血漿DNA定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程資料

1、血漿DNA定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心2007年12月第1版1. 血液樣本的采集：(1) EDTA-K2抗凝真空采血管（無分離膠）采集外周靜脈血23 ml，充分顛倒混勻，記錄采集時(shí)間?；蛘?(2) EDTA-K2抗凝真空采血管（有分離膠）采集外周靜脈血23 ml，充分顛倒混勻，記錄采集時(shí)間。2. 血液樣本的處理：分離血漿(1) 步驟1-(1)的抗凝血經(jīng)3 000 rpm低速離心10 min后，吸取上層血漿，再經(jīng)16 000 g高速離心10 min后，吸取上層血漿200l，加入到“血漿DNA定量樣品管”中（含50 000 copies質(zhì)粒DNA內(nèi)參照），余血漿樣本

2、-20及以下凍存。無法立即處理，見步驟3。(2) 步驟1-(2)的抗凝血經(jīng)3 000 rpm低速離心10 min后，吸取上層血漿200l，加入到“血漿DNA定量樣品管”中（含50 000 copies質(zhì)粒DNA內(nèi)參照），余血漿樣本-20及以下凍存。(3) 血液樣本采集后若無法立即處理，需詳細(xì)記錄采集時(shí)間，4或室溫保存（48h內(nèi)必須分離血漿）；密閉陰涼常溫下運(yùn)輸（48h內(nèi)必須完成運(yùn)輸并分離血漿）。3. 血漿樣本的處理：核酸的提取和純化(1) 采用磁珠法提取步驟2-(1)和2-(2)的200l血漿樣本中的微量DNA。具體操作如下： 在“血漿DNA定量樣品管”中加入200 µl 裂解液1和

3、4 µl蛋白酶，與待測(cè)血漿充分混勻后放55 水浴 15 min； 將離心管取出后每管加入600 µl 磁珠/結(jié)合液的混合液，振蕩混勻，室溫放置10 min，中間顛倒混勻一次； 將離心管側(cè)靠在磁珠分離操作臺(tái)的磁體上，放置 4 min，吸棄液體，注意不要碰或吸走紅色沉淀，將離心管拿離磁體； 在離心管內(nèi)加入200 µl 洗液3，將紅色沉淀振蕩，充分混勻，然后將離心管側(cè)靠在磁體上，放置1 min，吸棄液體，將離心管拿離磁體； 在離心管內(nèi)加入100 µl 洗液4，將紅色沉淀振蕩，充分混勻后，將離心管側(cè)靠在磁體上，放置1 min，吸棄液體，將離心管拿離磁體； 離心管

4、放在55 烤箱中干燥10 min； 在干燥后的離心管內(nèi)加入40 µl 洗脫液5，充分溶解紅色沉淀，在55 烤箱中保溫10 min，離心管側(cè)靠在磁體上，放置1 min，將液體取出放入干凈的無菌離心管內(nèi)，即為DNA提取液。(2) 血液樣本分離后得到的血漿若無法立即處理，需詳細(xì)記錄分離時(shí)間，-20及以下凍存，冰凍運(yùn)輸（48h內(nèi)必須完成運(yùn)輸并進(jìn)行核酸提?。?。4. 雙重?zé)晒舛縋CR：(1) 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，包括：去離子水、緩沖液、dNTPs、MgCl2、引物1、引物2、引物3、探針1、探針2、熱啟動(dòng)DNA聚合酶和DNA模板。反應(yīng)條件為：95預(yù)變性5min；94 30s，55 30

5、s，72 40s 共45個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束前采集一次熒光信號(hào)。(2) 提取的核酸樣本若無法立即檢測(cè)，需詳細(xì)記錄提取時(shí)間，-70及以下凍存（48 h內(nèi)必須進(jìn)行檢測(cè)）。5. 數(shù)據(jù)分析和計(jì)算：根據(jù)擴(kuò)增曲線的情況，設(shè)定基線和閾值，獲得各樣本的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)和Ct值。采用LinRegPCR軟件，根據(jù)熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，獲得各樣本擴(kuò)增效率，并分別計(jì)算內(nèi)參照物和目的基因的平均擴(kuò)增效率Ep和Eb。根據(jù)公式 計(jì)算各樣本的血漿DNA濃度（copies/ml），其中，Cp=250 000 copies/ml。再根據(jù)1copy人基因組DNA為3.3pg，將所得的結(jié)果（copies/ml）換算為血漿DNA濃度（ng/ml）。

6、6. 室內(nèi)質(zhì)量控制：(1) 按照步驟1-(1)收集數(shù)名健康體檢者抗凝靜脈血，經(jīng)3 000 rpm低速離心10 min后，吸取上層血漿，再經(jīng)16 000 g高速離心10 min，吸取上層血漿，獲得混合血漿約2 ml，作為質(zhì)控品血漿。(2) 取200l質(zhì)控品血漿，加入到“血漿DNA定量樣品管”中（含50 000 copies質(zhì)粒DNA內(nèi)參照干粉）。余步驟參照步驟3、4、5。(3) 重復(fù)步驟6-(2)共20次，計(jì)算質(zhì)控品血漿DNA濃度的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以M±2SD作為血漿DNA定量檢測(cè)的質(zhì)量控制范圍。(4) 每次臨床樣本的檢測(cè)，從步驟3開始，質(zhì)控品血漿都伴隨進(jìn)行。當(dāng)質(zhì)控品血漿DNA濃度在M±2SD范圍內(nèi)，此次定量結(jié)果可信；當(dāng)質(zhì)控品血漿DNA濃度在M±2SD范圍外，此次定量結(jié)果不可信，重復(fù)步驟3、4、5。(5) 每10次在M±