PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析報(bào)告及對(duì)策

1、PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析及對(duì)策（無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物、非特異性擴(kuò)增、拖尾、假陽(yáng)性）問(wèn)題1：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)原因：1. 模板:含有抑制物，含量低2. Buffer對(duì)樣品不合適3. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解4. 反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短對(duì)策：1. 純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA或加大模板的用量2. 更換Buffer或調(diào)整濃度3. 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物4. 降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間M 樣品樣品正對(duì)照.問(wèn)題2:非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶 原因：1. 引物特異性差2. 模板或引物濃度過(guò)高3. 酶量過(guò)多4

2、. Mg2+濃度偏高5. 退火溫度偏低6. 循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：1. 重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR2. 適當(dāng)降低模板或引物濃度3. 適當(dāng)減少酶量4. 降低鎂離子濃度5. 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法6. 減少循環(huán)次數(shù)問(wèn)題3:拖尾Smear狀態(tài)?，F(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈原因：1. 模板不純2. Buffer 不合適3. 退火溫度偏低4. 酶量過(guò)多5. dNTP、Mg 2+濃度偏高6. 循環(huán)次數(shù)過(guò)多對(duì)策：1. 純化模板2. 更換 Buffer3. 適當(dāng)提高退火溫度4. 適量用酶5. 適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度6. 減少循環(huán)次數(shù)問(wèn)題4:假陽(yáng)性現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物

3、的交*污染對(duì)策：1. 操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；2. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。3. 各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存PCR物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于 48h后帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及，PCR盾環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有 Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或

4、吸入酚。模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 弓I

5、物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2離子濃度對(duì)PCF擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCRT增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCRT增產(chǎn)量甚至使PCRT增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCF擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCF擴(kuò)增，是根據(jù)科研

6、和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在 做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCRT增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使弓I物與模板失去互補(bǔ)序列，其 PCFT增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCRT增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度

7、更高。弓I物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCRT增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 二是空氣中的小片段核酸污 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。 可互相拼接，

8、與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò) 增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式 PCR方法來(lái)減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及 PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（9

9、3 C變性，65C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。 其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低 Mg2濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)?？寺CR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1:1 （插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比 1: 8或& 1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用 5ul 2X連接液，50ng質(zhì) 粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4oC過(guò)夜。在這2種

10、溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫 1小時(shí) 能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需 4oC過(guò)夜。PCF產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見(jiàn)其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高 比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。如果沒(méi)有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？A ）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。B ）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1u

11、l用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過(guò)夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA勺總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA用SOC稀釋到1000U后含10 ng DNA,用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10 （3次方）ng /鋪板1 ng DNA ug=10 （6次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10 （8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞如沒(méi)有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。C）如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步

12、驟10 （8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去 T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801, M1804, M1794質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無(wú)核酸酶污染，不應(yīng)用其它來(lái)源的T4 DNA連接酶替換。D ）用pGEM-T或 pGEM-TEasy載體，連接pGEM-TE對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10 （ 8次方）cfu/ug ）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60% 應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍(lán)斑，沒(méi)有菌落或少有菌落，連接有問(wèn)題。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒(méi)有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問(wèn)題？A ）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需 4oC過(guò)夜。B ）插入片

13、段帶有污染，使3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-TE對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或 pGEM-T Easy載體3-T缺失。C ）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過(guò)度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過(guò)度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。D ）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無(wú)A后者是pGEM-T或 pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加 A。詳情查pGEM-T pGEM-T Eas載體技術(shù)資料（TM0

14、42。E高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞PCR疑難解答當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時(shí)，首先檢查以下幾方面并遵照?qǐng)?zhí)行：將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70C“熱啟動(dòng)開(kāi)始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。對(duì)于有問(wèn)題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常 PCRT增。沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.2

15、5mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無(wú)MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2因?yàn)樵赑CRx應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。檢查模板和引物的用量。增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA勺用量。泳道中出現(xiàn)模糊條帶：減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過(guò)68 C。重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物。其他值得注意的條件：建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92C時(shí)不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱

16、的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml （0.51ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/L MgCl2 : 350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2 : 500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+勺濃度是必需的。基因組DNA莫板的質(zhì)量顯著影響PCF反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè) DNA勺長(zhǎng)度DNAt段長(zhǎng)度可以超過(guò)50kb,傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。 要擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段應(yīng)使用超純或高分子量的 DNA請(qǐng)查閱高分子量DNA提取操作過(guò)程相關(guān)文獻(xiàn)。降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)

17、行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長(zhǎng)度一般為2434個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在6068C間。使用這類引物可提高 PCF反應(yīng)的退火溫度來(lái)增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。變性：第一步變性在94C下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過(guò)程中盡可能縮短變性時(shí)間（94C下進(jìn)行20-30秒）,除非模板中富含GC則95C下變性30秒。這可以防止 DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長(zhǎng)度超過(guò)12 kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。延伸：68-72 C下進(jìn)行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若 PCR儀無(wú)此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)

18、間用10分鐘替代原來(lái)的8分鐘。長(zhǎng)片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3-末端帶有一個(gè)突出的A,因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用 Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再 進(jìn)行。測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有3一5 外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。引物設(shè)計(jì)：一般長(zhǎng)度20-30bp;至少50%勺GC含量；避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)；引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。也可下列圖示提示找到解決問(wèn)題的突破口:PCR實(shí)驗(yàn)操作程序1.在無(wú)菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣:反應(yīng)物加樣順序體積（卩1）終濃度去離子水1 29.410X Buffer B 2 5

19、 1X4XdNTP昆合物3 5各 200 戈 mol/LMgC2 4 3 1.5mmol/L有義引物5 2.6 0.25戈 mol/L反義引物6 2.6 0.25戈 mol/L模板7 2 0.1卩gTaqDN驟合酶8 0.41unit2. 用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50卩1礦物油。每加一管換一次Tip3. 振蕩每只管，然后短暫離心。4. 將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開(kāi)始循環(huán)：預(yù)變性94 C 4分鐘1次變性94 C 1分鐘退火37-65 C 1分鐘延伸72 C 1分鐘循環(huán)30次終延伸72 C 7分鐘1次保存4 C5. 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。電泳條件：60

20、-80V,15-20分鐘。6. 紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。四、討論1. 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有Taq酶抑制劑，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，有可能是 模板核酸提取過(guò)程出了毛病，可使用陽(yáng)性對(duì)照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。引物：弓I物質(zhì)量、弓I物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常

21、見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電氷一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCF有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏，導(dǎo)致弓I物變質(zhì)降解失 效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，弓I物之間形成二聚體等。Mg+濃度：皿&+離子濃度對(duì)PCFT增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性

22、，濃度過(guò)低則影響PCRT增產(chǎn)量甚至使PCRT增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCRT增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCFT增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定， 在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCFT增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCFT增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR失敗的原因之一。靶序列變

23、異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCFT增是不會(huì)成功的。2. 假陽(yáng)性出現(xiàn)的pcfT增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。弓I物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCRT增時(shí)，擴(kuò)增出的PCF產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均

24、應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫?相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出 PCF產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式 PCF方法來(lái)減輕或消除。3. 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCF擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不 完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是 Mg+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及 PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異

25、條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93 C變性，65C左右退火與延伸）4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)岀現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低 Mg+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR常見(jiàn)問(wèn)題的精辟總結(jié)-耶魯大學(xué)Troubleshooting for PCR and

26、multiplex PCRTroubleshooti ng discussi on is based on the PCR protocol as described in the table below. All reacti ons are run for 30 cycles.COMPONENTVOLUMEFINAL CONCENTRATION.autoclaved ultra-filtered water (pH 7.0)20.7 卩 L-2.10x PCR Buffer*2.5 卩 L1x3.dNTPs mix (25 mM each nucleotide)0.2 卩 L200 卩 M

27、 (each nucleotide)4.primer mix (25 pmoles/卩 L each primer)0.4 卩 L0.4 卩 M (each primer)5.Taq DNA polymerase (n ative en zyme)0.2 卩 L1 Unit/25卩 L6.genomic DNA template (100 ng/卩 L)1.0 卩 L100 ng/25 卩 LThe 10x PCR buffer con tai ns: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl (pH 8.3); 15 mM MgCl2 (the final concentrat

28、ions of these ingredients in the PCR mixare: 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; 1.5 mM MgCl2).QUESTIONSSOLUTIONS1. I get (ma ny) Ion ger un specificproducts. What can I do?Decrease ann eali ng timeIn crease ann eali ng temperatureDecrease exte nsion timeDecrease extension temperature to 62-68 o CIn crease K

29、Cl (buffer) con ce ntrati on to 1.2x-2x, but keep MgCl2 concen trati on at 1.5-2mM.In crease MgCl2 concen trati on up to 3-4.5 mM but keep dNTP concen trati on con sta nt.Take less primerTake less DNA templateTake less Taq polymeraseIf none of the above works: check the primer for repetitivesequence

30、s(BLAST alig n the seque nce with the databases) and cha nge theprimer(s)Comb ine some/all of the above2. I get (many) shorter unspecificIn crease ann eali ng temperatureproducts. What can 1 do?In crease ann eali ng timeIn crease exte nsion timeIn crease exte nsion temperature to 74-78o CDecrease KC

31、l (buffer) con ce ntration to 0.7-0.8x, but keep MgCl2concen trati on at 1.5-2mMIn crease MgCl2 concen trati on up to 3-4.5 mM but keep dNTPconcen trati on con sta ntTake less primerTake less DNA templateTake less Taq polymeraseIf none of the above works: check the primer for repetitivesequences(BLA

32、ST alig n the seque nce with the databases) and cha nge theprimer(s)Comb ine some/all of the above3. Reacti on was work ing before,Make sure all PCR in gredie nts are take n in the reacti on (buffer,but now I cant get any product.template, Taq, etc)Change the dNTP soluti on (very sen sitive to cycle

33、s of thaw ing andfreez ing, especially in multiplex PCR)If you just bought new primers, check for their reliability (badprimer syn thesis ?)In crease primer amountIn crease template amountDecrease annealing temperature by 6-10o C and check if you get any product. If you dont, check all your PCRingre

34、dients.If you do getproducts (in clud ing un specific on es) reacti on con diti ons as described above.Comb ine some/all of the above4. My PCRproduct is weak. Is there Gradually decrease the annealing temperature to the lowest possible.a way to in crease the yield?In crease the amount of PCR primerI

35、n crease the amount of DNA templateIn crease the amount of Taq polymeraseChange buffer (KCl) concen trati on (higher ifproduct is lower tha n1000bp or lower if product is higher than 1000bp)Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8卩 g/ 卩 L finalconcentration).You can also try 5%(v/v, finalconcentrati

36、on)DMSOor glycerol.Check primer seque nces for mismatches an d/or in crease the primerlen gth by 5 nu cleotidesComb ine some/all of the above5. My two primers have veryAn easy soluti on is to in crease the len gth of the primer with lowdiffere nt melt ing temperaturesTm. If you n eed to keep the siz

37、e of the product con sta nt, add a few(Tm) but I cannot cha nge theirbases at the 3 en d. If size is not a con cer n, add a few bases atlocus. Whatca n 1 do to improvePCRither the 3 or the 5 end of that primer.amplificati on?6. I have a number of primer pairs Very likely, yes.I would like to use tog

38、ether. CanTry amplify all loci seaprately using the same PCR program. If oneI run a multiplex PCR with them?.of the primer pairs yields un specific products, keep the cycli ngHow?con diti ons con sta nt and cha nge other parameters as men ti oned above (#1 and #2).Mix equimolar amounts of primers an

39、d run the multiplex reacti on either in the same cycli ng con diti ons or by decreas ing only the ann eali ng temperature by 4o C.If some of the loci are weak or not amplified, read below !7. How many loci can 1 amplify inDifficult to say. The author has rout in ely amplified from 2 to 14multiplex P

40、CR at the same time?loci.Literature describes up to 25 loci or so.8. Oneor a few loci in mymultiplex The first choice should be increasing the amount of primer for thereacti on are very weak orweak loci at the same time with decreas ing the amount of primerin visible. How can amplify them?for all lo

41、ci that can be amplified. The balance between these amounts is more importa nt tha n the absolute values used !.Check primer seque nces for primer-primer in teracti ons9. Short PCR products in myIn crease KCl (buffer) concen tration to 1.2x-2x, but keep MgCl2multiplex reacti on are weak. Howconcen t

42、rati on at 1.5-2mMcan 1 improve their yield?Decrease den aturi ng timeDecrease ann eali ng time and temperatureDecrease exte nsion time and temperatureIn crease amount of primers for the weak loci while decreas ing the amount for the str on g loci.Add adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8卩 g/ 卩 L fin

43、alconcentration).You can also try 5%(v/v, finalconcentration)DMSOor glycerolComb ine some/all of the above10. Lon ger PCR products in my multiplex reacti on are weak. How can I improve their yield?Decrease KCl (buffer) concen tration to 0.7-0.8x, but keep MgCI2concen trati on at 1.5-2mMIn crease MgC

44、I2 concen trati on up to 3-4.5 mM but keep dNTP concen trati on con sta nt.In crease den aturi ng timeIn crease ann eali ng timeDecrease ann eali ng temperatureIn crease exte nsion time and temperatureIn crease amount of primers for the weak loci while decreas ing the amount for the str on g lociAdd

45、 adjuvants. Best, use BSA (0.1 to 0.8卩 g/ L finalconcentration).You can also try 5%(v/v, finalconcentration)DMSOor glycerolComb ine some/all of the above11. All products in my multiplex reacti on are weak. How can I improve the yield?Decrease annealing time in small steps (2o C)Decrease extension temperature to 62-68 o CIn crease exte nsion timeIn crease template concen trati onIn crease overall primer concen trat