理被證明，雷公藤紅素作為蛋白酶體抑制劑成為抗癌新

13、藥的熱點，該化合物也將備受關注，具有廣闊的市場前景。而雷公藤紅素的相關報道中提取純化工藝報道甚少，因此探究雷公藤紅素提取純化優(yōu)化工藝既成了一種必要，更有助于推動雷公藤紅素研究的進展，為其進入臨床應用提供可能。目前對雷公藤紅素的報道主要集中在中藥雷公藤的研究上，本文選擇了衛(wèi)矛屬的另一種藥材南蛇藤作為研究對象。對其甲醇超聲波提取物浸膏中雷公藤紅素的薄層色譜條件及硅膠柱吸附層析進行了探索，以期能提出、其分離純化的可行性工藝，為雷公藤紅素的進一步研究和生產(chǎn)提供參考依據(jù)。第二章 雷公藤紅素定性定量分析方法2.1 薄層色譜(Thin Layer Chromatography,TLC)定性分析方法 儀器與材

14、料儀器：ZF-2型三用紫外儀上海安亭電子儀器廠藥品試劑：薄層層析用硅膠GF254青島海洋化工有限公司 氯仿，甲醇（分析純） 山東禹王實業(yè)有限公司對照品：雷公藤紅素 (98%) 中國生物制品檢定所樣品：南蛇藤提取物及硅膠柱上洗脫下的流分 2.1.2 對照品溶液的制備取雷公藤紅素對照品適量，乙酸乙酯溶解，備用。 供試品溶液的制備取南蛇藤提取物浸膏適量，乙酸乙酯溶解，備用。硅膠柱層析洗脫的流分備用。2.1.4TLC條件薄層板：薄層層析用硅膠GF254展開系統(tǒng)：氯仿甲醇71展開方式：展開槽中加入適量的展開劑，平衡10min后上行展開檢 測：當雷公藤紅素點樣量大時，薄層板在日光下觀測有黃色條帶；在紫外檢

15、測器365nm和254nm下觀測為暗色斑點，同時也可以觀察到其它雜質(zhì)成分的熒光點和暗點。2.2 高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)定量方法儀器與材料儀器:L-2130型高效液相色譜儀日本日立公司L-2400型紫外檢測器日本日立公司N-3000色譜工作站浙江大學智能信息研究所TU-1810型紫外可見分光光度北京普析通用儀器公司ALC-210.4型電子天平(0.1mg)AcculabAR2130型電子天平(1mg)OhausKQ3200E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司 試劑：甲醇（色譜純）山東禹王實業(yè)有限公司對照品：雷公藤紅素 (

16、98%)中國生物制品檢定所HPLC色譜條件16色譜柱：KromasilC18柱 (200mm4.6mm i.d , 5m)流動相：甲醇1%醋酸（v/v）8713檢測波長：425nm流速：1.0mL/min柱溫：252.2.3 雷公藤紅素對照品的紫外掃描圖譜稱取雷公藤紅素對照品適量，甲醇溶解，在200600nm波長范圍內(nèi)掃描，見下圖2-1。雷公藤紅素在425nm附近有最大吸收峰，故選擇425nm為檢測波長。圖2-1 雷公藤紅素紫外可見光掃描Fig.2 UV spectrum oftripterine2.2.4標準曲線的繪制精密稱取雷公藤紅素對照品5.0mg，甲醇溶解，定量轉移至100mL容量瓶中

17、并定容，搖勻，備用，作為初始溶液。表2-1 雷公藤紅素標準品濃度峰面積數(shù)據(jù)Tab.2-1 Data of standard curve of Tripterine濃度(g/mL)12510202550峰面積平均26953260792636626466444564496745163448621347281393991355651365643169483136763138123148126491016489846455136478668256928219358223128233131650310164521016327601642760分別精密量取配制的對照品初始溶液0.5、1mL至25mL容量瓶

18、中并定容，分別精密量取1、2、4、5mL至10mL容量瓶中并定容，搖勻。將配制的這些不同濃度梯度的溶液及初始溶液過0.45m微孔濾膜。分別20L進樣，HPLC分析得相應的峰面積，以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，得雷公藤紅素的線性回歸方程：A=33274C17614，r=0.9999，雷公藤紅素對照品溶液濃度在150g/mL范圍內(nèi)線性關系良好。濃度和峰面積數(shù)據(jù)見表1，標準曲線見圖2-2。圖2-2 雷公藤紅素標準曲線Fig.2-2Standard curve of tripterine2.3 樣品中含量的計算方法第三章 南蛇藤中雷公藤紅素的柱分離工藝考察通過各種提取技術所得到的中藥提取

19、物中的成分比較復雜，需要進一步的處理才可以得到純度較高的化合物。本章考察了南社藤超聲波提取物浸膏的預處理工藝，并探索了雷公藤紅素柱層析分離條件，以期能得到雷公藤紅素簡便可行的的分離純化工藝。3.1 雷公藤紅素超聲波提取用1：10倍量的甲醇溶劑，在超聲功率400W，單次輻射時間8s(間歇時間5s)，超聲總時間40min的條件下得甲醇超聲波提取物浸膏。3.2甲醇超聲波提取物浸膏預處理由于南蛇藤藥材甲醇超聲波提取物浸膏中會含有大量極性大物質(zhì)，而雷公藤紅素為中等極性物質(zhì)，因此可以以水為萃取劑，通過兩相萃取除去極性大的組分如糖類、蛋白及鞣質(zhì)等，將樣品進行初步純化、富集。3.2.1 水-氯仿萃取實驗取甲醇

20、超聲波提取物浸膏適量，加入10倍量的蒸餾水（調(diào)節(jié)至合適的pH），再加入等量氯仿，氯仿層乳化現(xiàn)象嚴重。3.2.2 水-乙酸乙酯萃取實驗取甲醇超聲波提取物所得浸膏適量，加入10倍量的蒸餾水（調(diào)節(jié)至合適的pH），再加入等量的乙酸乙酯，震蕩，搖勻，靜置2h，取出乙酸乙酯層。再向水相補入等量乙酸乙酯，重復上面的操作5次，將5次所得的乙酸乙酯層合并定容。精密量取適量進行分析，表4-1為預處理工藝前后浸膏中雷公藤紅素總量和雷公藤紅素含量變化數(shù)據(jù)。表3-1 預處理前后浸膏中雷公藤紅素總量和含量數(shù)據(jù)Tab.3-1 Data of total amount and contents of tripterine i

21、nextractum and pretreatment extractum樣品說明雷公藤紅素總量（mg）雷公藤紅素含量（%）提取物濃縮所得浸膏13.64870.568經(jīng)預處理后浸膏13.16922.14小結：從上表3-1可以看出，甲醇超聲波提取物浸膏經(jīng)過水-乙酸乙酯兩相少量多次處理，目標成分得到富集，浸膏中雷公藤紅素的含量提高了近3倍，雷公藤紅素的回收率為96%左右，而且浸膏粘度降低，有利于柱層析工藝的進行。從而選擇水-乙酸乙酯兩相萃取進行樣品的預處理。3.3柱分離梯度洗脫系統(tǒng)探索雷公藤紅素在結構上有羧基基團，故選用硅膠作為吸附劑，薄層檢測條件為依據(jù)，以此檢測定性鑒定不同洗脫系統(tǒng)沖柱子時所得到

22、的流分中雷公藤紅素和其它成分。參照薄層色譜條件，乙酸乙酯對雷公藤紅素的洗脫力較大，故而柱層析除了探索薄層優(yōu)化色譜條件氯仿-甲醇系統(tǒng)，也探索了石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)。3.3.1 硅膠吸附層析石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)考察1)裝柱稱取15g硅膠（200-300目），加入干硅膠體積一倍的石油醚，用玻璃棒充分攪拌調(diào)成糊漿狀，沿層析柱內(nèi)壁，徐徐灌入柱中，同時打開下端活塞，讓洗脫液石油醚緩緩滴出，并注意在灌漿過程中不能干柱，柱面上保持一定的液面高度，用吸耳球均勻施力敲打柱子讓硅膠自由沉降而均勻填實。過夜平衡，待柱子高度穩(wěn)定后，測定柱子的保留體積V0=27ml17。2)上樣雷公藤紅素在石油醚中的溶解度較小，故采

23、用干法上樣。稱取0.3g硅膠（200-300目），將預處理后的樣品溶于乙酸乙酯，與硅膠拌樣，在紅外燈下?lián)]發(fā)掉溶劑，調(diào)節(jié)柱的液面至硅膠上層大約1cm左右，將拌樣輕輕地添加到硅膠柱的上部。在柱子頂部放入少許棉花，防止洗脫劑在加入柱子內(nèi)部時將硅膠頂部沖起171。3）柱層析洗脫預實驗 采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)系統(tǒng)，分別各以10；101；81；61；31；11；12；14兩個柱體積進行洗脫，從而逐步調(diào)節(jié)石油醚和乙酸乙酯的比例來調(diào)節(jié)洗脫劑的洗脫能力。樣品經(jīng)硅膠吸附柱層析分離時，其色帶明顯，柱分離色帶示意圖如下圖3-1，圖4-1石油醚-乙酸乙酯洗脫示意圖Fig.3-1Schematic diagram of

24、 elutionprocess by petroleum ether-ethyl acetate gradient參照薄層色譜定性分析條件進行檢測，在洗脫劑比例為14時檢測到雷公藤紅素，說明當洗脫劑極性小于洗脫劑比例14的極性時，雷公藤紅素即在柱子內(nèi)隨流動相移動，通過掖相檢測，基本確定雷公藤紅素所在色帶。后續(xù)實驗以雷公藤紅素色帶的移動作為觀測，調(diào)整洗脫劑的配比和各梯度時洗脫量。經(jīng)過多次預實驗探索，在洗脫劑比例為51時，雷公藤紅素所在的色帶開始隨著柱子方向移動，但移動緩慢，當調(diào)節(jié)洗脫劑比例在51和11之間時，洗脫劑對雷公藤紅素的洗脫能力變化不大，雷公藤紅素色帶移動速度緩慢。洗脫劑比例大于12時，

25、溶劑的洗脫能力太大，使得雷公藤紅素色帶與后邊的色帶重合，分離效果不好，而帶入雜質(zhì)。4）柱層析洗脫預實驗小結經(jīng)過預實驗研究，確定了南蛇藤藥材中雷公藤紅素柱分離洗脫梯度如下表3-2。以此洗脫梯度重復硅膠吸附柱層析實驗，其實驗結果穩(wěn)定，具有重現(xiàn)性。表3-2 石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)柱分離結果Tab.3-2 Result of column chromatography eluted by petroleum ether-ethyl acetate gradient流份洗脫系統(tǒng)說明1#2#3#6#7#40#41#76#77#90#91#103#石油醚石油醚乙酸乙酯=51石油醚乙酸乙酯=11石油醚乙酸乙

26、酯=12洗脫2V0，全部合并洗脫2V0，溶劑的最前沿有黃色色帶淡黃色色帶深紅色色帶淡黃色色帶黃綠色色帶深褐色色帶5）實驗 根據(jù)表4-2安排實驗，用試管收集流分（10ml/管），將流分間隔點樣，以氯仿甲醇=71在層析槽中上行展開，薄層板在365nm和274nm紫外燈下觀測，合并含有雷公藤紅素的流分。雷公藤紅素集中的流分為6#50#，其中10#在紅素前端有熒光物質(zhì)。將6#14#,15#30#和31#-50#分別合并，減壓蒸餾,回收溶劑，濃縮成浸膏，通過HPLC測浸膏中雷公藤紅素含量分為6.0%，90.7%與46.6%。3.3.2硅膠吸附層析氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)考察(1)裝柱方法同石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)

27、濕法裝柱1）裝柱方法同石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)濕法裝柱。2）上樣由于雷公藤紅素在氯仿中有較大的溶解度，故采用濕法上樣13。將預處理后的浸膏樣品用少許氯仿溶解。先將柱子內(nèi)的洗脫劑沖至與硅膠柱頂部相切的位置，用膠頭滴管將氯仿溶解的樣品直接加到柱子頂端，待樣品溶液液面與柱子頂部再次相切的時候，加入少許的氯仿沖洗柱子內(nèi)壁，待所有的樣品全部轉移吸附到硅膠柱子上時，開始洗脫。在硅膠柱的頂端放入少許的棉花，防止硅膠柱頂被溶液沖起。3）洗脫表3-2 氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)柱分離結果Tab.3-2 Resultof column chromatography eluted by chloroform-methanol

28、gradient流份洗脫系統(tǒng)說明1#4#5#15#氯仿氯仿甲醇=1001溶劑前沿為黃色色帶褐色色帶硅膠柱氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫，色帶現(xiàn)象如示意圖4-5，原圖如附錄4.圖3-2氯仿-甲醇洗脫示意圖Fig.3-2 Schematic diagram of elutionprocessbychloroform-methanol gradient4）小結如圖3-2，2為雷公藤紅素色帶。與圖3-1比較，本圖的色帶2為混合色帶，說明雷公藤紅素未能分開。說明氯仿-甲醇系統(tǒng)分離度較差，故確定石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)為南蛇藤藥材提取物浸膏的洗脫系統(tǒng)。全文結論1.確定了雷公藤紅素薄層檢測定性分析方法，即以薄層層析用硅膠G

29、F254作為吸附劑，氯仿-甲醇(7:1)系統(tǒng)為展開劑，在展開槽中上行展開，在紫外燈254nm和365nm下檢測雷公藤紅素斑點。2.確定了南蛇藤藥材中雷公藤紅素的HPLC含量測定方法：色譜柱為Kromasil C18柱（200mm4.6mm i.d.，5m），流動相為甲醇1醋酸（8713，v/v），等度洗脫，檢測波長為425nm，流速1.0mL/min，柱溫25。在此條件下，得到雷公藤紅素的峰面積(A)和相應濃度(C)的線性方程A=33274C17614,r=0.9999，在150g/mL范圍內(nèi)線性良好，方法學檢測符合要求。3.建立了雷公藤紅素的乙酸乙酯-水萃取除雜工藝。以10倍量的蒸餾水（調(diào)節(jié)

30、pH）溶解雷公藤紅素提取物浸膏，以乙酸乙酯為萃取劑，采用少量多次的原則，以與水等量的乙酸乙酯萃取5次，除去了浸膏中極性大的物質(zhì)，使浸膏粘度明顯降低。4.優(yōu)化了雷公藤紅素的柱層析純化工藝條件。以石油醚-乙酸乙酯洗脫系統(tǒng)為洗脫劑，洗脫順序為10(2V0)，51(2V0)，11(10V0)。合并目標流分6#14#，經(jīng)減壓濃縮，真空干燥至恒重， HPLC測定，浸膏中雷公藤紅素的含量為90.7%。參考文獻1南蛇藤提取物抗腫瘤作用的實驗研究 張艦 學士論文2 開發(fā)雷公藤單體成分新藥市場前景廣闊徐錚奎(無錫市醫(yī)藥科技情報部)3 張立平,靳風柱.雷公藤紅素提取工藝的研究J.中華醫(yī)學全科雜志,2004.3(2)

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