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1、血漿DNA定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心2007年12月第1版1. 血液樣本的采集:(1) EDTA-K2抗凝真空采血管(無分離膠)采集外周靜脈血23 ml,充分顛倒混勻,記錄采集時(shí)間?;蛘?(2) EDTA-K2抗凝真空采血管(有分離膠)采集外周靜脈血23 ml,充分顛倒混勻,記錄采集時(shí)間。2. 血液樣本的處理:分離血漿(1) 步驟1-(1)的抗凝血經(jīng)3 000 rpm低速離心10 min后,吸取上層血漿,再經(jīng)16 000 g高速離心10 min后,吸取上層血漿200l,加入到“血漿DNA定量樣品管”中(含50 000 copies質(zhì)粒DNA內(nèi)參照),余血漿樣本
2、-20及以下凍存。無法立即處理,見步驟3。(2) 步驟1-(2)的抗凝血經(jīng)3 000 rpm低速離心10 min后,吸取上層血漿200l,加入到“血漿DNA定量樣品管”中(含50 000 copies質(zhì)粒DNA內(nèi)參照),余血漿樣本-20及以下凍存。(3) 血液樣本采集后若無法立即處理,需詳細(xì)記錄采集時(shí)間,4或室溫保存(48h內(nèi)必須分離血漿);密閉陰涼常溫下運(yùn)輸(48h內(nèi)必須完成運(yùn)輸并分離血漿)。3. 血漿樣本的處理:核酸的提取和純化(1) 采用磁珠法提取步驟2-(1)和2-(2)的200l血漿樣本中的微量DNA。具體操作如下: 在“血漿DNA定量樣品管”中加入200 µl 裂解液1和
3、4 µl蛋白酶,與待測(cè)血漿充分混勻后放55 水浴 15 min; 將離心管取出后每管加入600 µl 磁珠/結(jié)合液的混合液,振蕩混勻,室溫放置10 min,中間顛倒混勻一次; 將離心管側(cè)靠在磁珠分離操作臺(tái)的磁體上,放置 4 min,吸棄液體,注意不要碰或吸走紅色沉淀,將離心管拿離磁體; 在離心管內(nèi)加入200 µl 洗液3,將紅色沉淀振蕩,充分混勻,然后將離心管側(cè)靠在磁體上,放置1 min,吸棄液體,將離心管拿離磁體; 在離心管內(nèi)加入100 µl 洗液4,將紅色沉淀振蕩,充分混勻后,將離心管側(cè)靠在磁體上,放置1 min,吸棄液體,將離心管拿離磁體; 離心管
4、放在55 烤箱中干燥10 min; 在干燥后的離心管內(nèi)加入40 µl 洗脫液5,充分溶解紅色沉淀,在55 烤箱中保溫10 min,離心管側(cè)靠在磁體上,放置1 min,將液體取出放入干凈的無菌離心管內(nèi),即為DNA提取液。(2) 血液樣本分離后得到的血漿若無法立即處理,需詳細(xì)記錄分離時(shí)間,-20及以下凍存,冰凍運(yùn)輸(48h內(nèi)必須完成運(yùn)輸并進(jìn)行核酸提?。?。4. 雙重?zé)晒舛縋CR:(1) 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系,包括:去離子水、緩沖液、dNTPs、MgCl2、引物1、引物2、引物3、探針1、探針2、熱啟動(dòng)DNA聚合酶和DNA模板。反應(yīng)條件為:95預(yù)變性5min;94 30s,55 30
5、s,72 40s 共45個(gè)循環(huán),每次循環(huán)結(jié)束前采集一次熒光信號(hào)。(2) 提取的核酸樣本若無法立即檢測(cè),需詳細(xì)記錄提取時(shí)間,-70及以下凍存(48 h內(nèi)必須進(jìn)行檢測(cè))。5. 數(shù)據(jù)分析和計(jì)算:根據(jù)擴(kuò)增曲線的情況,設(shè)定基線和閾值,獲得各樣本的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)和Ct值。采用LinRegPCR軟件,根據(jù)熒光信號(hào)數(shù)據(jù),獲得各樣本擴(kuò)增效率,并分別計(jì)算內(nèi)參照物和目的基因的平均擴(kuò)增效率Ep和Eb。根據(jù)公式 計(jì)算各樣本的血漿DNA濃度(copies/ml),其中,Cp=250 000 copies/ml。再根據(jù)1copy人基因組DNA為3.3pg,將所得的結(jié)果(copies/ml)換算為血漿DNA濃度(ng/ml)。
6、6. 室內(nèi)質(zhì)量控制:(1) 按照步驟1-(1)收集數(shù)名健康體檢者抗凝靜脈血,經(jīng)3 000 rpm低速離心10 min后,吸取上層血漿,再經(jīng)16 000 g高速離心10 min,吸取上層血漿,獲得混合血漿約2 ml,作為質(zhì)控品血漿。(2) 取200l質(zhì)控品血漿,加入到“血漿DNA定量樣品管”中(含50 000 copies質(zhì)粒DNA內(nèi)參照干粉)。余步驟參照步驟3、4、5。(3) 重復(fù)步驟6-(2)共20次,計(jì)算質(zhì)控品血漿DNA濃度的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD),以M±2SD作為血漿DNA定量檢測(cè)的質(zhì)量控制范圍。(4) 每次臨床樣本的檢測(cè),從步驟3開始,質(zhì)控品血漿都伴隨進(jìn)行。當(dāng)質(zhì)控品血漿DNA濃度在M±2SD范圍內(nèi),此次定量結(jié)果可信;當(dāng)質(zhì)控品血漿DNA濃度在M±2SD范圍外,此次定量結(jié)果不可信,重復(fù)步驟3、4、5。(5) 每10次在M±
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