第四章-細(xì)胞培養(yǎng)與代謝調(diào)控

1、第四章 細(xì)胞培養(yǎng)與代謝調(diào)控生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動物的細(xì)胞培養(yǎng)是指從活的機(jī)體中取出細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。從生物體內(nèi)取出細(xì)胞，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法 。將組織塊用機(jī)械方法或酶解法分離成單個(gè)細(xì)胞，做成細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質(zhì)上，成單層細(xì)胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術(shù)稱為細(xì)胞培養(yǎng)。第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型 按生長方式劃分：按生長方式劃分：1 1、粘附型、粘附型細(xì)胞細(xì)胞: :也叫貼壁型，附著

2、在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。也叫貼壁型，附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。2 2、懸浮型、懸浮型細(xì)胞細(xì)胞: :不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。3 3、半貼壁型、半貼壁型細(xì)胞：細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)生長，也可以在一定條件下貼壁生長。細(xì)胞：細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)生長，也可以在一定條件下貼壁生長。p 基本上植物細(xì)胞都是懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)方式，動物細(xì)胞是粘附型細(xì)胞培養(yǎng)方式。基本上植物細(xì)胞都是懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)方式，動物細(xì)胞是粘附型細(xì)胞培養(yǎng)方式。 p 絕大多數(shù)動物細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮絕大

3、多數(shù)動物細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長。狀態(tài)下生長。細(xì)胞貼壁過程細(xì)胞貼壁過程p貼附貼附p接觸抑制接觸抑制p密度抑制密度抑制細(xì)胞呈貼壁生長細(xì)胞呈貼壁生長, ,梭形或不規(guī)則形梭形或不規(guī)則形, , 在粘附因在粘附因子的作用下，細(xì)胞生出偽足，偽足越多，貼壁子的作用下，細(xì)胞生出偽足，偽足越多，貼壁越好。越好。細(xì)胞在生長過程中達(dá)到相互接觸時(shí)停止分細(xì)胞在生長過程中達(dá)到相互接觸時(shí)停止分裂的現(xiàn)象。因此，貼壁細(xì)胞通常都是單層裂的現(xiàn)象。因此，貼壁細(xì)胞通常都是單層細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)。細(xì)胞接觸后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營細(xì)胞接觸后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞

4、仍會增殖分裂，細(xì)胞數(shù)量仍養(yǎng)充分，細(xì)胞仍會增殖分裂，細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，液中營養(yǎng)成分減少， 代謝產(chǎn)物增多時(shí)，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。粘附型細(xì)胞分為：粘附型細(xì)胞分為：1 1、成纖維細(xì)胞型：、成纖維細(xì)胞型：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2323個(gè)長短不等的突起，個(gè)長短不等的突起，中有卵圓形核。生長時(shí)中有卵圓形核

5、。生長時(shí)排列成放射狀，漩渦狀排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連并不緊靠連成片成片，細(xì)胞，細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動，單獨(dú)行動，游離的游離的單獨(dú)的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸伸長的細(xì)胞突起。長的細(xì)胞突起。2 2、上皮型細(xì)胞：、上皮型細(xì)胞：類似類似體內(nèi)的體內(nèi)的上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞，扁平扁平，不規(guī)則多角形不規(guī)則多角形，中有圓形核。，中有圓形核。生長時(shí)生長時(shí)易相易相連連成片，成片，相靠相靠緊密相連緊密相連成薄層成薄層鋪石狀生長鋪石狀生長時(shí)呈時(shí)呈膜狀膜狀移動，移動，很少很少脫離細(xì)胞群而脫離細(xì)胞群而單單個(gè)活動。個(gè)活動。3 3、游走細(xì)胞型：、游走細(xì)胞型：呈散在生長，一般不

6、連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。4 4、多形型細(xì)胞：、多形型細(xì)胞：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 細(xì)胞培養(yǎng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)的條件1 1、無菌、無毒：、無菌、無毒：（1）對培養(yǎng)液和所有用具進(jìn)行無菌處理）對培養(yǎng)液和所有用具進(jìn)行無菌處理（2 2）添加一定量的抗生素，防治培養(yǎng)過程中的污染）添加一定量的抗生素，防治培養(yǎng)過程中的污染（3

7、 3）定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防治細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞自身造成危害）定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物防治細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞自身造成危害2 2、全部的營養(yǎng)物質(zhì)：、全部的營養(yǎng)物質(zhì)：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、促生長因子、微量元素、葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、促生長因子、微量元素、動物血清動物血清等。等。3 3、適宜的溫度和、適宜的溫度和PHPH值：值： 36.5+0.536.5+0.5度度, , PHPH值值7.2-7.47.2-7.44 4、必要的氣體條件：、必要的氣體條件：O O2 2 ：細(xì)胞代謝所必需的：細(xì)胞代謝所必需的COCO2 2：維持培養(yǎng)液的維持培養(yǎng)液的PHPH通常采用培養(yǎng)皿或松

8、蓋培養(yǎng)瓶將其置于含通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶將其置于含95%95%空氣和空氣和5%CO5%CO2 2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)5 5、其他：、其他：光照、濕度等光照、濕度等細(xì)胞培養(yǎng)的方式細(xì)胞培養(yǎng)的方式根據(jù)細(xì)胞生長方式細(xì)胞生長方式分為貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)兩大類；根據(jù)細(xì)胞代次細(xì)胞代次分為原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)；根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)操作方式分為：根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)操作方式分為：1 1、固定化培養(yǎng)：、固定化培養(yǎng)：通過一些固相的交聯(lián)化合物將細(xì)胞固定于小格中，或者通過共價(jià)鍵交聯(lián)住細(xì)胞，在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。2 2、分批培養(yǎng)：、分批培養(yǎng)：將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞

9、不斷增長，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將培養(yǎng)基連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。最后將培養(yǎng)基連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。3 3、流加培養(yǎng)：在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間斷地或連續(xù)地補(bǔ)加培養(yǎng)基。、流加培養(yǎng)：在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間斷地或連續(xù)地補(bǔ)加培養(yǎng)基。4 4、半連續(xù)培養(yǎng)：、半連續(xù)培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物或細(xì)胞，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物或細(xì)胞，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。5 5、連續(xù)培養(yǎng)：連續(xù)性加入新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)取出相同量的舊培養(yǎng)基和細(xì)胞。、連續(xù)培養(yǎng)：連續(xù)性加入新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)取出相同

10、量的舊培養(yǎng)基和細(xì)胞。6 6、灌流培養(yǎng)：、灌流培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。通常用于被固定后的細(xì)胞培養(yǎng)。地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。通常用于被固定后的細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1 1代細(xì)胞與傳代細(xì)胞與傳1010代以內(nèi)的代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成

11、細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。特殊的概念：特殊的概念：永生化細(xì)胞：永生化細(xì)胞：正常細(xì)胞的生長代謝處于增殖、分化、衰老及凋亡的動態(tài)平衡，體外增殖是有限的，培養(yǎng)細(xì)胞生命的自然極限稱為海弗利克極限。細(xì)胞內(nèi)控制這一系列過程的是一個(gè)龐大復(fù)雜的細(xì)胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生錯(cuò)誤，都有可能觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)相互關(guān)聯(lián)的一系列信號分子的表達(dá)和功能異常，使細(xì)胞跨越海弗利克極限，獲得不死性，發(fā)生永生化。細(xì)胞系：細(xì)胞系：指原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體。無限細(xì)胞系：無限細(xì)胞系：細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無

12、限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。有限細(xì)胞系：有限細(xì)胞系：初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞系的生存期限有限，為有限細(xì)胞系。原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞懸液懸液1010代細(xì)胞代細(xì)胞5050代細(xì)胞代細(xì)胞無限傳代無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)未改變?nèi)斯ふT導(dǎo)癌化人工誘導(dǎo)癌化細(xì)胞傳代及培養(yǎng)方法取動物組織塊取動物組織塊用用胰蛋白胰蛋白酶酶處理分處理分散成單個(gè)散成單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞通常選用通常選用幼齡動物組織或胚胎細(xì)胞幼齡動物組織或

13、胚胎細(xì)胞（細(xì)胞分化程度低，增（細(xì)胞分化程度低，增殖能力強(qiáng)，更易于培養(yǎng)）殖能力強(qiáng)，更易于培養(yǎng)）動物貼壁細(xì)胞培養(yǎng)過程動物貼壁細(xì)胞培養(yǎng)過程1、棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；2、加入0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)），靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。3、吸去胰蛋白酶液，加入一定量的培養(yǎng)液(以能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）。4、用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。5、吸取細(xì)胞懸液，300g離心2-5min，用新鮮的培養(yǎng)基重懸制備細(xì)胞懸液；6、分瓶接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加適量新鮮培養(yǎng)液。7、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法- -胰酶消化法胰酶消化法胰蛋白酶的消

14、化功能：p 胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。p 胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在 pH 為 8.0 、溫度為 37 時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。p 使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程1 懸浮生長細(xì)胞傳代： 離心法傳代：離心（300-500g/min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2 半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）： 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)

15、貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。懸浮型細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法懸浮型細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法- -離心法離心法植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)基特有成分蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素葡萄糖、動物血清葡萄糖、動物血清培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)結(jié)果完整的植物體完整的植物體細(xì)胞群體細(xì)胞群體培養(yǎng)目的培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無快速繁殖、培育無病毒植株等病毒植株等獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌

16、獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白等蛋白等正常細(xì)胞生命期正常細(xì)胞生命期是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間，包括原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期及衰退期衰退期。1、原代期：、原代期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。細(xì)胞呈活躍移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。2、傳代期：傳代期：體內(nèi)細(xì)胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。傳代期在細(xì)胞全生命期中的持續(xù)時(shí)間最長，細(xì)胞增殖旺盛。3、衰退期：、衰退期：此期細(xì)胞仍

17、然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。體外培養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞“一代一代”生存期生存期細(xì)胞細(xì)胞“一代一代”系指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中系指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞世代或倍增一代非同一含義。的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞世代或倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第如某一細(xì)胞系為第153153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153153次。它與細(xì)胞世代或倍增次。它與細(xì)胞世代或倍增不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3 36 6次。次。細(xì)胞細(xì)胞“一代一代”生存期包含生存期包含潛

18、伏期潛伏期、指數(shù)增生期指數(shù)增生期、停滯期停滯期和和衰退期衰退期。1 1、潛伏期、潛伏期（1 1）游離：）游離：懸浮，胞質(zhì)回縮懸浮，胞質(zhì)回縮, , 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形，約10分鐘至4小時(shí)。（2 2）吸附：）吸附：貼附底物，一般貼附底物，一般2424小時(shí)內(nèi)貼壁，小時(shí)內(nèi)貼壁，細(xì)胞株平均在10分鐘至4小時(shí)后貼壁。（3 3）潛伏：）潛伏：可有運(yùn)動活動，基本無增殖可有運(yùn)動活動，基本無增殖, , 少見分裂相，少見分裂相，一般為624小時(shí)。2 2指數(shù)增生期指數(shù)增生期p 細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多，細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多，群體均一是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。群體均一是理想的實(shí)

19、驗(yàn)用細(xì)胞。p 指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。p 指數(shù)增長期末期會出現(xiàn)指數(shù)增長期末期會出現(xiàn)接觸抑制和密度抑制現(xiàn)象。接觸抑制和密度抑制現(xiàn)象。3 3停滯期停滯期p 細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。細(xì)胞數(shù)量不再增加，細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱故也稱平臺期平臺期（PlateauPlateau）。）。p 停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積

20、累、產(chǎn)物積累、pHpH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。重則從底物脫落死亡。潛伏期潛伏期指數(shù)生長期指數(shù)生長期停滯期停滯期影響影響潛伏期長短的潛伏期長短的因素：因素：1 1、細(xì)胞種類細(xì)胞種類傳代傳代培養(yǎng)的細(xì)胞之培養(yǎng)的細(xì)胞之潛伏期潛伏期比原代培養(yǎng)的比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短細(xì)胞短。傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞。傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞6-24h6-24h，原代，原代24-96h24-96h或更長?；蚋L。連續(xù)細(xì)胞系連續(xù)細(xì)胞系 (6-24h)(6-24h)比有限細(xì)胞系與正常細(xì)胞系的比有限細(xì)胞系與正常細(xì)胞系的潛伏期短。潛伏期

21、短。2 2、接種的細(xì)胞密度、接種的細(xì)胞密度密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會較長3 3、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)條件培養(yǎng)液、培養(yǎng)液、pHpH、底物、污染、底物、污染, ,有毒有毒 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有限系有限系無限系無限系練習(xí)：練習(xí)：動物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于（動物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于（ ） A.A.培養(yǎng)基不同；培養(yǎng)基不同； B.B.動物細(xì)胞培養(yǎng)不需要在無菌條

22、件下進(jìn)行；動物細(xì)胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進(jìn)行； C.C.動物細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細(xì)胞不能；動物細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細(xì)胞不能； D.D.動物細(xì)胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細(xì)胞只能培養(yǎng)成植株。動物細(xì)胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細(xì)胞只能培養(yǎng)成植株。作業(yè)：作業(yè)：1 1、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的區(qū)別？、原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的區(qū)別？2 2、傳代培養(yǎng)細(xì)胞的特點(diǎn)？、傳代培養(yǎng)細(xì)胞的特點(diǎn)？3 3、簡述動物細(xì)胞培養(yǎng)過程？、簡述動物細(xì)胞培養(yǎng)過程？4 4、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件？、動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件？5 5、離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞分為那些類型及各自特點(diǎn)？、離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞分為那些類型及各自特點(diǎn)？第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞代謝與調(diào)控細(xì)胞代謝與調(diào)

23、控1、糖代謝與脂、糖代謝與脂肪代謝的相互肪代謝的相互關(guān)系關(guān)系2、糖代謝與蛋、糖代謝與蛋白質(zhì)代謝的相白質(zhì)代謝的相互關(guān)系互關(guān)系3、脂肪代謝與、脂肪代謝與蛋白質(zhì)代謝的蛋白質(zhì)代謝的相互關(guān)系相互關(guān)系4、核酸和其他、核酸和其他物質(zhì)代謝的相物質(zhì)代謝的相互關(guān)系互關(guān)系一、糖代謝與脂肪代謝的相互關(guān)系一、糖代謝與脂肪代謝的相互關(guān)系延胡索酸延胡索酸琥珀酸琥珀酸蘋果酸蘋果酸草酰乙酸草酰乙酸3-3-磷酸甘油磷酸甘油三羧酸三羧酸循環(huán)循環(huán)甘油甘油乙酰乙酰 CoACoA三酰三酰甘油甘油脂肪酸脂肪酸 糖原（或淀粉）糖原（或淀粉）1 1，6-6-二磷酸果糖二磷酸果糖磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸丙酮酸合

24、合成成植物或微生物特有植物或微生物特有 氧氧化化糖異生糖異生糖酵解糖酵解乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)二、糖代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關(guān)系二、糖代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關(guān)系草酰乙酸草酰乙酸乙酰乙酰CoACoA檸檬酸檸檬酸-酮戊二酸酮戊二酸 糖原（或淀粉）糖原（或淀粉）1 1，6-6-二磷酸果糖二磷酸果糖磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸丙酮酸糖酵解糖酵解甘油甘油丙氨酸丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸脫氨基脫氨基琥珀酸琥珀酸乙醛酸途徑乙醛酸途徑三羧酸途徑三羧酸途徑糖糖異異生生三、脂肪代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關(guān)系三、脂肪代謝與蛋白質(zhì)代謝的相互關(guān)系氨基酸碳架氨基酸碳架氨基酸氨基酸3-3-磷酸

25、甘油磷酸甘油甘油甘油乙酰乙酰 CoACoA三酰三酰甘油甘油脂肪酸脂肪酸合合成成 氧氧化化磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸丙酮酸四、核酸和其他物質(zhì)代謝的相互關(guān)系四、核酸和其他物質(zhì)代謝的相互關(guān)系甘氨酸甘氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺一碳單位一碳單位合成嘌呤合成嘌呤合成嘧啶合成嘧啶核酸核酸核苷酸核苷酸ATP ATP GTP GTP CTP CTP UTPUTP磷酸核糖磷酸核糖ADP+Gi ADP+Gi GDP+Gi GDP+Gi CDP+GiCDP+GiUDP+GiUDP+Gi雙糖或多糖雙糖或多糖磷酸戊糖途徑磷酸戊糖途徑葡萄糖葡萄糖能量和磷酸基團(tuán)的供應(yīng)能量和磷酸基團(tuán)的

26、供應(yīng)單糖的轉(zhuǎn)變和多糖的合成單糖的轉(zhuǎn)變和多糖的合成參與卵磷脂的合成參與卵磷脂的合成給蛋白質(zhì)合成提供能量給蛋白質(zhì)合成提供能量代謝調(diào)控總論代謝調(diào)控總論代謝調(diào)節(jié)的三級水代謝調(diào)節(jié)的三級水平平：p 細(xì)胞細(xì)胞/ /酶水平調(diào)節(jié)酶水平調(diào)節(jié)p 激素水平調(diào)節(jié)激素水平調(diào)節(jié)p 神經(jīng)水平調(diào)節(jié)多細(xì)胞整體水平調(diào)節(jié)代謝物通過影響細(xì)胞內(nèi)酶活力和酶合成量的變化，改變合成或分解代謝過程的速度內(nèi)分泌腺所分泌的激素通過體液輸送到一定組織，作用于靶細(xì)胞，改變酶活性而調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)的方向和速度。CNS的控制下，通過神經(jīng)遞質(zhì)對效應(yīng)器發(fā)生直接影響，或者改變激素的分泌。酶酶水水平平調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié) （酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)）（酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)）變（別）構(gòu)

27、調(diào)節(jié)變（別）構(gòu)調(diào)節(jié)快速調(diào)節(jié)快速調(diào)節(jié) （微調(diào)）（微調(diào)）酶合成的誘導(dǎo)與阻遏酶合成的誘導(dǎo)與阻遏 長期調(diào)節(jié)長期調(diào)節(jié) （粗調(diào)節(jié)）（粗調(diào)節(jié)）酶含量調(diào)節(jié)酶含量調(diào)節(jié) （基因表達(dá)水平調(diào)節(jié)）（基因表達(dá)水平調(diào)節(jié)）化學(xué)修飾調(diào)節(jié)化學(xué)修飾調(diào)節(jié)酶的降解酶的降解 p 細(xì)胞細(xì)胞/ /酶水平調(diào)節(jié)酶水平調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)-變構(gòu)調(diào)節(jié)變構(gòu)調(diào)節(jié)別構(gòu)效應(yīng)物別構(gòu)效應(yīng)物別構(gòu)激活劑別構(gòu)激活（正反饋）增加活性 別構(gòu)抑制劑別構(gòu)抑制（負(fù)反饋）降低活性某些代謝物能與變構(gòu)酶分子上的變構(gòu)部位特異性結(jié)合，使酶的分子構(gòu)象發(fā)生改變，從某些代謝物能與變構(gòu)酶分子上的變構(gòu)部位特異性結(jié)合，使酶的分子構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應(yīng)的速度。而改變酶的催

28、化活性以及代謝反應(yīng)的速度。p 被調(diào)節(jié)的酶稱為變構(gòu)酶或別構(gòu)酶被調(diào)節(jié)的酶稱為變構(gòu)酶或別構(gòu)酶p 使酶發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)，稱為變構(gòu)效應(yīng)劑。其中引起酶活性增加的變構(gòu)效應(yīng)劑成為使酶發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)，稱為變構(gòu)效應(yīng)劑。其中引起酶活性增加的變構(gòu)效應(yīng)劑成為變構(gòu)激活劑變構(gòu)激活劑 ；引起酶活性降低的變構(gòu)效應(yīng)劑稱為變構(gòu)抑制劑；引起酶活性降低的變構(gòu)效應(yīng)劑稱為變構(gòu)抑制劑。變構(gòu)調(diào)節(jié)的生理意義變構(gòu)調(diào)節(jié)的生理意義1 1、代謝終產(chǎn)物反饋抑制反應(yīng)途徑中的酶，使代謝物不致生成過多。、代謝終產(chǎn)物反饋抑制反應(yīng)途徑中的酶，使代謝物不致生成過多。乙酰乙酰CoACoA乙酰乙酰CoACoA羧化酶羧化酶丙二酰丙二酰CoACoA長鏈脂酰長鏈脂酰Co

29、ACoA2 2、變構(gòu)調(diào)節(jié)使能量得以有效利用，不致浪費(fèi)。、變構(gòu)調(diào)節(jié)使能量得以有效利用，不致浪費(fèi)。3 3、變構(gòu)調(diào)節(jié)使不同的代謝途徑相互協(xié)調(diào)。、變構(gòu)調(diào)節(jié)使不同的代謝途徑相互協(xié)調(diào)。G-6-PG-6-P糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶抑制糖的氧化抑制糖的氧化糖原合酶糖原合酶促進(jìn)糖的儲存促進(jìn)糖的儲存檸檬酸檸檬酸6-6-磷酸果糖磷酸果糖激酶激酶抑制糖的氧化抑制糖的氧化乙酰輔酶乙酰輔酶A A羧化酶羧化酶促進(jìn)脂酸合成促進(jìn)脂酸合成酶活性調(diào)節(jié)酶活性調(diào)節(jié)-共價(jià)修飾調(diào)節(jié)共價(jià)修飾調(diào)節(jié)酶蛋白肽鏈上某些殘基在酶的催化下發(fā)生酶蛋白肽鏈上某些殘基在酶的催化下發(fā)生可逆的共價(jià)修飾可逆的共價(jià)修飾，從而引起酶活性改變，這種調(diào)從而引起酶活性改變，

30、這種調(diào)節(jié)稱為節(jié)稱為酶的共價(jià)修飾酶的共價(jià)修飾。共價(jià)修飾的主要方式：共價(jià)修飾的主要方式：1 1、磷酸化磷酸化 - - - - - - 去磷酸去磷酸2 2、乙?；阴；?- - - - - - 脫乙酰脫乙酰3 3、甲基化甲基化 - - - - - - 去甲基去甲基4 4、腺苷化腺苷化 - - - - - - 脫腺苷脫腺苷5 5、單價(jià)巰基、單價(jià)巰基- - - - -二硫鍵二硫鍵-OH-OHThrThrSerSerTyrTyr酶蛋白酶蛋白H H2 2O OPiPi磷蛋白磷酸酶磷蛋白磷酸酶 ATP ATPADPADP蛋白激酶蛋白激酶ThrThrSerSerTyrTyr-O-PO-O-PO3 32-2-磷酸

31、化的酶蛋白磷酸化的酶蛋白共價(jià)修飾的特點(diǎn)：共價(jià)修飾的特點(diǎn)：1 1、酶蛋白的共價(jià)修飾是可逆的酶促反應(yīng)，在不同酶的作用下，酶蛋白的活性狀態(tài)可互相、酶蛋白的共價(jià)修飾是可逆的酶促反應(yīng)，在不同酶的作用下，酶蛋白的活性狀態(tài)可互相轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)變。2 2、具有、具有放大效應(yīng)放大效應(yīng)，效率較變構(gòu)調(diào)節(jié)高。，效率較變構(gòu)調(diào)節(jié)高。3 3、磷酸化與脫磷酸、磷酸化與脫磷酸是最常見的方式。是最常見的方式。4 4、同一個(gè)酶可以同時(shí)受變構(gòu)調(diào)節(jié)和化學(xué)修飾調(diào)節(jié)。、同一個(gè)酶可以同時(shí)受變構(gòu)調(diào)節(jié)和化學(xué)修飾調(diào)節(jié)。酶含量調(diào)節(jié)酶含量調(diào)節(jié)- -酶合成的誘導(dǎo)、阻礙和降解酶合成的誘導(dǎo)、阻礙和降解DNADNA轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物RNARNAmRNAmRNA蛋

32、白質(zhì)前體蛋白質(zhì)前體mRNAmRNA降解物降解物活性蛋白質(zhì)活性蛋白質(zhì)DNADNA水平調(diào)節(jié)水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)翻譯調(diào)節(jié)翻譯調(diào)節(jié)mRNAmRNA降解降解調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)翻譯后加工的調(diào)節(jié)翻譯后加工的調(diào)節(jié)核核細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)舉例：乳糖對乳糖操縱子的表達(dá)的影響舉例：乳糖對乳糖操縱子的表達(dá)的影響沒有乳糖存在時(shí)，沒有乳糖存在時(shí)，lac操縱子不表達(dá)操縱子不表達(dá)mRNAmRNAproteinproteinI IDNADNAZ ZY YA AO OP Ppolpol阻遏基因阻遏基因有乳糖存在時(shí)，有乳糖存在時(shí)，lac操縱子基因表達(dá)操縱子基因表達(dá)mRNAmRNAproteinprotei

33、nI IDNADNAZ ZY YA AO OP Ppolpolp 激素水平調(diào)節(jié)激素水平調(diào)節(jié)高等生物內(nèi)分泌腺分泌的激素通過體液轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞而對代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。激素激素激素激素激素激素靶細(xì)胞受體靶細(xì)胞受體細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)信號信號跨膜傳遞跨膜傳遞細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)按激素按激素受體受體在細(xì)胞的部位不同，可將激素分為兩大類：在細(xì)胞的部位不同，可將激素分為兩大類：1.1.膜受體激素：膜受體是存在于細(xì)胞表面質(zhì)膜上的跨膜糖蛋白。膜受體激素：膜受體是存在于細(xì)胞表面質(zhì)膜上的跨膜糖蛋白。2.2.胞內(nèi)受體激素：大多數(shù)位于細(xì)胞核內(nèi)，有的在胞液中的特異受體結(jié)合蛋白。胞內(nèi)受體激素：大多數(shù)位于細(xì)胞

34、核內(nèi)，有的在胞液中的特異受體結(jié)合蛋白。第一信使受體信號第二信使，產(chǎn)生級聯(lián)方法效應(yīng)。 E0E1En-1+ +或或- -反饋反饋+ +或或- -正作用：凡反應(yīng)物能使代謝過程速度加快者稱為正作用。正作用：凡反應(yīng)物能使代謝過程速度加快者稱為正作用。負(fù)作用：凡反應(yīng)物能使代謝過程速度變慢者稱為負(fù)作用。負(fù)作用：凡反應(yīng)物能使代謝過程速度變慢者稱為負(fù)作用。代謝調(diào)控的基本類型代謝調(diào)控的基本類型前饋前饋S0S1S2Sn1 1、前饋?zhàn)饔茫?、前饋?zhàn)饔茫╢eedforwardfeedforward） ：在代謝途徑中前面的底物對其后某一催化反應(yīng)在代謝途徑中前面的底物對其后某一催化反應(yīng)的調(diào)節(jié)酶有作用。的調(diào)節(jié)酶有作用。分為前饋

35、激活和前饋抑制，相當(dāng)于前饋正作用和前饋負(fù)作用。分為前饋激活和前饋抑制，相當(dāng)于前饋正作用和前饋負(fù)作用。2 2、反饋?zhàn)饔茫?、反饋?zhàn)饔茫╢eedbackfeedback）：）：代謝產(chǎn)物對前面的某一酶有作用。代謝產(chǎn)物對前面的某一酶有作用。分為反饋激活和反饋抑制，相當(dāng)于反饋正作用和反饋負(fù)作用。分為反饋激活和反饋抑制，相當(dāng)于反饋正作用和反饋負(fù)作用。 丙酮酸激酶丙酮酸激酶前饋激活前饋激活乙酰乙酰CoACoA羧化酶羧化酶前饋抑制前饋抑制1 1、前饋?zhàn)饔?、前饋?zhàn)饔肎 G6-P- G6-P- G6-P-F6-P-F1,6-2P-F1,6-2P-F磷酸烯醇丙酮酸(PEP)丙酮酸丙酮酸(1)(1)前饋激活（前饋激活（

36、feedforward activationfeedforward activation）(2)(2)前饋抑制前饋抑制(feedforward inhibition)(feedforward inhibition)乙酰乙酰CoA + COCoA + CO2 2 +H +H2 2O + ATP O + ATP 丙二酸單酰丙二酸單酰CoA + ADP+Pi CoA + ADP+Pi E1E2E3E4反饋抑制反饋抑制2.2.反饋?zhàn)饔梅答佔(zhàn)饔茫? 1）一價(jià)或單價(jià)反饋抑制，即直線式反饋控制，）一價(jià)或單價(jià)反饋抑制，即直線式反饋控制，只有一個(gè)末端代謝產(chǎn)物的途徑。A AB BC CD DP PE1E2E3E4

37、反饋抑制反饋抑制A AB BC CD DP Pb.b.協(xié)同反饋控制：協(xié)同反饋控制：分支代謝過程中，任何終產(chǎn)物都不能單獨(dú)地反饋該途徑，而當(dāng)所有終產(chǎn)物都過剩時(shí)才能協(xié)同地反饋控制該途徑。E1E1E2E2E3E3XYA AB BC CD DE4E4E5E5（2 2）二價(jià)或多價(jià)反饋抑制）二價(jià)或多價(jià)反饋抑制a.a.合作式反饋控制：合作式反饋控制：又稱增效型反饋，任何終產(chǎn)物單獨(dú)過剩時(shí)都能較弱的產(chǎn)生反饋控制，而當(dāng)所有終產(chǎn)物都過剩時(shí)能強(qiáng)烈產(chǎn)生反饋控制。E1E1E2E2E3E3XYA AB BC CD DE4E4E5E5E1E4E5XYc.c.順序式反饋控制：順序式反饋控制：又稱逐步反饋調(diào)節(jié)。分支代謝途徑中的一種

38、通過逐步有順序的方式達(dá)到的反饋調(diào)節(jié)方式。E1E2E3E4A AB BC CD DP PA AB BC CD DE2E3d.d.累積反饋控制：累積反饋控制：每一種終產(chǎn)物只能單獨(dú)地、部分地反饋共同代謝途徑中的一種酶，當(dāng)幾種終產(chǎn)物共同存在時(shí)，此反饋?zhàn)饔檬抢鄯e的。A AB BC CD DP PE1E2E3E4代謝途徑調(diào)控在細(xì)胞工程中的應(yīng)用代謝途徑調(diào)控在細(xì)胞工程中的應(yīng)用1、加速速度限制反應(yīng)：、加速速度限制反應(yīng)：第一步，確定代謝途徑中限速的關(guān)鍵酶；第一步，確定代謝途徑中限速的關(guān)鍵酶；第二步，在該代謝途徑中增加該關(guān)鍵酶量；第二步，在該代謝途徑中增加該關(guān)鍵酶量；第三步，加速該代謝途徑的速度第三步，加速該代謝途

39、徑的速度E1E2E3E4A AB BC CD DP P限速關(guān)鍵酶限速關(guān)鍵酶E3E3E3E1E2E3E4A AB BC CD DP P限速關(guān)鍵酶限速關(guān)鍵酶E3E3E3限速關(guān)鍵酶限速關(guān)鍵酶E1E12、改變分支代謝途徑的流向、改變分支代謝途徑的流向第一步，確定代謝途徑中分支代謝途徑的關(guān)鍵酶；第一步，確定代謝途徑中分支代謝途徑的關(guān)鍵酶；第二步，增加某一代謝途徑的關(guān)鍵酶活性或者酶量，使該分支途徑的反應(yīng)速度提高，從而第二步，增加某一代謝途徑的關(guān)鍵酶活性或者酶量，使該分支途徑的反應(yīng)速度提高，從而使其他分支途徑的反應(yīng)降低，產(chǎn)生競爭性抑制；使其他分支途徑的反應(yīng)降低，產(chǎn)生競爭性抑制；第三步，從而提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的量。第三步，從而提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的量。A