銳基HPV試劑盒操作流程及注意事項(xiàng)資料

1、銳基HPV試劑盒操作流程及注意事項(xiàng)一、 試劑組成成分1 DNA萃取試劑（4保存）：（1）A：DTAB Solution B：CTAB Solution C：Dissolving Solution 2 擴(kuò)增反應(yīng)組試劑（-20保存）：A：Pre-Mix B：HPV positive control(105 copies/l) C：Yeast tRNA D：IQzyme DNA Polymerase E：6X Loading Dye F：DNA Marker二、 模板制備1 不同組織的取樣：A：蝦苗檢體（1）取約 30只的檢體。（PL期之前的蝦苗約需50只左右，PL前期 ( PL12) 約需30只；

2、進(jìn)入PL12 30期的幼蝦（體長1 cm以上）僅取頭部即可。）（2）將其放入含600l DTAB Solution的1.5 ml 離心管中。（3）用研磨棒將蝦眼磨碎至溶液呈霧狀。B：肝胰腺（1）取約20 mg的樣品，放入含 600l DTAB Solution的1.5 ml 離心管中。（2）用研磨棒將其磨至呈霧狀。C：種蝦糞便（1）取長約1cm的樣品，放入含600l DTAB Solution的1.5ml 離心管中。（2）用研磨棒將其磨至霧狀。注意：離心管要提前在管蓋和管壁上用記號(hào)筆做好標(biāo)記，整齊放置于離心管架上；先用眼科剪剪取一定組織，再用牙簽小心挑取所需要的量，放于對(duì)應(yīng)的離心管中。切忌取太

3、多，否則影響DNA萃取質(zhì)量；每取一個(gè)樣品均需更換完剪刀、手套、保鮮袋和牙簽后，再進(jìn)行下一個(gè)樣的取樣；研磨時(shí)需小心，別將裂解液濺出，最好每研磨好一個(gè)離心管后更換一副手套。2 DNA萃取步驟（1）將完成取樣步驟的樣品置于75金屬浴中，5分鐘后取出置于室溫下。（可提前打開金屬浴讓其升溫至所需溫度）（2）冷卻后稍微振蕩，加入700l 氯仿，振蕩并充分混合20秒以上，再以12000 g離心5分鐘。（3）取上層液加入含100l CTAB與900 l ddH2O的全新2 ml 離心管中，振蕩器混合均勻后，置于75金屬浴5分鐘。（注意：取上層液時(shí)，必須非常小心，不可吸到接口處的白色物質(zhì)，大約能取400l。另可

4、少取，都不要碰，否則會(huì)使下一步溶液變得混濁。在上一步離心時(shí)，可往新離心管中加入相應(yīng)所需溶液。）（4）取出置于室溫下，冷卻后以12000 g離心10分鐘。（5）小心倒去上層液，加入150 l 的 Dissolving Solution，置于 75金屬浴5分鐘，然后冷卻至室溫。（6）以12000 g離心5分鐘，以去除不能溶解的雜質(zhì)，并將澄清的溶液吸入另一全新并含有300 l 95% 酒精的離心管中。（在上一步冷卻時(shí)，可往新離心管中加酒精。）（7）振蕩混合均勻之后，以12000 g離心5分鐘，使DNA沉淀下來，之后將酒精小心倒去。（8）加入200l 70% 酒精，振蕩之后，以12000 g離心3分鐘

5、。之后倒去酒精進(jìn)行風(fēng)干。風(fēng)干程度為不見水珠為止，時(shí)間靈活撐握。（風(fēng)干時(shí)，可配PCR反應(yīng)液。）（9） 溶解DNA沉淀。如果樣品取的是鰓，就加400l ddH2O；如果是其它組織，就加200l ddH2O。三、PCR擴(kuò)增1 陽性對(duì)照的制備：用2對(duì)18的比例配制。即先取2l 105 HPV的陽性樣品，再取18l的滅菌水，振蕩器混合均勻后，以4000g離心20s，此操作重復(fù)兩次。依此方法，配制104、103、102的陽性樣品。（注意小心操作，以免發(fā)生污染。操作熟練后，可不配102 陽性樣品。）2 反應(yīng)液配制：反應(yīng)液：Pre-Mix reagent 12.5 l IQzyme DNA Polymeras

6、e 0.5 l（1）按此比例算出樣品與陰、陽性對(duì)照所需的各種試劑的總體積，然后將各總體積相加，再乘以1.1倍，即是所要配的總體積。（2）先加Pre-Mix reagent，再加IQzyme DNA Polymerase，且每種試劑的量一定要加足夠。配好后再在振蕩器上混合均勻，放于4冰箱待用。（注意：拿出的試劑要放在冰盒上讓其完全解凍，振蕩離心兩次后再加，加完各種試劑后，要馬上將試劑放回冰箱。操作熟練后，可不配102 陽性樣品。）3 對(duì)PCR反應(yīng)管做好相應(yīng)標(biāo)記，先往每管中加反應(yīng)液13l，再加2l模板或?qū)φ?，陽性?duì)照最后加。加完后將PCR反應(yīng)管蓋子蓋好，再在微量振蕩器上振蕩約5s，放入PCR儀進(jìn)行

7、PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 20s 55 20s循環(huán)35次 72 30s 72 30s 20 30s四、 配制1%的膠進(jìn)行電泳1 稱取0.4g瓊脂糖放于錐形瓶中，再量取40ml的0.5TBE溶液混合，放于微波爐中煮沸，至溶液清徹透明為止，大約需1分40秒。2 冷卻到60時(shí)（放于掌心，能感覺到湯但又能忍受。）加2l核酸染料，搖勻。3 組裝好制膠器，并調(diào)至水平。將膠倒于制膠器中，插好梳子。待40分鐘膠冷卻凝固后，就可放于倒好電泳緩沖液的電泳槽中進(jìn)行點(diǎn)樣。4 取5-10l樣品溶液，加1-2l 6loading Dye，混合均勻后進(jìn)行點(diǎn)樣。每排點(diǎn)樣孔要點(diǎn)一個(gè)5l的Marker。5 點(diǎn)完后，調(diào)電泳儀

8、各參數(shù)進(jìn)行電泳：U：80V；A；200A；T：40min。五、結(jié)果判定1 下圖為各種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，以及實(shí)際檢體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1 2 3 4 5 6 7 MLane 1: WSSV標(biāo)準(zhǔn)品1, 20000 copies/reaction Lane 2: WSSV標(biāo)準(zhǔn)品2, 2000 copies/reaction Lane 3: WSSV標(biāo)準(zhǔn)品3, 200 copies/reaction Lane 4: HPV的陰性對(duì)照Lane 5: 中度感染HPV的樣品Lane 6: 輕度感染HPV的樣品Lane 7: HPV陰性樣品Lane M: 分子量標(biāo)記, 848 bp, 630 bp, 333 bp2 陰性的蝦類檢體會(huì)在730 bp處形成唯一的亮帶，此亮帶為內(nèi)控制組的PCR產(chǎn)物。3 判讀步驟：（1）在339 bp或339 bp 與553 bp處同時(shí)形成亮帶：陽性（2）在