食品安全檢測(cè) 第二章樣品前處理技術(shù)

1、第二章 樣品前處理技術(shù)樣品前處理：樣品的制備和對(duì)樣品中待測(cè)組分進(jìn)行提取、凈化和濃縮的過(guò)程。在整個(gè)食品安全性的檢測(cè)分析中，70%80%甚至更多的時(shí)間用在樣品的前處理上，而給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的誤差有60%以上來(lái)自樣品的前處理。樣品前處理的目的就是濃縮被測(cè)物質(zhì)、消除基質(zhì)干擾、保護(hù)儀器、提高方法的準(zhǔn)確性、精密度、選擇性和靈敏度。主要的樣品前處理方法：1、超聲萃取；2、微波萃取；3、液固萃?。?、加速溶劑萃取；5、超臨界萃取；6、固相萃取；7、固相微萃??；8、基質(zhì)分散固相萃??；9、液液萃?。?0、微量化學(xué)法技術(shù)；11、液液萃??；12、柱層析樣品制備的基本要求1、食品危害殘留物質(zhì)分析,特點(diǎn)：基體復(fù)雜；目標(biāo)化合物檢

2、測(cè)限量越來(lái)越嚴(yán)格；某些危害殘留物質(zhì)在食品樣品中存在的濃度極低；各目標(biāo)化合物的性質(zhì)差異較大；可能同時(shí)存在多種組分。2、評(píng)價(jià)前處理方法是否合理,應(yīng)考慮的因素：操作是否簡(jiǎn)便、省時(shí)；被測(cè)組分的回收率是否高；成本是否低廉；對(duì)人體及環(huán)境是否產(chǎn)生影響。萃取技術(shù)萃?。河糜袡C(jī)溶劑等方法把被測(cè)物從試樣中提取出來(lái)，凈化后供測(cè)定使用。萃取技術(shù)要求溶劑盡可能選擇性溶解殘留危害物質(zhì)，而不是不溶解和少量溶解食品基體，萃取效果的關(guān)鍵是溶劑的選擇，殘留危害物質(zhì)提取回收率的大小直接決定整個(gè)分析步驟的精確度。分類(lèi)：1、液固萃??；2、超聲萃取；3、微波萃??；4、液液萃??；5、加速溶劑萃??；6、超臨界萃取1、萃取技術(shù)超聲萃取超聲萃取（

3、SAE）就是在溶劑萃取過(guò)程中引入超聲波，提高溶劑萃取的過(guò)程?；驹恚嚎栈?yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械作用。高頻聲波空化作用產(chǎn)生的極大壓力造成生物細(xì)胞及整個(gè)生物體破碎，同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解。影響SAE的因素：超聲波的強(qiáng)度、頻率、提取時(shí)間、提取溶劑等。􀁺SAE的操作方法：將樣品和溶劑放于密閉的容器中，置于一定能量的超聲波水浴中，數(shù)秒后拿出，再放入、拿出2、萃取技術(shù)微波萃取微波萃?。∕AE）就是在溶劑萃取過(guò)程中引入微波，加速溶劑萃取的過(guò)程?；驹恚海?）微波輻射能穿透萃取介質(zhì)到達(dá)物料內(nèi)部，物料吸收微波能，內(nèi)部溫度迅速上升，細(xì)胞內(nèi)部壓力增大而破裂；（2）

4、微波所產(chǎn)生的電磁場(chǎng)，加速被萃取成分向萃取溶劑界面的擴(kuò)散速率。微薄萃取工藝流程：微波萃取的設(shè)備：微波萃取罐、連續(xù)微波萃取線。微波提取成套生產(chǎn)線工藝組成流程：粉碎、預(yù)處理、微波提取、料液分離、濃縮系統(tǒng)等五個(gè)環(huán)節(jié)。MAE的影響因素：萃取溶劑、萃取溫度、時(shí)間、溶劑體積、試樣中的水分或濕度、基體物質(zhì)等。微波提取優(yōu)點(diǎn)：微波輔助提取是里外同時(shí)加熱。沒(méi)有高溫?zé)嵩?，消除了熱梯度，有效地保護(hù)功能成分；由于微波可以穿透式加熱，提取的時(shí)間大大節(jié)省；微波能有超常的提取能力，大大簡(jiǎn)化工藝流程。微波提取沒(méi)有熱慣性易控制，所有參數(shù)均可數(shù)據(jù)化；微波提取物純度高，可水提、醇提、油提；溶劑用量少（可較常規(guī)方法少5090）；微波設(shè)備

5、是用電設(shè)備，不需配備鍋爐，無(wú)污染、安全、屬于綠色工程；生產(chǎn)線組成簡(jiǎn)單，節(jié)省投資。3、萃取技術(shù)加速溶劑萃取加速溶劑萃取（ASE）就是采用常規(guī)溶劑在高溫高壓條件下進(jìn)行自動(dòng)萃取的技術(shù)。􀁺 基本原理：（1）提高溫度（50200 ）能加速溶質(zhì)分子的解析動(dòng)力學(xué)過(guò)程，減小解析過(guò)程的活化能；降低溶劑的粘度，減小溶劑進(jìn)入樣品基體的阻力；增加溶劑進(jìn)入樣品基體的擴(kuò)散；降低溶劑和基體樣品的表面張力，有利于萃取物與溶劑的接觸。（2）升高壓力（10.320.6 MPa）使溶劑的沸點(diǎn)升高；可保證易揮發(fā)性物質(zhì)不揮發(fā)；在壓力下可快速充滿萃取池。4、萃取技術(shù)超臨界流體萃取超臨界流體萃?。⊿PE）是以超臨界流體作

6、為萃取劑，把所需要的組分從復(fù)雜的樣品中提取出來(lái)的一種分離技術(shù)。超臨界流體性質(zhì)：超臨界流體的物理性質(zhì)介于氣體與液體之間。超臨界CO2的特點(diǎn)：1、在超臨界狀態(tài)下，流體具有氣液兩相的雙重特點(diǎn)；2、密度對(duì)溫度和壓力的變化十分敏感；3、來(lái)源廣，價(jià)格低廉；4、不燃燒、不助燃、操作安全；無(wú)毒、易揮發(fā)、操作后殘留物少；5、對(duì)設(shè)備無(wú)腐蝕；臨界溫度低?；驹恚撼R界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系，即利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的影響而進(jìn)行。 在萃取的過(guò)程中，超臨界流體具有很好的流動(dòng)性和滲透性，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)充分接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小不同的成分依次萃取出來(lái)；然后通過(guò)改

7、變溫度或壓力使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)析出，從而達(dá)到分離提純的目的。超臨界萃取條件的選擇：原料前處理（粒度、水分含量等）；萃取壓力；萃取溫度；流體的流量；改性劑；萃取時(shí)間；分離條件（溫度和壓力）等。超臨界萃取的特點(diǎn)：萃取和分離合二為一，不存在物料的相變過(guò)程，不需回收溶劑，操作方便，萃取效率高，而且能耗較少，節(jié)約成本；壓力和溫度都可以成為調(diào)節(jié)萃取過(guò)程的參數(shù)，因此工藝流程短、耗時(shí)少；超臨界流體的極性可以改變，一定溫度條件下，只要改變壓力或加入適宜的夾帶劑即可提取不同極性的物質(zhì)，可選擇范圍廣；SFE全過(guò)程不用有機(jī)溶劑，萃取物絕無(wú)殘留溶劑，無(wú)污染；CO2容易取得，且在生產(chǎn)過(guò)程中循環(huán)使用，真正

8、實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程綠色化，降低生產(chǎn)成本；萃取溫度低，可以有效保留生物活性，而且能把高沸點(diǎn)，低揮發(fā)性、易熱解的物質(zhì)在其沸點(diǎn)溫度以下萃取出來(lái)。凈化技術(shù)􀁺1、液液萃?。?、固相萃?。?、固相微萃??；4、基質(zhì)分散固相萃??；5、柱層析(凝膠、離子交換、親和、分配、吸附柱層析等）1、凈化技術(shù)固相萃取固相萃取（SPE）是在液液萃取和液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種的萃取技術(shù)。􀁺 基本原理：利用高效高選擇性的固體吸附劑（固定相）將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使其與樣品的基體和干擾化合物分離，然后用合適的洗脫液（另一種體積較小的溶劑）進(jìn)行洗脫或加熱解吸，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的

9、。􀁺固相萃取的實(shí)質(zhì)就是一種液相色譜分離，是一個(gè)包括液相和固相的物理萃取過(guò)程。分離模式也與液相色譜相同，分為正相、反相、離子交換等。固相萃取的類(lèi)型：石墨碳(反相)-SPE、離子交換樹(shù)脂-SPE、金屬配合物吸附劑-SPE、鍵合硅膠-SPE、聚合物吸附劑-SPE、免疫親和吸附劑-SPE、分子嵌入聚合物-SPE等。操作步驟：吸附劑的活化；加樣；萃取；淋洗；洗脫吸附劑的活化：在樣品萃取之前要用適當(dāng)?shù)娜軇┝芟摧腿≈刮絼┍３譂駶?rùn)；加樣：加入一定體積的被處理樣品溶液，使其完全通過(guò)吸附劑；淋洗：用溶劑強(qiáng)度較弱的溶劑選擇性洗去部分雜質(zhì)；洗脫：用溶劑強(qiáng)度較強(qiáng)的溶劑洗脫被測(cè)物。SPE的特點(diǎn)：可

10、以獲得高的回收率和高的富集倍數(shù)；減少了高純有機(jī)溶劑的用量，減少了對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)減少了有機(jī)溶劑中的雜質(zhì)對(duì)被測(cè)分析物的影響；無(wú)相分離操作，避免了乳化影響，易于收集分析物組分；操作簡(jiǎn)單、快速、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；但目標(biāo)化合物的回收率和精密度低于液液萃取。2、凈化技術(shù)固相微萃取􀁺固相微萃取（SPEM）是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型萃取分離技術(shù)，是一種基于液固吸附平衡的樣品富集方法，屬于非溶劑型選擇性萃取。􀁺基本原理：利用待測(cè)物在樣品基質(zhì)與萃取相之間的非均相平衡。將聚合物涂層纖維浸潤(rùn)在水相萃取物中，或保留在樣品頂空使待測(cè)組分?jǐn)U散吸附到石英纖維表面的固定相涂層（頂空固

11、相微萃?。?，待吸附平衡后，涂層纖維/進(jìn)樣頭立即轉(zhuǎn)移到GC或HPLC的進(jìn)樣口。SPME的萃取模式主要有三種：1、直接法，即將涂層纖維保留在樣品中，主要用于半揮發(fā)性的氣體液體樣品萃??；2、頂空法，即將涂層纖維放置在樣品頂空中，主要用于揮發(fā)性固體或廢水水樣萃??；3、膜方法，將涂層纖維放在經(jīng)過(guò)微波萃取及膜處理過(guò)的樣品中，主要用于難揮發(fā)性復(fù)雜樣品的萃取。樣品萃取：將SPME針管穿透樣品瓶隔墊，插入瓶中；推手柄桿使纖維頭伸出針管，纖維頭可以浸入水溶液中（浸入方式）或置于樣品上部空間（頂空方式），萃取時(shí)間大約2-30min；縮回纖維頭，然后將針管退出樣品瓶。􀁺GC分析：將SPME針管插入G

12、C儀進(jìn)樣口；推手柄桿，伸出纖維頭，熱脫附樣品進(jìn)色譜柱；縮回纖維頭，移去針管。HPLC分析：􀁺將SPME針管插入SPME/HPLC接口解吸池，進(jìn)樣閥置于“Load”位置；􀁺推手柄桿伸出纖維頭，關(guān)閉閥密封夾；􀁺將閥置于“Inject”位置，流動(dòng)相通過(guò)解吸池洗脫樣品進(jìn)樣；􀁺閥重新置于“Load”位置，縮回纖維頭，移走SPME針管。影響SPEM的因素：涂膜纖維性能、萃取時(shí)間、離子強(qiáng)度、解吸附時(shí)間和溫度等。􀁺SPEM的特點(diǎn)：集采集、濃縮于一體，簡(jiǎn)單方便，不造成二次污染。與液液萃取或固相萃取相比，具有操作時(shí)間短、樣品

13、量少、無(wú)需萃取溶劑、適于分析揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。免疫檢測(cè)技術(shù)免疫檢測(cè)技術(shù)是以抗原抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析檢測(cè)技術(shù)。在此基礎(chǔ)上結(jié)合一些生化或物理方法作為信號(hào)顯示或放大系統(tǒng)即可建立免疫測(cè)定法。即抗原可以特異性地與抗體結(jié)合，通過(guò)抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)?？乖悄茉跈C(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)，抗原進(jìn)入機(jī)體后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測(cè)定中，抗原是能與抗體結(jié)合的物質(zhì)，能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白。􀁺抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白（Ig），與免疫測(cè)定有關(guān)的主要為IgG和IgM。抗原與抗體間的

14、反應(yīng)是依靠局部的分子間作用力結(jié)合的。主要有四種：氫鍵、范德華力、靜電和疏水相互作用。抗原抗體結(jié)合反應(yīng)具有高度特異性、交叉反應(yīng)和可逆性?？乖贵w結(jié)合的理化特性主要表現(xiàn)為由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。一個(gè)成功的免疫學(xué)測(cè)定法必須具備的3個(gè)要素：性能優(yōu)良的抗體、靈敏而專一的標(biāo)記物和高效的分離手段。 現(xiàn)有的免疫測(cè)定方法很多，按照不同的方法分類(lèi)。經(jīng)典的免疫測(cè)定法不需要標(biāo)記物；標(biāo)記免疫測(cè)定法分為放射性標(biāo)記測(cè)定法和非放射性標(biāo)記測(cè)定法，按反應(yīng)介質(zhì)分為均相和非均相免疫測(cè)定法。經(jīng)典免疫測(cè)定法在食品安全衛(wèi)生分析上較少采用，而靈敏度高的非均相、非放射性標(biāo)記免疫測(cè)定法種類(lèi)繁多，發(fā)展較快、檢測(cè)靈敏度高，使用范圍廣。2、免疫學(xué)檢

15、測(cè)技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的基礎(chǔ)是抗原與抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記?；驹恚菏箍乖蚩贵w結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性;結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)后，結(jié)合的酶仍能催化底物生成有色物質(zhì)，而顏色的深淺可定量抗體或抗原的含量。材料和試劑：完整的ELISA試劑盒包括：已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）、酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）、酶催化的底物、陰性對(duì)照樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品（定性檢測(cè)）、參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定）、結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液、洗滌

16、液和酶反應(yīng)終止液。類(lèi)型：雙抗體夾心法測(cè)定抗原；雙抗原夾心法測(cè)抗體；間接法測(cè)抗體；競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體；競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原。3、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)放射免疫測(cè)定法（RIA）放射免疫測(cè)定法（RIA）是將放射性同位素檢測(cè)的高度敏感性與免疫反應(yīng)的高度選擇性相結(jié)合的一種免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。RIA的基礎(chǔ)是待測(cè)抗原和標(biāo)記抗原對(duì)有限量抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。基本原理：待測(cè)抗原是指人體內(nèi)某種微量活性物質(zhì)（如微生物和寄生蟲(chóng)抗原、激素、酶或藥物等），標(biāo)記抗原是將已知的上述物質(zhì)標(biāo)記上同位素（食品安全快速檢測(cè)中最常用的是3H和14C），具有示蹤作用。這兩種抗原具有共同的決定簇，都能與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異的結(jié)合。將標(biāo)記抗原（Ag*）和未標(biāo)記抗原（A

17、g）與特異性抗體（Ab）相混合，兩者競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合結(jié)果形成標(biāo)記的和未標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物。采用分離技術(shù)（如用活性炭）將Ag*-Ab、Ag-Ab復(fù)合物（B）和游的Ag、Ag*（F）分離，測(cè)定B和F的放射活性，繪制B/F對(duì)Ag量的關(guān)系曲線。測(cè)定時(shí)需先用一系列已知濃度的未標(biāo)記抗原和一定量標(biāo)記抗原及抗體相混合，然后測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)濃度抗原參加下的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的放射結(jié)合率（B/F），繪出標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。試驗(yàn)時(shí)，在相同條件下，根據(jù)待測(cè)抗原的放射性結(jié)合率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的抗原含量.4、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)PCRPCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），即通常說(shuō)的PCR體外擴(kuò)增技術(shù)，又稱無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)，是一種對(duì)

18、特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法，該方法操作簡(jiǎn)便，可使微量的特定DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增至幾百萬(wàn)倍，目前已在分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。依據(jù)DNA摸板的特性，模仿體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程，在體外合適的條件下以單鏈DNA為模板，以人工合成的寡核苷酸為引物，以四種脫氧核苷酸（dNTP）為底物，利用熱穩(wěn)定的聚合酶延的方向摻入核苷酸來(lái)特異地?cái)U(kuò)增DNA片段。􀁺PCR反應(yīng)過(guò)程通常由2040個(gè)循環(huán)組成，每個(gè)循環(huán)由高溫變性低溫復(fù)性適溫延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：加熱9395，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA變性，解離成單鏈，作為擴(kuò)增的模板；模板

19、DNA與引物的復(fù)性：溫度降至55左右，引物與單鏈DNA模板的互補(bǔ)序列特異性地結(jié)合引物的延伸：在適宜的溫度條件下，DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-復(fù)性-延伸三過(guò)程，DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升最終的擴(kuò)增量可用NN（E）n計(jì)算。理論上，單一拷貝基因經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物的拷貝數(shù)為1012。􀁺注：擴(kuò)增遵循酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理。第三章農(nóng)藥殘留量的檢驗(yàn)食品中農(nóng)藥殘留的分類(lèi)概1、農(nóng)藥􀁺農(nóng)藥：是指用于預(yù)防、消滅或者控制危害農(nóng)業(yè)、林業(yè)的病、蟲(chóng)、草

20、和其他有害生物以及有目的地調(diào)節(jié)植物、昆蟲(chóng)生長(zhǎng)的化學(xué)合成或者來(lái)源于生物、其他天然物質(zhì)的一種物質(zhì)或者幾種物質(zhì)的混合物及其制劑。􀁺分類(lèi)：按用途分：殺（昆）蟲(chóng)劑、殺菌劑、除草劑、殺線蟲(chóng)劑、殺螨劑、殺鼠劑、落葉劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等; 按化學(xué)組成分：有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯、有機(jī)氯、有機(jī)砷、有機(jī)汞等.2、農(nóng)藥殘留農(nóng)藥殘留：是指農(nóng)藥使用后殘存于生物體、食品（農(nóng)副產(chǎn)品）和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。當(dāng)農(nóng)藥過(guò)量或長(zhǎng)期施用，導(dǎo)致食物中農(nóng)藥殘存數(shù)量超過(guò)最大殘留限量（MRL）時(shí)，將對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生不良影響，或通過(guò)食物鏈對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中其他生物造成毒害。我國(guó)近年生產(chǎn)的高毒殺蟲(chóng)

21、劑主要有甲胺磷、甲基對(duì)硫磷氧樂(lè)果、久效磷、對(duì)硫磷、甲拌磷等，因而，這些農(nóng)藥目前在農(nóng)作物中殘留最嚴(yán)重。3、食品中農(nóng)藥殘留的來(lái)源：1、施用農(nóng)藥對(duì)農(nóng)作物的直接污染；􀁺2、農(nóng)作物從污染的環(huán)境中吸收農(nóng)藥；􀁺3、通過(guò)食物鏈污染食品；􀁺4、其他來(lái)源：糧庫(kù)內(nèi)使用熏蒸劑等對(duì)糧食造成的污染；禽畜飼養(yǎng)場(chǎng)所及禽畜身上施用農(nóng)藥對(duì)動(dòng)物性食品的污染；糧食貯存加工、運(yùn)輸銷(xiāo)售過(guò)程中容器、車(chē)船的混裝；事故性污染，用錯(cuò)農(nóng)藥品種和劑量，誤食等。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留量分析技術(shù)的一般過(guò)程常用的農(nóng)藥殘留分析樣品前處理技術(shù)􀂋1、樣品采集:(以蔬菜農(nóng)藥殘留量檢測(cè)的樣品采集為例)

22、采集對(duì)象：蔬菜基地：上市前的蔬菜市場(chǎng)：正在售賣(mài)的蔬菜檢測(cè)部位:大白菜、小白菜(去根、去外測(cè)菜葉)；蘿卜、胡蘿卜(取葉、根);番茄、茄子等(去蒂)。􀂋2、提取方法：萃取分離法、索氏抽提法、微波加熱提取法、超聲輔助提取法等(傳統(tǒng)技術(shù))。􀂋3、凈化方法：液液分配法、吸附柱色譜法、磺化法、凝結(jié)沉淀法、冷凍法、薄層色譜法等。􀂋4、濃縮方法：自然揮發(fā)法、吹氣法、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法。農(nóng)藥殘留分析樣品前處理新技術(shù)：固相萃取技術(shù)；固相微萃取技術(shù)；超臨界流體萃取技術(shù)；基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)；凝膠滲透色譜技術(shù)；免疫親和色譜技術(shù)；衍生化技術(shù)等農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)技術(shù)概述：目前我

23、國(guó)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有兩大類(lèi): 農(nóng)藥殘留色譜檢測(cè)法和快速檢測(cè)法。色譜檢測(cè)法是為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供依據(jù)。農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)法主要是防止有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留要重超標(biāo)的蔬菜和水果流入市場(chǎng)。常用的色譜檢驗(yàn)技術(shù)：薄層色譜法、紙色譜、氣相色譜、液相色譜法、GC-MS聯(lián)用技術(shù)。1 、薄層色譜（TCL）：半定量和定性檢測(cè)技術(shù)。􀂋TCL不需要特殊設(shè)備和試劑，方法簡(jiǎn)單、快速、直觀、靈活，TCL除用特殊的顯色劑觀察斑點(diǎn)顏色和用Rf定性外，與其它技術(shù)聯(lián)用，不僅可以定性，而且可以對(duì)樣品中待分離的一種或多種成分進(jìn)行定量分析。但是靈敏度不高，多把它作為分離手段。可同時(shí)分析多個(gè)樣品，多用于復(fù)雜混合物的

24、分離和篩選。2、氣相色譜技術(shù)（GC）􀁺基本原理：殘留的農(nóng)藥經(jīng)有機(jī)溶劑提取并經(jīng)凈化、濃縮后，注入氣相色譜儀、氣化后在載氣攜帶下于色譜柱中分離，并由檢測(cè)器檢測(cè)。􀁺GC是應(yīng)用最多的方法，占有關(guān)色譜法報(bào)道的70%以上。氣相色譜法具有高選擇性、高分離效能、高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)。易氣化，氣化后又不發(fā)生分解等的農(nóng)藥均可采用GC檢測(cè)。􀁺用于GC的檢測(cè)器主要有FID、ECD、NPD、TCD、FPD、MSD等。3、高效液相色譜技術(shù)（HPLC）􀁺HPLC可以分離檢測(cè)極性強(qiáng)、分子量大及離子型農(nóng)藥，尤其對(duì)不易氣化或受熱易分解的化合物更能顯示出它的突

25、出優(yōu)點(diǎn)。􀁺常用的液相色譜柱有8柱、18柱、氨基柱、硅膠柱等，檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器等。􀁺 近年來(lái)，HPLC的檢測(cè)效率、靈敏度、速度和操作自動(dòng)化程度現(xiàn)已成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)不可缺少的重要技術(shù)，其缺點(diǎn)是溶劑消耗量大，檢測(cè)器種類(lèi)較GC少，靈敏度不如GC高。4、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）􀁺GC-MS是將氣相色譜儀和質(zhì)譜儀串聯(lián)成為一個(gè)整機(jī)使用的檢測(cè)技術(shù)。它既具有氣相色譜高分離效能，又具有質(zhì)譜準(zhǔn)確鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可達(dá)到同時(shí)定性定量的檢測(cè)目的。用于農(nóng)藥和藥物殘留量檢測(cè)工作，特別是應(yīng)用于農(nóng)藥和藥物代謝物、降解物的檢測(cè)和多殘留檢測(cè)等具有突

26、出的特點(diǎn)。5、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）􀁺 LC-MS將氣相色譜儀和質(zhì)譜儀串聯(lián)成為一個(gè)整機(jī)使用的檢測(cè)技術(shù)。LC-MS可以首先將混合物分離為單一組分，之后再用質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。如此過(guò)程不僅可以得到更有意義的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，而且可以在一定程度上排除基質(zhì)干擾，克服離子抑制現(xiàn)象，優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)。液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)是殘留分析理想的檢測(cè)手段。對(duì)于需要高靈敏度、寬適用范圍、復(fù)雜基質(zhì)的多殘留快速篩選工作而言，液質(zhì)聯(lián)用無(wú)疑是首選的最佳檢測(cè)手段農(nóng)藥殘留量檢驗(yàn)新技術(shù)：超臨界流體色譜；毛細(xì)管電泳技術(shù)；直接光譜技術(shù)（近紅外光譜分析、熒光光譜分析）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)；酶抑制技術(shù)；生物傳感器技術(shù)；實(shí)驗(yàn)

27、室機(jī)器人1、超臨界流體色譜超臨界流體色譜（SCF）是以超臨界流體為流動(dòng)相的色譜分離檢測(cè)技術(shù)。􀁺特點(diǎn)：超臨界流體黏度小、傳質(zhì)阻力小、擴(kuò)散速度快，其分離能力和速度可與GC相比；其密度、溶解力和速度可與HPLC相比；且超臨界流體的物理、化學(xué)性質(zhì)都是密度的函數(shù)。􀁺超臨界流體色譜儀的工作流程：SFC的部件組成與HPLC很相似，包括流動(dòng)相輸送系統(tǒng)（泵、流量緩沖器和混合柱等）、色譜分離系統(tǒng)（進(jìn)樣器、色譜柱和柱溫箱等）、檢測(cè)系統(tǒng)（檢測(cè)器等）和計(jì)算機(jī)軟件。SCF以超臨界流體作為流動(dòng)相，它的密度隨壓力增加而增加，而密度的增加引起流動(dòng)相溶劑效率的提高，同時(shí)可縮短淋洗時(shí)間。在SFC

28、中采用程序升密度相對(duì)于GC中的程序升溫和HPLC中的梯度洗脫，并且SFC可以與大部分GC和HPLC的檢測(cè)器相連，許多在GC上需經(jīng)過(guò)衍生化才能分析的農(nóng)藥，都可以用SFC直接測(cè)定。2、毛細(xì)管電泳（CE）毛細(xì)管電泳（CE）是以高壓（可達(dá)30 kV）下產(chǎn)生的強(qiáng)電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以小內(nèi)徑的石英毛細(xì)管（常用25100m）為分離通道，依據(jù)各組分之間電泳淌度或分配系數(shù)的差異實(shí)現(xiàn)分離。􀁺特點(diǎn)：CE是電泳技術(shù)與色譜技術(shù)的完美結(jié)合，分離速度快，分離效果好，儀器結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單。􀁺CE根據(jù)分離模式的不同，可分為毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦電泳、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜和毛細(xì)管電

29、色譜。農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留量分析技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法1、生化檢測(cè)法（膽堿酯酶抑制法）：速測(cè)卡、酶片、速測(cè)儀、生物傳感器等2、免疫分析法（抗體抗原反應(yīng)）：ELISA試劑盒、免疫傳感器等3、活體生物測(cè)定法（發(fā)光細(xì)菌或敏感性家蠅）速測(cè)卡法：速測(cè)卡法（紙片法）是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)快速檢驗(yàn)方法蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量快速檢測(cè)。1、測(cè)定范圍：由酶抑制法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速檢驗(yàn)方法，適用于蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速篩選測(cè)定。 2、原理：3、試劑：速測(cè)卡: 固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯的紙片；pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g Na2HP

30、O4·12H2O與1.59g KH2PO4，用500mL蒸餾水溶解。4、儀器：常量天平；有條件時(shí)配備37±2恒溫裝置；有條件時(shí)配備專為速測(cè)卡而設(shè)計(jì)的“農(nóng)藥殘留速測(cè)儀”和超聲波提取器。5、分析步驟(1)表面測(cè)定法（粗篩法）：1)擦去蔬菜表面泥土，滴23滴緩沖溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。2)取一片速測(cè)卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。放置10min進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，有條件時(shí)在37恒溫裝置中進(jìn)行。注：預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。3)將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min。4)每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡。（同時(shí)進(jìn)行）思考：空白對(duì)照卡不變藍(lán)的原因

31、？（2）整體測(cè)定法：1)選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見(jiàn)方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2min以上。2）取一片速測(cè)卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min進(jìn)行預(yù)反應(yīng)。注：預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤(rùn)。3）將速測(cè)卡對(duì)折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min。4）每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)緩沖液的空白對(duì)照卡。思考：蔬菜剪得太碎對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有怎樣的影響？6、結(jié)果判定和表述：檢測(cè)結(jié)果以酶被有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥抑制（陽(yáng)性）和未抑制（陰性）來(lái)表示。8、速測(cè)卡法檢測(cè)注意事項(xiàng)􀁺 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇等含有對(duì)酶有影響的

32、植物次生物質(zhì)的樣品，應(yīng)采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測(cè)定法；對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。􀁺當(dāng)溫度低于37時(shí)，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)。延長(zhǎng)時(shí)間的確定，以空白對(duì)照卡用手指捏3min時(shí)可以變藍(lán)，且樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照卡放置的時(shí)間一致才有可比性。􀁺紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)時(shí)間以3min為準(zhǔn)。速測(cè)卡對(duì)農(nóng)藥非常敏感，測(cè)定時(shí)如果附近噴灑農(nóng)藥或使用殺蟲(chóng)劑，以及操作者和器具沾有微量農(nóng)藥，都會(huì)造成對(duì)照和測(cè)定藥片不變藍(lán)。酶抑制率法：酶抑制率（分光光度法）是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)快速檢驗(yàn)方法蔬菜中有機(jī)磷和

33、氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量快速檢測(cè)。1、測(cè)定范圍：由酶抑制法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速檢驗(yàn)方法，適用于蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速篩選測(cè)定。􀁺 2、原理：3、試劑􀁺 pH8.0緩沖溶液：取11.9mg無(wú)水磷酸氫二鉀與3.2mg磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。 顯色劑：取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，在4冰箱中保存。􀁺底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿加8.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置于4冰箱中保存，保存期不超過(guò)一周。􀁺乙酰膽堿酯酶：根

34、據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，但吸光度值應(yīng)控制在0.3以上。可選用以上試劑制備的試劑盒。4、儀器：常量天平；37±2恒溫水浴或恒溫箱；分光光度計(jì)或農(nóng)殘快速測(cè)定儀5、分析步驟樣品處理：選取有代表性的蔬菜，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見(jiàn)方碎片，取1g放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩12min，倒出提取液，靜置35min，待測(cè)。對(duì)照溶液測(cè)試：先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37放置15min以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致，30min）。加入0.lmL底物搖勻，此時(shí)檢液開(kāi)始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3min的吸

35、光度變化值或儀器記錄值A(chǔ)0；樣品測(cè)試：于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值A(chǔ)t。思考：樣品處理對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可能有哪些影響？6、結(jié)果處理（1）結(jié)果計(jì)算􀁺Ac對(duì)照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；􀁺At樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值。（2）結(jié)果判定：當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率50%時(shí)，表明蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥存在，樣品檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果，則檢驗(yàn)需要重復(fù)兩次以上，并可用其他方法進(jìn)一步具體確定農(nóng)藥品種和含量。7、酶抑制率法的使用注意事項(xiàng)􀁺蔥、蒜、胡蘿卜、生姜、韭菜及番茄汁液等，

36、含有對(duì)酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。處理這類(lèi)樣品時(shí)，不要剪得太碎，浸提時(shí)間不要太長(zhǎng)，必要時(shí)可采取整株（體）蔬菜浸提法。對(duì)一些含葉綠素較高的蔬菜也是如此。􀁺 當(dāng)溫度條件低于37時(shí)，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)相對(duì)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)時(shí)間的確定應(yīng)以膽堿酯酶空白對(duì)照測(cè)試3min的吸光度變化A0值在0.3以上，即可往下操作。且樣品放置時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照溶液放置的時(shí)間一致。􀁺當(dāng)吸光度過(guò)大無(wú)法讀取時(shí)，說(shuō)明測(cè)定溶液渾濁有干擾。􀁺 乙酰膽堿系統(tǒng)是2003年衛(wèi)生部批準(zhǔn)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.199-2003蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量快速檢

37、測(cè)方法時(shí)開(kāi)始使用的，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蔬菜農(nóng)殘檢測(cè)用乙酰膽堿系統(tǒng)取代丁酰膽堿（NY/T 448-2001）。8、速測(cè)卡法與酶抑制率法的比較􀁺共同點(diǎn)：兩種方法的原理、緩沖（提取）溶液pH值、測(cè)定中的干擾物質(zhì)和排除方法基本相同。􀁺速測(cè)卡法檢出限：在使用速測(cè)卡法檢出蔬菜樣品為農(nóng)藥陽(yáng)性時(shí)，即可視為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)的農(nóng)藥已超標(biāo)。在有條件的單位，可用氣相色譜儀或質(zhì)譜儀對(duì)陽(yáng)性試樣進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。􀁺酶抑制率法的選擇：在氣相色譜分析儀還未問(wèn)世時(shí)，對(duì)有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥的檢測(cè)即采取了酶抑制率法，只是由于當(dāng)時(shí)酶的純度不夠高、靈敏度較低、酶試劑保存期短、及方法不能區(qū)分出具體的

38、農(nóng)藥而被氣相色譜法所取代。而今用其作為快速分析則恰到好處。只是現(xiàn)在酶試劑的質(zhì)量還應(yīng)進(jìn)一步提高，有效保存期應(yīng)設(shè)法延長(zhǎng)。因此，在實(shí)驗(yàn)前，必需測(cè)試酶的活性，達(dá)到要求后才能往下進(jìn)行。􀁺相比之下，速測(cè)卡法操作簡(jiǎn)單、使用方便，常溫下試藥的有效期可達(dá)一年；酶抑制率法操作要煩瑣些，夏天時(shí)，試藥需要冷藏運(yùn)輸，但以數(shù)字形式讀取數(shù)據(jù)，較為直觀。酶抑制法1、方法特點(diǎn)：檢測(cè)對(duì)象廣泛（有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥），且適用于一些基質(zhì)復(fù)雜的樣品，如：蔬菜、水果、茶葉和肉等。靈敏度高。適用的溫度范圍廣，在1535下可直接測(cè)定，無(wú)需其它溫控設(shè)施。比色波長(zhǎng)為600nm。樣品測(cè)定時(shí)，無(wú)需設(shè)置對(duì)照。測(cè)定結(jié)果表示簡(jiǎn)單

39、，無(wú)需計(jì)算抑制率，由吸光度直接判定。2、原理：3、儀器和試劑常量天平；分光光度計(jì)。􀁺緩沖液：pH 7.71的磷酸鹽緩沖液（適用于蔬菜等的檢測(cè)）；pH 8.0的Tris鹽酸緩沖液（適用于茶葉、肉等的檢測(cè)）。􀁺底物溶液：2%碘化硫代乙酰膽堿水溶液。􀁺顯色劑：0.04%的2,6-二氯靛酚水溶液。􀁺氧化劑：0.5%次氯酸鈣水溶液。􀁺還原劑：10%亞硝酸鈉水溶液。􀁺膽堿酯酶液：0.2g膽堿酯酶酶粉溶于10mL緩沖液中。􀁺脫色劑：活性炭。􀁺丙酮：分析純。h

40、8698;碳酸鈣：分析純。4、分析步驟5、結(jié)果判定：6、注意事項(xiàng)􀁺 若室溫低于15，建議使用30水浴，即提取液要在水浴中預(yù)熱，并且加入酶液后的試管也需要放置于水浴中，同時(shí)室溫也應(yīng)控制在20以上。􀁺速測(cè)試劑對(duì)農(nóng)藥非常敏感，測(cè)定時(shí)如果附近噴灑農(nóng)藥或使用衛(wèi)生殺蟲(chóng)劑，以及操作者和器具沾有微量農(nóng)藥，都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)影響。􀁺分光光度計(jì)長(zhǎng)期處于開(kāi)機(jī)等待狀態(tài)時(shí)，應(yīng)將比色室蓋打開(kāi)，避免儀器感光元件因過(guò)度疲勞而損壞。方法的比較􀁺 思考題：根據(jù)蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的生物化學(xué)測(cè)定的課程實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)速測(cè)卡法和酶抑制率法快速檢測(cè)蔬菜中農(nóng)藥殘

41、留量的實(shí)驗(yàn)。分析所有可能的影響因素。第四章 獸藥殘留量的檢驗(yàn)獸藥與獸藥殘留獸藥：預(yù)防和治療畜禽疾病的藥物；促進(jìn)生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)性能、改善動(dòng)物性食品的品質(zhì)；也包括一些化學(xué)的、生物的動(dòng)物保健品或飼料添加劑。􀂋 獸藥殘留：是“獸藥在動(dòng)物源食品中的殘留”的簡(jiǎn)稱，是指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及（或）其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。獸藥殘留產(chǎn)生的原因：非法使用違禁或淘汰藥物；不遵守休藥期規(guī)定；濫用藥物；違背有關(guān)標(biāo)簽的規(guī)定；屠宰前用藥。獸藥殘留的類(lèi)型：1、抗生素類(lèi)：氯霉素、四環(huán)素、土霉素、青霉素等。􀂋2、磺胺類(lèi)：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等。􀂋

42、;3、呋喃類(lèi)：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。􀂋4、激素和-興奮劑：鹽酸克倫特羅、己烯雌酚、孕酮等。􀂋5、抗寄生蟲(chóng)類(lèi)：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。獸藥殘留的危害：毒性損害；引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)；導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性；破壞微生態(tài)平衡，導(dǎo)致二重感染；致畸、致癌、致突變作用；影響生態(tài)環(huán)境；影響畜牧業(yè)的發(fā)展。獸藥殘留的分析方法：獸藥殘留的檢驗(yàn)分析方法包括篩選、檢測(cè)和確認(rèn)。篩選方法：微生物檢驗(yàn)（微生物抑制試驗(yàn)）免疫法（免疫檢測(cè)試劑盒）檢測(cè)和確認(rèn)方法：理化檢驗(yàn)技術(shù)（GC、HPLC、TLC、GC-MS、HPLC-MS等）。水產(chǎn)品中氯霉素的檢驗(yàn)􀂋

43、;氯霉素（CAP）是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的一種光譜抗生素。CAP對(duì)造血系統(tǒng)有毒性反應(yīng)，是一種禁用藥。􀂋氯霉素的檢測(cè)方法主要有：微生物篩選法、GC（ECD）、HPLC（UV）、GC-MS、GS-MS/MS、ELISA以及RIA等。對(duì)蝦中氯霉素含量的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)*競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的基本原理（以競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定氯霉素抗原為例）：酶標(biāo)抗原與樣品或標(biāo)準(zhǔn)體中的非標(biāo)記抗原（氯霉素）具有相同的與抗體結(jié)合的能力，兩者競(jìng)爭(zhēng)與固相載體包被的抗體結(jié)合。洗滌多余的酶標(biāo)抗原，加酶反應(yīng)的底物顯色后根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定量。􀂋在整個(gè)反應(yīng)當(dāng)中，樣品中氯霉素含量越多，反應(yīng)顯色就越

44、淡。反之，樣品中氯霉素含量越少，則顯色越深。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：為了達(dá)到某種特定的目的，使用多種實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和設(shè)備，按照可行的實(shí)驗(yàn)原理，列出實(shí)驗(yàn)的操作順序、確定各步驟的操作方法，列出實(shí)驗(yàn)必須的注意事項(xiàng)。1）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模哼M(jìn)一步學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)法的基本原理和實(shí)驗(yàn)方法，確實(shí)掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定蝦肉中氯霉素含量的基本原理、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果的分析。2）實(shí)驗(yàn)原理3）主要試劑：氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。氯霉素檢測(cè)試劑盒的組成：微量測(cè)試孔；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液；10倍濃縮萃取稀釋液；10倍濃縮洗滌液；氯霉素酶標(biāo)記物；底物溶液；反應(yīng)終止液。4）主要儀器：簡(jiǎn)易的萃取設(shè)備、氮

45、吹儀、離心機(jī)、酶標(biāo)分析儀。4、實(shí)驗(yàn)步驟（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮萃取稀釋液、濃縮洗滌液、酶標(biāo)記物、底物溶液及微量測(cè)試孔條置于室溫下回溫30 min。配制原倍萃取稀釋液及洗滌液：用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別按1:9的比例稀釋。（2）樣品制備：將3g蝦肉剪碎后放入50mL帶塞離心管中，加入6mL乙酸乙酯，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)約1min，再震蕩約30s。離心（3000rpm，10 min），取2mL上清液至玻璃管中，于50下氮?dú)獯蹈?。于上述玻璃管中加入正己?mL，先將殘余物完全溶解后，再加入1mL原倍萃取稀釋液，震蕩約30s。離心（3000rpm，10min

46、），用吸管吸去上層液及中間乳化層部分，棄掉，取下層液備用。若乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，則先將大部分上層液取出后，再將玻璃管置入80水中，隔水加熱約510min。（3）操作步驟：取一定的微量測(cè)試孔條，于適當(dāng)微孔中分別加入100L標(biāo)準(zhǔn)溶液。在另外的微孔中加入100L已完成前處理的樣品溶液。在每一微孔中加入50L酶標(biāo)記物。輕敲盤(pán)子四周，使其充分混合后室溫下避光靜置溫育1h。甩掉反應(yīng)液，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)3次。最后一次甩掉洗液后，在吸水紙上拍干。每一微孔中加入底物溶液100L，輕敲盤(pán)子四周。于室溫下避光靜置溫育20min。于每一微孔中加入100L反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450nm下判讀。5、結(jié)果

47、處理：所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)吸光值和樣品吸光值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（零標(biāo)準(zhǔn)）的吸光值（B0）再乘以100。以B/B0的百分?jǐn)?shù)值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度（ppb）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)半對(duì)數(shù)曲線。根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0的百分?jǐn)?shù)值就可從曲線上讀出相對(duì)應(yīng)樣品的濃度（ppb）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度乘以樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出樣品中氯霉素的實(shí)際濃度，最后的結(jié)果用“g/kg”單位表示。6、注意事項(xiàng)：使用前先將取出置于室溫下，回溫30min?；販睾?，取出所需微量測(cè)試孔條，將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置于4保存。濃縮萃取稀釋液和濃縮洗滌液使用前必須稀釋。每次吸取不同的液體時(shí)一定要換移液槍的吸頭。加樣時(shí)必須小心勿濺出

48、微孔外，以免造成其他微孔的污染，加樣品或試劑時(shí)槍頭請(qǐng)勿接觸微孔，不可產(chǎn)生氣泡。洗滌必須充分，重復(fù)3次。溫育時(shí)，要蓋上塑料片或標(biāo)簽紙，置于暗處，溫育時(shí)間不夠不要隨意取出；顯色后盡快比色。試劑盒較貴且量很少，準(zhǔn)確量取，不要造成浪費(fèi)。7、分析與討論為什么氯霉素含量與顯色成反比？加底物進(jìn)行溫育反應(yīng)后不顯色的原因？洗滌不徹底會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？為什么？標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離（線性不好）的原因有哪些？樣品吸光值高于標(biāo)準(zhǔn)吸光值的原因？避光溫育時(shí)間不夠會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有怎樣的影響？影響氯霉素酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)準(zhǔn)確的因素有哪些？豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)鹽酸克倫特羅（CLB）是2-受體興奮劑。是一種腎上腺素神經(jīng)興奮劑，屬于

49、激素類(lèi)興奮劑，是國(guó)家按興奮劑管理的藥品，為人、畜呼吸系統(tǒng)藥物（氨哮素、克喘素）。鹽酸克倫特羅可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，加速脂肪轉(zhuǎn)化，提高瘦肉率，被俗稱為“瘦肉精”。非法使用鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑，使用量大（是治療劑量的5-10倍），使用時(shí)間長(zhǎng)（持續(xù)添加時(shí)間一般3周以上），代謝慢，因而容易在動(dòng)物體內(nèi)（尤其是眼、肺、肝、腎）殘留。􀂋鹽酸克倫特羅通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，產(chǎn)生蓄積中毒，如頭暈、乏力、心律失常等。因此，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)禁止-腎上腺素激動(dòng)劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用。感官識(shí)別：健康肉淡紅色，肉質(zhì)彈性好，無(wú)“出汗”現(xiàn)象；“問(wèn)題肉”特別鮮紅，脂肪非常薄，瘦肉纖維疏松，有“出汗”現(xiàn)象。克倫特羅的檢驗(yàn)方

50、法：HPLC、GC-MS、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法和免疫分析法豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)GS/MS法*動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定第一法GC/MS法。􀂋 基本原理：固體樣品剪碎，用高氯酸溶液勻漿。若為液體試樣，則加入高氯酸溶液，進(jìn)行超聲加熱提取，用異丙醇+乙酸乙酯（40+60）萃取，有機(jī)相濃縮，經(jīng)弱陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行分離，用乙醇+濃氨水（98+2）溶液洗脫，洗脫液濃縮，經(jīng)N,O-雙三甲級(jí)硅烷三氟乙酰胺衍生后于氣質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行測(cè)定，以美托洛爾為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行定量。豬組織中鹽酸克倫特羅的檢驗(yàn)ELISA法*動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定第三法ELISA法。􀂋基本原理：微孔

51、板包被有針對(duì)克倫特羅IgG的抗抗體；加入克倫特羅抗體，經(jīng)過(guò)溫育和洗滌后；加入酶標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液，克倫特羅與酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合；沒(méi)有連接的克倫特羅酶標(biāo)記物在被洗滌除去；加入酶底物和發(fā)色劑并且溫育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑為藍(lán)色的產(chǎn)物，加入反應(yīng)終止液使顏色有藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處比色測(cè)定。酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵操作：1）試劑盒的選擇和準(zhǔn)備：固相載體：吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差異；包被物：純度；儲(chǔ)存條件：2-8；室溫平衡：試驗(yàn)用試劑應(yīng)提前1-2h從冰箱中取出，待溫度與室溫平衡后使用；及時(shí)保存：試劑完畢后不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。2）試劑的處理：盡可能使用新鮮樣

52、本；進(jìn)行必要的前處理。3）加樣：加樣前樣本必須混合均勻；加在板孔底部，避免加在孔壁上部；不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡；每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加酶結(jié)合物和底物時(shí)可用定量多道加液器。4）溫育：溫育前必須震動(dòng)混勻，但不可濺出；溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確；溫育必須避光。5）洗滌：清洗必須徹底；避免出現(xiàn)板孔干燥；反轉(zhuǎn)傾空微孔板要迅速，避免清洗液混合。6）顯色和比色：顯色的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確；顯色必須避光；使用多道加液器加終止液；顯色完畢后盡快比色測(cè)定。 第五章毒素的檢驗(yàn)毒素是活的生物有機(jī)體中存在的或向外界釋放、分泌的一類(lèi)具有明顯生物活性的物質(zhì)。毒素分類(lèi)（按來(lái)源）：1、植物毒素：

53、含甙類(lèi)植物：氰苷、皂苷等含生物堿類(lèi)植物：烏頭堿、雷公藤堿等含毒蛋白類(lèi)植物：相思豆、巴豆樹(shù)等含酚類(lèi)化合物植物：兒茶酚等2、動(dòng)物毒素：蛇毒：海蛇、蝰蛇、眼睛蛇、響尾蛇爬蟲(chóng)類(lèi)：毒蜥蜴兩棲類(lèi)：青蛙、蟾蜍和蠑螈昆蟲(chóng)：蜈蚣、蝎子、蜘蛛、蜜蜂、螞蟻等魚(yú)類(lèi)：鲀毒魚(yú)類(lèi)、膽毒魚(yú)類(lèi)、卵毒魚(yú)類(lèi)肉毒魚(yú)類(lèi)海洋生物（大約有4萬(wàn)種）：貝類(lèi)、藻類(lèi)等3、微生物毒素：細(xì)菌毒素，真菌毒素，霉菌毒素河豚毒素的檢驗(yàn)河豚毒素（TTX），又名河豚毒素酐-4-河豚毒素鞘，或河豚酸，是一種生物堿類(lèi)的天然毒素。河豚魚(yú)的肝、脾、胃、卵巢、卵子、睪丸、皮膚以及血液均含有毒素，其中以卵和卵巢的毒性最大，肝臟次之河豚毒素的毒力單位，一般用MU表示，即在3

54、0 min內(nèi)殺死一只20g左右的雄性DDY小鼠的毒素量。毒力在20000 MU以上為“劇毒”；200020000 MU之間為“強(qiáng)毒”；2002000MU之間為“弱毒”；100 MU以下為“無(wú)毒”。􀁺河豚毒素的LD50為8.7g/kg（小鼠，腹腔注射），對(duì)人的經(jīng)口最小致死量為40g/kg體重，大約12mg河豚魚(yú)毒素結(jié)晶可使一個(gè)成人致死。河豚毒素的檢測(cè)方法：TTX的檢測(cè)方法：小鼠單位法、熒光分光光度法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法和毛細(xì)管電泳法等。􀁺熒光分光光度法：TTX加堿水解后生成2-氨基-6-羥甲基-8-羥基喹唑啉，該物質(zhì)法熒光。在最大激發(fā)波長(zhǎng)370nm

55、，最大發(fā)射波長(zhǎng)為495nm條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。1、TTX的檢測(cè)小鼠單位法基本原理：一定體重的小鼠經(jīng)腹腔注射TTX之后，其死亡時(shí)間的倒數(shù)與注射的TTX劑量之間存在著線性關(guān)系。據(jù)此，可根據(jù)小鼠死亡的時(shí)間推斷TTX的量。所得的毒力用MU表示（1MU0.22gTTX）。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）樣品處理：（2）動(dòng)物試驗(yàn)：選擇體重15-20g健康小白鼠，每組3只以上。將樣品處理液以水稀釋成各種濃度，每只小白鼠腹腔注射0.5mL。測(cè)定小白鼠呈現(xiàn)TTX特有癥狀的時(shí)間。河豚毒素毒力單位V檢液體積，mL；S白鼠體重，g；M最小致死量的檢液稀釋倍數(shù)；m樣品質(zhì)量，g；V1動(dòng)試物給予劑量，mL。貝類(lèi)毒素的檢驗(yàn)大多數(shù)貝類(lèi)均含有一

56、定數(shù)量的有毒物質(zhì)，貝類(lèi)中毒現(xiàn)象越來(lái)越普遍。貝類(lèi)中毒主要與主要與貝類(lèi)吸食浮游藻類(lèi)有關(guān)。毒物在貝體內(nèi)蓄積和代謝，人類(lèi)食用后可造成中毒。􀂋目前研究報(bào)道較多的毒素包括腹瀉性貝毒（DSP）、麻痹性貝毒（PSP）、神經(jīng)性貝毒（NSP）、記憶缺損性貝毒（ASP）和西加魚(yú)毒素（CTX）5種。麻痹性貝類(lèi)毒素的檢驗(yàn)麻痹性貝類(lèi)毒素（PSP）是山膝溝澡屬的渦鞭藻所產(chǎn)生的一組毒素，在美國(guó)的大石房蛤中發(fā)現(xiàn)的濃度最高。最常見(jiàn)含有PSP的生物是蛤和貽貝，偶爾也涉及扇貝和牡蠣等。目前已分離出20種毒素。PSP的毒性與河豚毒素相當(dāng)，攝入這種貝毒僅1mg就可導(dǎo)致人的死亡。國(guó)際許可的安全劑量為100g貝肉中含有相當(dāng)

57、于80g的STX。PSP極易溶于水，部分溶于甲醇和酒精，不溶于大多數(shù)非極性溶劑。它是一種生物堿，容易從酸性溶液中萃取。PSP的檢測(cè)方法1、生物測(cè)定法：小鼠單位法，家蠅生物分析法，蝗蟲(chóng)生物分析法2、理化分析法：HPLC，電泳法，TLC3、免疫化學(xué)法腹瀉性貝類(lèi)毒素的檢驗(yàn)腹瀉性貝類(lèi)素（DSP）是一類(lèi)脂溶性物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)是聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物。DSP的直接生產(chǎn)者也是海藻。能產(chǎn)生DSP的藻類(lèi)也主要是甲藻和原甲藻屬的藻類(lèi)。能引起腹瀉的DSP主要是OA和DTX1-3。DSP在日本櫛孔扇貝、牡蠣、蛤仔、紫貽貝等中都有存在。DSP的檢測(cè)方法：小鼠單位法、細(xì)胞毒性試驗(yàn)法、HPLC法、HPLC-MS等。И

58、698;小鼠單位法是AOAC標(biāo)準(zhǔn)方法，也是我國(guó)出口貝類(lèi)中DSP的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。體重為1620g的小白鼠腹腔注射0.51mL貝類(lèi)提取液后，在15min時(shí)殺死小鼠所需的最低毒素量為1個(gè)MU。􀁺HPLC法用于DSP不同結(jié)構(gòu)組分的分析及鑒定。分離貝類(lèi)原料中不同結(jié)構(gòu)的DSP，轉(zhuǎn)化成熒光酯類(lèi)衍生物，通過(guò)測(cè)定分離組分的熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較定量。記憶缺失性貝類(lèi)毒素的檢驗(yàn)􀁺記憶性貝類(lèi)毒素（ASP）是一類(lèi)存在于赤潮藻中的硅藻屬中的毒素。ASP的主要成分是軟骨藻酸（DA），是一種具有生理活性的氨基酸類(lèi)物質(zhì)。ASP的中毒癥狀主要包括惡心、嘔吐、腹瀉等，同時(shí)有昏迷等類(lèi)似神經(jīng)性

59、中毒癥狀，中毒后的典型特征是永久性喪失部分記憶。􀁺ASP的檢測(cè)方法主要有：小鼠單位法、HPLC法、和CE法等。1、小鼠單位法􀁺最低檢出限為50g/g ，遠(yuǎn)高于美國(guó)FDA規(guī)定的貝類(lèi)食品中ASP的限量標(biāo)準(zhǔn)。2、HPLC法􀁺用一定溶液提取貝類(lèi)中的ASP，用C18反相HPLC分離其中的DA。根據(jù)DA的紫外吸收特性，用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DA的色譜行為進(jìn)行比較定性和定量。HPLC法的最低檢出限為0.5g/g。若將貝類(lèi)的ASP提取液預(yù)先用離子交換柱除部分雜質(zhì)后，再進(jìn)行HPLC分析，檢出限可以進(jìn)一步提高；去除雜質(zhì)后，再用熒光衍生化進(jìn)行衍生，檢測(cè)限可提高到0.006g/g。3、CE法􀁺貝類(lèi)中的ASP（主要為DA）用甲醇溶液提取，經(jīng)離子交換樹(shù)脂純化，用CE法分離其中的DA，并與標(biāo)準(zhǔn)DA的電泳行為進(jìn)行比較定量。組胺的檢驗(yàn)組胺是又名組織胺，分子式為C5H9N3，化學(xué)名為2-咪唑基乙胺。是一種生物堿，溶于水和乙醇。組胺是魚(yú)體中的游離組氨酸，在組氨酸脫羧酶