發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)講義

發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) （適合發(fā)酵工程原理與技術(shù)） 張建國(guó) 用前 沿發(fā)酵工程（Fermentation Engineering）屬于生物技術(shù)的范疇，生物技術(shù)又稱生物工藝學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)作為一門(mén)新興的高科技術(shù)產(chǎn)業(yè)，它的生命力在于他對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和發(fā)展的各個(gè)方面都帶來(lái)了極大沖擊和影響。發(fā)酵工程是指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的技術(shù)。發(fā)酵工程由于涉及到生物催化劑，因而與化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。由于生物技術(shù)的最終目標(biāo)是建立工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程為社會(huì)服務(wù)，因而該生產(chǎn)過(guò)程可稱為生物反應(yīng)過(guò)程（亦稱為生化反應(yīng)過(guò)程）。在發(fā)酵技術(shù)中一般包括微生物細(xì)胞或動(dòng)植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，或利用固定化酶，固定化細(xì)胞所做的反應(yīng)器加工底物（即有生化催化劑參加），以及培養(yǎng)加工后產(chǎn)物大規(guī)模的分離提取等工藝。主要是在生物反應(yīng)過(guò)程中提供各種所需的最適環(huán)境條件。如酸堿度、濕度、底物濃度、通氣量以及保證無(wú)菌狀態(tài)等研究?jī)?nèi)容。 生物技術(shù)產(chǎn)品具有多樣性，各個(gè)學(xué)校的教學(xué)資源和課時(shí)不同，所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)種類不同。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容根據(jù)本校的具體條件進(jìn)行安排。安排的思路是以最簡(jiǎn)潔有效的方式針對(duì)發(fā)酵過(guò)程的重要要素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，便于學(xué)生對(duì)教學(xué)內(nèi)容有個(gè)較好的認(rèn)識(shí)，理順學(xué)習(xí)思路，為進(jìn)行社會(huì)科學(xué)實(shí)踐打下良好基礎(chǔ)。第一篇 野生型菌株的篩選 經(jīng)典的發(fā)酵產(chǎn)物來(lái)自微生物，土壤是微生物的大本營(yíng)。生產(chǎn)菌株的選育源頭都來(lái)自于自然界。如何從自然界中篩選目的微生物，可以根據(jù)目的微生物和產(chǎn)物的特性作為篩選條件，進(jìn)行篩選提高篩選效率，從而有效的解決菌株從無(wú)到有的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)一 產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選（4學(xué)時(shí)）一 實(shí) 驗(yàn) 目 的篩選一株能夠合成分解淀粉的微生物。二 原 理自然界微生物種類繁多，有些微生物能夠以淀粉作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖是因?yàn)樗鼈兡軌蚝铣煞置诘矸勖福虼宋覀兡軌驈淖匀唤缰卸ㄏ蚍蛛x出合成淀粉酶的微生物。當(dāng)能合成淀粉酶的微生物在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)將淀粉酶分泌到菌體周圍，將菌落周圍的淀粉水解成為小分量的糊精、聚糖和單糖。這些水解物不能包裹單質(zhì)碘從而在菌體周圍形成透明圈。三. 材料與儀器1. 材料蛋白胨，牛肉膏，NaCl，瓊脂條，可溶性淀粉，碘液。2. 儀器牛皮紙、培養(yǎng)皿、試管、涂布棒、恒溫培養(yǎng)箱、玻璃珠四方法與步驟1. 篩選培養(yǎng)基的配置可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，瓊脂 20g ，水 1000ml 2. 碘液的配置 稱取KI 2.0g，用50mL去純水溶解KI，迅速稱量I2 0.5g并加入KI溶液中，用純水定容到100ml，攪拌溶解后保存在棕色瓶中，橡皮塞封口。 3. 土樣的采集 每大組取三種不同環(huán)境的土樣并記錄當(dāng)時(shí)取樣環(huán)境情況（每一小組以其中一個(gè)地方進(jìn)行分離）。 以小組為單位進(jìn)行稀釋分離。取土樣1克，加入9mL 無(wú)菌水，逐步稀釋至105、106、107。（每個(gè)梯度涂2個(gè)瓶皿）。 30恒溫培養(yǎng)48小時(shí) 產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定。挑選單菌落影印到無(wú)菌瓶皿上，同時(shí)用簽字筆對(duì)各單菌落在底皿標(biāo)號(hào)。標(biāo)記接種過(guò)的培養(yǎng)皿30培養(yǎng)24h，取其中一皿噴灑稀碘液記錄有水解圈的單菌落。與此對(duì)應(yīng)找出合成淀粉酶的菌株。比透明圈透明圈直徑（mm）/ 菌落直徑（mm） 5每小組調(diào)去活性優(yōu)良的菌株接入斜面試管保存，待下一次用。五記錄與結(jié)果1.環(huán)境情況地點(diǎn)一：地點(diǎn)二：地點(diǎn)三：2. 繪制出透明圈數(shù)據(jù)共享 地點(diǎn)一 地點(diǎn)二 地點(diǎn)三產(chǎn)酶菌落數(shù)比透明圈六結(jié)果分析從不同地點(diǎn)獲得的結(jié)果進(jìn)行分析為什么會(huì)出現(xiàn)這樣的差異你可以初步得出什么樣的結(jié)論。七 作業(yè)1. 為什么要用淀粉作為碳源？2. 在觀察結(jié)果的過(guò)程中為什么要及時(shí)觀察,否則會(huì)有什么的后果.3. 為什么同樣一個(gè)同樣要稀釋幾個(gè)不同梯度進(jìn)行涂平板. 實(shí)驗(yàn)二 排斥美蘭放線菌的篩選一 實(shí) 驗(yàn) 目 的篩選能夠和美蘭發(fā)生排斥反應(yīng)的放線菌。二 原 理放線菌目前是合成一些抗生物質(zhì)的主要微生物種群。美蘭在酸性條件下帶正電荷，個(gè)別放線菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可以釋放出帶正電荷的產(chǎn)物。兩者在固體培養(yǎng)基中能夠形成特殊的排斥圈。目前研究表明這種產(chǎn)物有可能是一種生物堿性物質(zhì)，對(duì)其他菌體有良好的抑制和殺滅作用，可以作為藥物的靶向載體和食品添加劑。放線菌一般生長(zhǎng)條件在中性，而美蘭在酸性條件下帶正電荷，所以培養(yǎng)條件選擇在中性偏酸性。在篩選過(guò)程中會(huì)有大量的雜菌生長(zhǎng)從而影響篩選效果的觀察和篩選分離，為此要在培養(yǎng)基中加入一些對(duì)雜菌有抑制作用但對(duì)放線菌抑制作用較小的化學(xué)物質(zhì)高錳酸鉀。為了避免雜菌的影響要及時(shí)的觀察和分離。三. 材料與儀器1. 材料葡萄糖,酵母粉， NH4SO4， K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, ZnSO4, FeSO4,2. 儀器牛皮紙、培養(yǎng)皿、試管、涂布棒、恒溫培養(yǎng)箱、玻璃珠四方法與步驟1. 篩選培養(yǎng)基的配置1）培養(yǎng)基成分葡萄糖50 gL-1,酵母粉5 gL-1，1 NH4SO410 gL-1，0.8g K2HPO4 0.8 gL-1, KH2PO4 1.36 gL-1, MgSO4 0.05 gL-1, ZnSO4 0.05 gL-1, FeSO4 0.03 gL-1,調(diào)節(jié)pH為6.8，1105 Pa 滅菌30 min，酵母膏單獨(dú)滅菌。2）. 高錳酸鉀溶液的配置 稱取7.5 g K2Cr2O7，用100mL去純水溶解滅菌待用。 3）. 美蘭溶液配制稱取0.2g美蘭，用100mL去純水溶解滅菌待用。在培養(yǎng)基冷卻至7080左右時(shí)，分別加入高錳酸鉀溶液和美蘭溶液，使培養(yǎng)基中的含量分別為75mg/L和0.002g/L。3. 土樣的采集和樣品的處理 每大組取三種不同環(huán)境的土樣并記錄當(dāng)時(shí)取樣環(huán)境情況（每一小組以其中一個(gè)地方進(jìn)行分離）。 以小組為單位進(jìn)行稀釋分離。取土樣1克，加入9mL 無(wú)菌水，逐步稀釋至10-1、10-2、10-3。（每個(gè)梯度涂2個(gè)瓶皿）。 4. 培養(yǎng)（1） 30恒溫培養(yǎng)120小時(shí)（2） 三天后開(kāi)始間隔24小時(shí)觀察，生長(zhǎng)和形成透明圈情況五記錄與結(jié)果1.環(huán)境情況地點(diǎn)一：地點(diǎn)二：地點(diǎn)三：2. 繪制出透明圈數(shù)據(jù)共享 地點(diǎn)一 地點(diǎn)二 地點(diǎn)三放線菌生長(zhǎng)情況形成透明圈情況六結(jié)果分析從不同地點(diǎn)獲得的結(jié)果進(jìn)行分析為什么會(huì)出現(xiàn)這樣的差異你可以初步得出什么樣的結(jié)論。七 作業(yè)1. 為什么要用加入重鉻酸鉀和美蘭？2. 在觀察結(jié)果的過(guò)程中為什么要及時(shí)觀察,否則會(huì)有什么的后果.3. 為什么同樣一個(gè)同樣要稀釋幾個(gè)不同梯度進(jìn)行涂平板.附檸檬酸產(chǎn)生菌的分離u 檸檬酸又名枸櫞酸，它是存在于檸檬等水果中的一種有機(jī)酸。學(xué)名為3-羥基3-羧基戊二酸。u 檸檬酸具有令人愉快的酸味，它入口爽快，無(wú)后酸味，安全無(wú)毒，是發(fā)酵法生產(chǎn)的最重要有機(jī)酸。它在水中的溶解度極高，能被生物體直接吸收代謝。它的許多特殊優(yōu)點(diǎn)使它在各個(gè)工業(yè)部門(mén)得到了廣泛的應(yīng)用。檸檬酸的鹽類和衍生物也各具優(yōu)點(diǎn)，用途廣泛，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。u 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解黑曲霉菌在工業(yè)生產(chǎn)中的不同作用；2、復(fù)習(xí)掌握從土壤中分離工業(yè)用微生物的原理及方法；3、掌握利用變色圈法篩選產(chǎn)酸菌的方法。 實(shí)驗(yàn)原理：u 1、新菌株的分離大致可分為采樣、增殖（富集）培養(yǎng)，分離鑒定、性能測(cè)定等步驟。u 2、檸檬酸可由曲霉菌發(fā)酵糖類而生成，其中尤以黑曲霉產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。目前工業(yè)生產(chǎn)中多以黑曲霉為檸檬酸產(chǎn)生菌。u 3、黑曲霉耐酸性較強(qiáng)，在pH值1.6時(shí)仍能良好生長(zhǎng)。利用其產(chǎn)酸高、耐酸強(qiáng)的生理特征，使用pH1.6的酸性營(yíng)養(yǎng)濾紙分離該菌，簡(jiǎn)單易行，再加上用變色圈法進(jìn)行初篩，使產(chǎn)檸檬酸的菌株更易被選出。u 4、黑曲霉產(chǎn)生的檸檬酸,可利用Deniges氏液鑒別；其產(chǎn)酸量可用0.1N氫氧化鈉滴定。檸檬酸產(chǎn)生菌的分離實(shí)驗(yàn)步驟:u 1、土壤采樣u 2、準(zhǔn)備稀釋分離用的器材u 3、將平皿、吸管包好后干熱滅菌 u 4、配制察氏培養(yǎng)基u 5、做成固體斜面u 6、配成藍(lán)色的察氏-多民培養(yǎng)基 u 7、濕熱滅菌u 8、擺斜面、倒平板u 9、稀釋土樣u 10、涂布均勻u 11、倒置培養(yǎng)。變色圈反應(yīng)檸檬酸產(chǎn)生菌的初篩實(shí)驗(yàn)步驟u 1、配制初篩發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌u 2、觀察菌落u 3、挑選菌落變色圈，測(cè)量變色圈與菌落直徑之比，取比值較大者u 4、將選好的菌株編號(hào)，接入斜面。同時(shí)采用倒置接種法在培養(yǎng)皿上點(diǎn)植接種u 5、培養(yǎng)斜面和平皿u 6、搖瓶發(fā)酵u 7、檸檬酸鑒定u 8、產(chǎn)酸量的測(cè)定。思考題u 1.簡(jiǎn)述從土壤中篩選產(chǎn)目的產(chǎn)物微生物菌種的過(guò)程。u 2.土壤采樣時(shí)應(yīng)注意的哪些問(wèn)題？u 3.黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌菌株的富集應(yīng)考慮利用哪些特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行富集？ 第二篇 菌種選育微生物菌種的選育目的防止菌種退化解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題，提高生產(chǎn)能力，提高產(chǎn)品質(zhì)量，開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品。目前菌種選育的方法主要有自然選育、誘變育種、雜交育種、分子育種等手段。但是誘變育種還是育種的主流，誘變育種根據(jù)誘變劑的種類可分為化學(xué)誘變和物理誘變。本實(shí)驗(yàn)以紫外線作為物理劑進(jìn)行誘變。誘變過(guò)程一般包括誘變出發(fā)菌株的選擇、誘變劑量的選擇和誘變及其篩選。實(shí)驗(yàn)一 產(chǎn)淀粉酶菌株的誘變育種（8學(xué)時(shí)）（1） 產(chǎn)淀粉酶菌株的誘變劑量選擇（4學(xué)時(shí)）一. 目的通過(guò)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行不同劑量條件下的照射，找出最佳誘變劑量。二. 原理DNA是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)，主要組成分為脫氧核酸。DNA的在260nm下有最大能量吸收峰， 15W紫外燈在30cm處的紫外線波長(zhǎng)多數(shù)為260nm左右。當(dāng)菌體處在這樣的波長(zhǎng)條件下就會(huì)吸收大量能量造成DNA分子發(fā)生斷裂、分子結(jié)構(gòu)形式發(fā)生改變。有些微生物由于DNA分子大面積損傷而死亡有些因?yàn)榫w進(jìn)行了修復(fù)而存活。在修復(fù)過(guò)程中有些雖然存活了但DNA堿基發(fā)生了改變從而形成了突變菌株。突變菌中有些發(fā)生了產(chǎn)量正突變有些發(fā)生負(fù)突變。通過(guò)選擇的手段選擇出實(shí)驗(yàn)要求的突變菌株。從而使野生型或出發(fā)菌株的性狀得到改良。三. 材料與儀器 1. 材料（出發(fā)菌株選取一個(gè)；例如枯草芽孢桿菌）蛋白胨，牛肉膏，NaCl，瓊脂條，可溶性淀粉，碘液。2. 儀器紫外燈、磁力攪拌器、報(bào)紙、紅燈泡、燈口、電線、插座、瓶皿、無(wú)菌三角瓶（內(nèi)含玻璃珠）、含有磁針的無(wú)菌瓶皿四方法與步驟1. 培養(yǎng)基可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，瓊脂 20g ，水 1000ml2. 無(wú)菌生理鹽水3. 出發(fā)菌株的制備（無(wú)菌條件下操作）將出發(fā)菌株從試管中用25mL生理鹽水多次洗出洗出，倒入含有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，進(jìn)行反復(fù)振蕩20min。4. 誘變條件選擇（操作過(guò)程在紅光或黑暗條件下進(jìn)行）吸出5mL至含有磁針的無(wú)菌瓶皿中，置于磁力攪拌器上，緩慢加速磁力攪拌器。然后打開(kāi)瓶皿蓋，再打開(kāi)紫外燈迅速記時(shí)。時(shí)間到立刻關(guān)閉紫外燈。（5S、10S、15S、20 S、25 S、30 S、35 S、40 S）。5. 涂瓶皿 對(duì)照：將未進(jìn)行輻射的菌懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù)105，106，107，涂瓶皿。 處理組：將進(jìn)行輻射的菌懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù)103，104，105，涂瓶皿。6. 30恒溫培養(yǎng)48小時(shí)（培養(yǎng)物用黑布袋或報(bào)紙包裹嚴(yán)實(shí)進(jìn)行培養(yǎng)）。7.計(jì)數(shù)并計(jì)算致死率五 結(jié)果致死率（對(duì)照粗活）/對(duì)照對(duì)照稀釋倍數(shù)菌落數(shù)輻照稀釋倍數(shù)菌落數(shù)致死率=lg（輻照的菌落數(shù)）/lg（照射的菌落數(shù)）2.繪制時(shí)間和致死率之間的關(guān)系，確定該誘變的最適誘變條件。誘變劑量選擇根據(jù)出發(fā)菌株的誘變史。一般來(lái)講出發(fā)菌株為野生型第一進(jìn)行誘變時(shí)都采用大劑量（致死率較高的計(jì)量），對(duì)于誘變史較為復(fù)雜的一般選用小劑量進(jìn)行。六 討論 七 作業(yè)1.外誘變的機(jī)理是什么？2.為什么要在黑暗或在紅色光下進(jìn)行誘變和培養(yǎng)工作？ （2）紫外線的誘變（4學(xué)時(shí)）一. 目的在最佳誘變劑量下選育發(fā)生淀粉酶產(chǎn)量發(fā)生正突變的菌株。二. 原理 發(fā)生正突變的概率約為10-8左右，需要在大量的照射菌落中尋找發(fā)生正突變的菌株。如果從大量的待選輻照菌中進(jìn)行定量或半定量篩選分析，工作量巨大，不切合實(shí)際。一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)依據(jù)微生物的形態(tài)和高產(chǎn)菌的關(guān)系或根據(jù)比透明圈與對(duì)照的比透明大小進(jìn)行篩選。形成透明圈的大小不僅與遺傳有關(guān)還與培養(yǎng)條件有關(guān)。為了消除培養(yǎng)環(huán)境的誤差，在此規(guī)定當(dāng)比透明大于對(duì)照比透明25%為正突變，小于25%為負(fù)突變，在此25%之間認(rèn)為是沒(méi)有發(fā)生突變。三. 材料與儀器 1. 材料（出發(fā)菌株選取一個(gè)；例如枯草芽孢桿菌）蛋白胨，牛肉膏，NaCl，瓊脂條，可溶性淀粉，碘液。2. 儀器紫外燈、磁力攪拌器、報(bào)紙、紅燈泡、燈口、電線、插座、瓶皿、無(wú)菌三角瓶（內(nèi)含玻璃珠）、含有磁針的無(wú)菌瓶皿四方法與步驟1. 培養(yǎng)基可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，瓊脂 20g ，水 1000ml2. 無(wú)菌生理鹽水3. 出發(fā)菌株的制備（無(wú)菌條件下操作）將出發(fā)菌株從試管中用25mL生理鹽水多次洗出洗出，倒入含有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，進(jìn)行反復(fù)振蕩20min。4. 紫外線誘變及初篩選擇合適輻照劑量對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，接入搖瓶培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)后稀釋涂布平板，用報(bào)紙包裹在黑暗條件下培養(yǎng)48h，然后噴灑稀碘液記錄比透明圈。比透明圈透明圈直徑（mm）/ 菌落直徑（mm）五.記錄匯總與分析1.列出各組結(jié)果2.各做進(jìn)行對(duì)比分析在不同劑量條件的正突變發(fā)生率和發(fā)生正突變幅度和計(jì)量的關(guān)系以及發(fā)生最大突變的幅度在什么劑量條件下。六 討論七作業(yè) 1. 統(tǒng)計(jì)不同劑量條件的正突變發(fā)生率和發(fā)生正突變幅度和計(jì)量的關(guān)系以及發(fā)生最大突變的幅度在什么劑量條件下的意義是什么？2. 為什么最后把最佳誘變劑量用致死率和正突變率進(jìn)行表示，而不用誘變時(shí)間進(jìn)行描述？（3） 高產(chǎn)淀粉酶菌株復(fù)篩（4學(xué)時(shí)）一 目的進(jìn)一步對(duì)高產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行篩選定量確定為高產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)菌。二 原理 瓊脂平板活性測(cè)定方法，可以簡(jiǎn)便、快速得進(jìn)行初篩節(jié)約大量得時(shí)間，但是難以得到確切的產(chǎn)量水平，只適合于初篩。初篩具有不穩(wěn)定性，要進(jìn)一步確定生產(chǎn)優(yōu)良性狀的菌株就有必要對(duì)其進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，定量的確定其生產(chǎn)水平，更為準(zhǔn)確的確定優(yōu)良性狀的菌株。三. 材料與儀器 1. 材料（出發(fā)菌株選取10個(gè)）蛋白胨，牛肉膏，NaCl，可溶性淀粉，葡萄糖（分析純）、蒸餾水DNS液2. 儀器 三角瓶、容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、試管架、吸耳球、稱量紙、分光光度計(jì)、燒杯、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、記號(hào)筆、電爐、搪瓷缸四方法與步驟1. 搖瓶培養(yǎng)基的配置可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，瓊脂 20g ，水 1000ml 2. 接種 取斜面，倒入無(wú)菌培養(yǎng)基，用無(wú)菌接種針打散斜面上的菌苔，再倒回裝有無(wú)菌培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后以10接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)24小時(shí)。3.離心 將發(fā)酵液離心，取上清。 4. 淀粉酶活力的測(cè)定 比色法測(cè)定-淀粉酶的活力五 結(jié)果共享數(shù)據(jù)菌株編 號(hào)酶 活確定最優(yōu)生長(zhǎng)性狀的淀粉酶菌株六 討論七 作業(yè)為什么要進(jìn)行復(fù)篩？ （4）高產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性 (4學(xué)時(shí)) 一 目的 通過(guò)復(fù)篩獲得的高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究二 原理 由于高產(chǎn)酶誘變菌株在培養(yǎng)繁殖過(guò)程中容易發(fā)生回復(fù)突變或由于純化不夠徹底造成菌株的退化等現(xiàn)象。尤其是紫外誘發(fā)的多是堿基轉(zhuǎn)換，在培養(yǎng)過(guò)程更容易發(fā)生再次轉(zhuǎn)換從而造成回復(fù)突變。通過(guò)多次傳代培養(yǎng)觀察其產(chǎn)量變化情況，或通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)觀察其產(chǎn)量變化情況。三. 材料與儀器 1. 材料（出發(fā)菌株選取10個(gè)）蛋白胨，牛肉膏，NaCl，可溶性淀粉，葡萄糖（分析純）、蒸餾水2. 儀器 三角瓶、容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、試管架、吸耳球、稱量紙、分光光度計(jì)、燒杯、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、記號(hào)筆、電爐、搪瓷缸四方法與步驟1. 搖瓶培養(yǎng)基的配置可溶性淀粉 2g ，NaCl 5g，牛肉膏 5g ，蛋白胨 10g，水 1000ml 2. 接種及連續(xù)傳代培養(yǎng) 取斜面，倒入無(wú)菌培養(yǎng)基，用無(wú)菌接種針打散斜面上的菌苔，再倒回裝有無(wú)菌培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)8小時(shí)。8小時(shí)后以10接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)8小時(shí)，依次類推至10代。 3.離心 將發(fā)酵液離心，取上清。 4. 淀粉酶活力的測(cè)定 比色法測(cè)定-淀粉酶的活力 五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果代數(shù)12345678910活力六 討論七作業(yè) 1.傳代培養(yǎng)的意義？ 2.傳代培養(yǎng)的方法還有哪些？（5） 淀粉酶活力測(cè)定（2學(xué)時(shí)）(1) DNS法目的和要求掌握DNS法測(cè)定還原糖和多糖的方法，并利用此法測(cè)定該工藝中淀粉酶的糖化力，以及酒精發(fā)酵過(guò)程中還原糖的測(cè)定達(dá)到對(duì)發(fā)酵過(guò)程的控制。一. 原理3，5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。因此，可利用分光光度計(jì)進(jìn)行比色測(cè)定，求得樣品的含糖量。該方法主要用于糖化酶的淀粉酶活力測(cè)定。二. 材料與試劑a) 材料：葡萄糖（分析純）、蒸餾水b) 試劑：DNS液c) 器材：容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、試管架、吸耳球、稱量紙、分光光度計(jì)、燒杯、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、記號(hào)筆、電爐、搪瓷缸三. 操作方法a) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)012345葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)00.20.40.40.81.0蒸餾水(mL)21.81.61.41.21.0DNS試劑(mL) 1.5沸水浴(min) 5冷卻 流水冷卻蒸餾水(mL) 21.5A540四. 結(jié)果1. 以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量為縱坐標(biāo)作圖。并借助計(jì)算機(jī)計(jì)算出相關(guān)系數(shù)和曲線方程。 (2) 比色法測(cè)定-淀粉酶的活力一、原理:酶促反應(yīng)速度大小可以作為酶活性的大小,也可以作為酶量多少的衡量標(biāo)準(zhǔn),故可以從單位時(shí)間內(nèi)一定條件酶促反應(yīng)中底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來(lái)測(cè)定.本實(shí)驗(yàn)采用的快速比色法即利用一定量的淀粉被淀粉酶水解后,不能與碘顯藍(lán)色所需要的時(shí)間來(lái)確定其活性.該方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)。該方法主要用于液化淀粉酶活力的測(cè)定。試劑：二、試劑配置A pH6.0,0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（a）液0.02mol/L的Na2HPO42H2O(相對(duì)分子質(zhì)量178.05)溶液配置：精確稱取3.56克磷酸氫二鈉,用去離子水定容至1000mL.（b）液0.02mol/L的NaH2PO4H2O(相對(duì)分子質(zhì)量138.01)溶液配置：精確稱取2.76克磷酸氫二鈉,用去離子水定容至1000mL.取上述（a）液12.3mL, （b）液87.7mL混合再利用（a）液和（b）液使用酸度計(jì)調(diào)節(jié)混合液至pH6.0.B. 原碘液:稱取結(jié)晶碘2.2g,碘化鉀4.4g,先用少量去離子水使碘溶解后(注意不可加熱,否則碘揮發(fā)),再用去離子水定容至100mL,貯存于棕色瓶,避光保存.C. 稀碘液: 取上述原碘液2mL,加20g碘化鉀,用去離子水定容至500mL, 貯存于棕色瓶,避光保存.D. 標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色溶液:（a）液:精確稱取氯化鈷(CoCl26H2O)40.243g和重鉻酸鉀0.488g,用去離子水定容至500mL.（b）液:精確稱取鉻黑-T(C20H12N3NaO7S)40mg,用去離子水溶解并定容至100mL,棕色瓶保存.使用時(shí)（a）液40mL（b）液5ml混合,裝棕色瓶中于冰箱保存,現(xiàn)用現(xiàn)配,使用15d后需要重新配置.E. 2%可溶性淀粉溶液:稱取2g可溶性淀粉,緩緩倒入煮沸的去離子水中,加熱煮沸至溶液透明為止,冷卻后定容至100mL.三 測(cè)定方法A. 在6孔(12孔)比色板中,一孔約加0.5mL標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色溶液,作為比較顏色的標(biāo)準(zhǔn);其余孔內(nèi)用滴管加入約0.5mL稀碘液,備用.B. 在25mL比色管中分別加入2%淀粉溶液20mL和pH6.0磷酸鹽緩沖液5ml,置60恒溫水浴鍋中預(yù)熱45min.C.用移液管吸取1mL待測(cè)酶液,加入上述預(yù)熱的裝有pH6.0的磷酸緩沖液和淀粉溶液的比色管中,充分混勻,同時(shí)立即利用秒表開(kāi)始記時(shí).定時(shí)用滴管吸取反應(yīng)液約0.5ml,迅速滴入預(yù)先含有比色稀釋碘液的比色板孔內(nèi),當(dāng)不斷取樣,至孔內(nèi)顏色反應(yīng)逐漸由紫色變?yōu)榧t棕色,與標(biāo)準(zhǔn)終點(diǎn)色相同時(shí),即為反應(yīng)終點(diǎn),秒表停止記時(shí),記錄反應(yīng)時(shí)間t(min).四 酶活計(jì)算酶活單位的定義:在60，pH6.0的條件下,每毫升酶液每分鐘水解可溶性淀粉的微摩爾數(shù),即為一個(gè)酶活力單位,以mol/(minml)表示或(u/mL表示).計(jì)算公式: 酶活力=式中:n-酶液稀釋倍數(shù)t-反應(yīng)時(shí)間,mimV酶液加量,ml20可溶性淀粉溶液的體積,mL2%-可溶性淀粉溶液的濃度106-將g換算為g. 第三篇 培養(yǎng)條件優(yōu)化 1試驗(yàn)設(shè)計(jì)在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)是十分重要的，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的成分對(duì)產(chǎn)物濃度、菌體生長(zhǎng)都有重要的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法發(fā)展至今可供人們根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來(lái)選擇的余地也很大。1.1單因素法（One at a time）單因素方法的基本原理是保持培養(yǎng)基中其他所有組分的濃度不變，每次只研究一個(gè)組分的不同水平對(duì)發(fā)酵性能的影響。這種策略的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、容易，結(jié)果很明了，培養(yǎng)基組分的個(gè)體效應(yīng)從圖表上很明顯地看出來(lái)，而不需要統(tǒng)計(jì)分析。這種策略的主要缺點(diǎn)是：忽略了組分間的交互作用，可能會(huì)完全丟失最適宜的條件；不能考察因素的主次關(guān)系；當(dāng)考察的實(shí)驗(yàn)因素較多時(shí)，需要大量的實(shí)驗(yàn)和較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期。但由于它的容易和方便，單因素方法一直以來(lái)都是培養(yǎng)基組分優(yōu)化的最流行的選擇之一。1.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Orthogonal design）正交設(shè)計(jì)就是從“均勻分散、整齊可比”的角度出發(fā)，是以拉丁方理論和群論為基礎(chǔ)，用正交表來(lái)安排少量的試驗(yàn)，從多個(gè)因素中分析出哪些是主要的，哪些是次要的，以及它們對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響規(guī)律，從而找出較優(yōu)的工藝條件。石炳興等利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了新型抗生素AGPM 的發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果在優(yōu)化后的培養(yǎng)基上單位發(fā)酵液的活性比初始培養(yǎng)基提高了18.9倍。正交實(shí)驗(yàn)不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式即回歸方程，從而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。而且對(duì)于多因素多水平試驗(yàn)，仍需要做大量的試驗(yàn)，實(shí)施起來(lái)比較困難。1.3均勻設(shè)計(jì) (Uniform design)均勻設(shè)計(jì)是我國(guó)數(shù)學(xué)家方開(kāi)泰等獨(dú)創(chuàng)的將數(shù)論與多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合而建立起來(lái)的一種試驗(yàn)方法。這一成果已在我國(guó)許多行業(yè)中取得了重大成果。均勻設(shè)計(jì)最適合于多因素多水平試驗(yàn)，可使試驗(yàn)處理數(shù)目減小到最小程度，僅等于因素水平個(gè)數(shù)。雖然均勻設(shè)計(jì)節(jié)省了大量的試驗(yàn)處理，但仍能反映事物變化的主要規(guī)律。1.4全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Full factorial design)在全因子設(shè)計(jì)中各因素的不同水平間的各種組合都將被實(shí)驗(yàn)。全因子的全面性導(dǎo)致需要大量的試驗(yàn)次數(shù)。一般利用全因子設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)都為兩水平，是能反映因素間交互作用（排斥或協(xié)同效應(yīng)）的最小設(shè)計(jì)。全因子試驗(yàn)次數(shù)的簡(jiǎn)單算法為（以兩因素為例）：兩因素設(shè)計(jì)表示為 a b，第一個(gè)因素研究為a個(gè)水平，第二個(gè)因素為b個(gè)水平。Thiel等試驗(yàn)了兩個(gè)因素：7個(gè)菌株在8種培養(yǎng)基上，利用7 8（56個(gè)不同重復(fù)）。Prapulla等試驗(yàn)了三個(gè)因素：碳源（糖蜜4%，6%，8%，10%，12%），氮源（NH4NO3 0g/L、0.13g/L、0.26g/L、0.39g/L、0.52g/L、）和接種量（10%、20%），利用5 5 2設(shè)計(jì)（50個(gè)不同重復(fù)）。1.5部分因子設(shè)計(jì)(fractional factorial design)當(dāng)全因子設(shè)計(jì)所需試驗(yàn)次數(shù)實(shí)際不可行時(shí)部分重復(fù)因子設(shè)計(jì)是一個(gè)很好的選擇。在培養(yǎng)基優(yōu)化中經(jīng)常利用二水平部分因子設(shè)計(jì)，但也有特殊情況，如Silveira 等試驗(yàn)了11種培養(yǎng)基成分，每成分三水平，僅做了27組實(shí)驗(yàn)，只是311全因子設(shè)計(jì)組當(dāng)中的很小一部分。兩水平部分因子設(shè)計(jì)表示為：2nk，n是因子數(shù)目，1/2k 是實(shí)施全因子設(shè)計(jì)的分?jǐn)?shù)。這些符號(hào)告訴你需要多少次試驗(yàn)。雖然通常部分因子設(shè)計(jì)沒(méi)有提供因素的交互作用，但它的效果比單因素試驗(yàn)更好。1.6 Plackett-Burman設(shè)計(jì)（Plackett-Burman design）由Plackett 和Burman 提出，這類設(shè)計(jì)是兩水平部分因子試驗(yàn)，適用于從眾多的考察因素中快速、有效的篩選出最為重要的幾個(gè)因素，供進(jìn)一步詳細(xì)研究用。理論上講PB試驗(yàn)應(yīng)該應(yīng)用在因子存在累加效應(yīng)，沒(méi)有交互作用因子的效應(yīng)可以被其他因子所提高或削弱的試驗(yàn)上。實(shí)際上，倘若因子水平選擇恰當(dāng)，設(shè)計(jì)可以得到有用的結(jié)果。Castro等利用PB試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中的20種組分僅進(jìn)行了24次試驗(yàn)，使-干擾素的產(chǎn)量提高了近45%。1.7中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design）中心組合設(shè)計(jì)有Box和Wilson提出，是響應(yīng)曲面中最常用的二階設(shè)計(jì)，它由三部分組成：立方體點(diǎn)、中心點(diǎn)和星點(diǎn)。它可以被看成是五水平部分因子試驗(yàn)，中心組合設(shè)計(jì)的試驗(yàn)次數(shù)隨著因子數(shù)的增加而呈指數(shù)增加。1.8 BoxBehnken設(shè)計(jì)(BoxBehnken design)由Box和Behnken提出。當(dāng)因素較多時(shí)，作為三水平部分因子設(shè)計(jì)的BoxBehnken設(shè)計(jì)是相對(duì)于中心組合設(shè)計(jì)的較優(yōu)選擇。和中心組合設(shè)計(jì)一樣，BoxBehnken設(shè)計(jì)也是二水平因子設(shè)計(jì)產(chǎn)生的。2最優(yōu)化how(event) class=t_tag技術(shù)（實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)）目前，對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)的方法很多，下面介紹幾種目前應(yīng)用較多的優(yōu)化方法 2.1響應(yīng)曲面分析法Box和Wilson提出了利用因子設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化微生物產(chǎn)物生產(chǎn)過(guò)程的全面方法，Box-Wilson方法即現(xiàn)在的響應(yīng)曲面法（(Response Surface Methodolog，簡(jiǎn)稱RSM）。RSM是一種有效的統(tǒng)計(jì)技術(shù)，它是利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型來(lái)解決受多種因素影響的最優(yōu)組合問(wèn)題。通過(guò)對(duì)RSM的研究表明，研究工作者和產(chǎn)品生產(chǎn)者可以在更廣泛的范圍內(nèi)考慮因素的組合，以及對(duì)響應(yīng)值的預(yù)測(cè)，而均比一次次的單因素分析方法更有效。現(xiàn)在利用SAS軟件可以很輕松地進(jìn)行響應(yīng)面分析。2.2 改進(jìn)單純形優(yōu)化法(Modified simplex method)單純形優(yōu)化法是近年來(lái)應(yīng)用較多的一種多因素優(yōu)化方法。它是一種動(dòng)態(tài)調(diào)優(yōu)的方法，不受因素?cái)?shù)的限制。由于單純形法必須要先確定考察的因素，而且要等一個(gè)配方實(shí)驗(yàn)完后才能根據(jù)計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)，因此主要適用于實(shí)驗(yàn)周期較短的細(xì)菌或重組工程發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，以及不能大量實(shí)施的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的優(yōu)化。2.3 遺傳算法(Genetic algorithm，GA)該法是一種基于自然群體遺傳演化機(jī)制的高效探索算法，它是美國(guó)學(xué)者Holland于1975年首先提出來(lái)的。它摒棄了傳統(tǒng)的搜索方式，模擬自然界生物進(jìn)化過(guò)程，采用人工進(jìn)化的方式對(duì)目標(biāo)空間進(jìn)行隨機(jī)化搜索。它將問(wèn)題域中的可能解看作是群體的一個(gè)個(gè)體或染色體，并將每一個(gè)體編碼成符號(hào)串形式，模擬達(dá)爾文的遺傳選擇和自然淘汰的生物進(jìn)化過(guò)程，對(duì)群體反復(fù)進(jìn)行基于遺傳學(xué)的操作(遺傳，交叉和變異)，根據(jù)預(yù)定的目標(biāo)適應(yīng)度函數(shù)對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行評(píng)價(jià)，依據(jù)適者生存，優(yōu)勝劣汰的進(jìn)化規(guī)則，不斷得到更優(yōu)的群體，同時(shí)以全局并行搜索方式來(lái)搜索優(yōu)化群體中的最優(yōu)個(gè)體，求得滿足要求的最優(yōu)解。（1）正交設(shè)計(jì)法（4學(xué)時(shí)）目的要求掌握發(fā)酵工藝條件或參數(shù)的多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作方法。實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵過(guò)程涉及到數(shù)個(gè)工藝參數(shù)，每個(gè)參數(shù)有多個(gè)水平，每個(gè)因素之間還存在交互作用。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行多因素、多水平的試驗(yàn)，可以大大減少實(shí)驗(yàn)，并確定各因素之間的交互作用。實(shí)驗(yàn)次數(shù)可以減少為：水平數(shù)的平方次。在多因素試驗(yàn)中，隨著實(shí)驗(yàn)因素的增多，處理數(shù)據(jù)呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。例如，2個(gè)因素各取3個(gè)水平的試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱32試驗(yàn)），有32=9個(gè)處理，3因素各取3個(gè)水平的試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱33驗(yàn)），有33=27個(gè)處理，4因素各取3個(gè)水平的試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱34驗(yàn)），有34=81個(gè)處理處理數(shù)太多，試驗(yàn)規(guī)模變大，會(huì)給試驗(yàn)帶來(lái)許多困難。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以大大減少試驗(yàn)次數(shù)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用一套規(guī)格化的表格正交表來(lái)安排試驗(yàn)，適用于多因素、多水平、試驗(yàn)誤差大、周期長(zhǎng)等的試驗(yàn)，是效率較高的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。教學(xué)內(nèi)容分組進(jìn)行多個(gè)因素多個(gè)水平的多因素試驗(yàn)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件，本實(shí)驗(yàn)為4因素3水平實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)次數(shù)為9次，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表。另外附加一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)CK，共10個(gè)實(shí)驗(yàn)處理。表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表序號(hào)試驗(yàn)因素/劑量水平1水平2水平31接種量/%15102裝瓶體積/mL/瓶25501503pH678表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)與結(jié)果記載表實(shí)驗(yàn)序號(hào)接種量/%pH裝瓶體積/mL培養(yǎng)液OD值原始記載平均值11=1%1=61=25121=1%2=72=50231=1%3=83=150342=5%1=62=50352=5%2=73=150162=5%3=81=25273=10%1=63=150283=10%2=71=25393=10%3=82=501實(shí)驗(yàn)器材1.活材料：復(fù)篩菌株斜面或培養(yǎng)液。2.器材：高壓鍋、恒溫?fù)u床、振蕩培養(yǎng)箱、酸度計(jì)、分光光度計(jì)、吸水紙、計(jì)數(shù)器、滴管、擦鏡紙。實(shí)驗(yàn)方法 1.培養(yǎng)基配方：1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：，蛋白胨5g，酵母粉/膏2g，水，pH自然。2.配制培養(yǎng)基：每組組號(hào)做序號(hào)相對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，計(jì)算培養(yǎng)液體積：每個(gè)處理重復(fù)3次，每瓶裝液體培養(yǎng)基100mL，計(jì)算培養(yǎng)液體積。稱樣后加入容器中，加少量水，攪拌并適當(dāng)加熱加水溶解。用量筒分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶裝試驗(yàn)處理相應(yīng)體積的培養(yǎng)液。用8層紗布、或棉塞、。標(biāo)簽。3.滅菌：0.1MPa，20min。冷卻后出鍋，取出，放入超凈工作臺(tái)中風(fēng)冷，用紫外線照射20min。4.接種：用無(wú)菌的5mL或10mL無(wú)菌移液管，每瓶按照接種劑量等量接入菌種。封口。標(biāo)簽。5.培養(yǎng)：接種后的培養(yǎng)瓶放在振蕩培養(yǎng)箱或恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，相同溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。6.測(cè)定：16 小時(shí)測(cè)定培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液的OD值。每次重復(fù)測(cè)定3次以上。計(jì)算平均值。報(bào)告1.進(jìn)行直觀分析得出最佳條件2.進(jìn)行方差分析得出最佳條件。 （2）一次回歸正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的要求掌握發(fā)酵工藝條件或參數(shù)的多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作方法。實(shí)驗(yàn)原理一次回歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法選用二水平正交表安排，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立線性回歸方程。安排試驗(yàn)時(shí)把正交表中的1和2分別改為+1和-1，以使正交表中的任意兩列對(duì)應(yīng)元素之積的和等于零，使系數(shù)矩陣和相關(guān)矩陣為對(duì)角矩陣，從而使所求得的回歸系數(shù)互不相關(guān)，這樣可使回歸分析計(jì)算和顯著性檢驗(yàn)過(guò)程大大簡(jiǎn)化。具體設(shè)計(jì)分析步驟如下： 1確定因素的變化范圍 如果要研究P個(gè)因素Z1,Z2,，Zp與某項(xiàng)指標(biāo)y的數(shù)量關(guān)系，首先要確定每個(gè)因素的變化范圍。設(shè)Z1j,Z2j分別表示因素Zj變化的下限和上限(j=1,2,p)，如果試驗(yàn)就在水平Z1j和Z2j上進(jìn)行，那么Z1j和Z2j又分別稱為因素Zj的下水平和上水平，并稱它們的算術(shù)平均值 為因素Zj的零水平，稱它們差的一半 為因素的變化區(qū)間。2 對(duì)每個(gè)因素Zj的水平進(jìn)行編碼編碼的目的是建立因素Zj與Xj取值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，為此需做如下的線性變換 (3-3-3)顯然，當(dāng)Zj =Z1j 時(shí)， x1j=Zj =Z2j 時(shí)， x2j=Zj =（Z1j+Z2j ）/2=Z0j時(shí)， x0j=0變換后，若Zj在區(qū)間Z1j，Z2j內(nèi)變化時(shí)，它的編碼值Xj就在區(qū)間-1，+1內(nèi)變化。在對(duì)因素Zj的水平進(jìn)行編碼以后，y對(duì)Z1,Z2,，Zp的回歸問(wèn)題就轉(zhuǎn)化為y對(duì)x1，x2，xp的回歸問(wèn)題。3 選擇正交表一次回歸正交設(shè)計(jì)選用二水平正交表，所選用的正交表應(yīng)能容納下所研究因素的個(gè)數(shù)。正交表確定后，用1代換正交表中的2使正交表中的數(shù)字分別為1和 +1，這既表示因素水平的不同狀態(tài)，也表示因素水平變化數(shù)量的大小，為計(jì)算回歸方程中的常數(shù)項(xiàng)，還需在正交表第一列前增加一列x0，該列數(shù)字全為+1。以L4（23）表為例，經(jīng)上述變換后，其形式如表正交表變換后，原來(lái)各列的交互作用列可由新表的相應(yīng)兩列的對(duì)應(yīng)元素相乘得到。如表中x1，x2，x3列的任意兩列對(duì)應(yīng)元素的乘積均為剩余列的對(duì)應(yīng)元素，因此剩余列就是那兩列的交互作用列。4 安排試驗(yàn)把要研究的因素安排在變換后正交表的適當(dāng)列上，并把每一因素的上水平和下水平與正交表中的1和1相對(duì)應(yīng)。便可按正交表進(jìn)行試驗(yàn)。5 回歸系數(shù)的計(jì)算設(shè)根據(jù)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行了N次試驗(yàn)，其試驗(yàn)結(jié)果為y1，y2，yN。則一次回歸的數(shù)學(xué)模型為： 回歸系數(shù)的具體計(jì)算過(guò)程可歸納成表1。實(shí)際運(yùn)算時(shí)可按該表進(jìn)行。表1 一次回歸正交設(shè)計(jì)計(jì)算表 6 方差分析及顯著性檢驗(yàn)一次回歸正交設(shè)計(jì)的方差分析及顯著性檢驗(yàn)可按表1進(jìn)行。這里需要指出的是，偏回歸平方和 ，即偏回歸平方和Qj與相應(yīng)的回歸系數(shù)bj的平方成正比。這表明，回歸正交設(shè)計(jì)所求得的回歸方程中，回歸系數(shù)bj的絕對(duì)值的大小反映了對(duì)應(yīng)的變量xj的作用程度。bj的絕對(duì)值越大，xj對(duì)y的影響越大。因此，當(dāng)對(duì)回歸分析的精度要求不高時(shí)，也可省略方差分析，而且直接把回歸系數(shù)接近于零的因素從回歸方程中剔除。其余實(shí)驗(yàn)方法同正交試驗(yàn)方法。例如 一次回歸正交設(shè)計(jì)實(shí)施方案試驗(yàn)號(hào)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)施方案X1X2X3氮源無(wú)機(jī)鹽碳源111170.02515211-170.0252131-1170.051541-1-170.05215-111140.025156-11-1140.025217-1-11140.05158-1-1-1140.05219000100.03751810000100.03751811000100.03751812000100.037518計(jì)算回歸系數(shù)試驗(yàn)號(hào)試驗(yàn)設(shè)計(jì)Y(產(chǎn)量）x0X1X2X3x1x2x1x3x2x31111111194.42111-11-1-195.7311-11-11-188.6411-1-1-1-1189.751-111-1-1172.161-11-1-11-190.871-1-111-1-173.881-1-1-111175.9910000008310100000085.911100000090.512100000089.2Bi=xy1029.655.825-23.2-1.418.4-16.8di=x212888888bi=Bi/di85.86.9753.125-2.9-0.1752.3-2.1Qi=biBi389.20578.12567.280.24542.3235.28y = 85.8+6.975x1+3.125x2-2.9x3-0.175x1x2+2.3x1x3-2.1x2x3 顯著性檢驗(yàn)SSy=y2-(y)2/n=691.22dfy=12-1=11SSR=Q1+Q2+Q3+Q12+Q13+Q23dfR=6SSr= SSy- SSR=78.77dfy= dfy- dfR=5 12 12SSe= ya2-(ya) 2/4=34.12a=9 a=9dfe= 4-1=3SSLf= SSr- SSe=44.56dfLf= dfr- dfe=2(1)失擬性檢驗(yàn)FLf=MSLf/Mse=(44.56/2)/(34.21/3)=1.954nsF0.05(2,3)=9.55(若顯著，可考慮二次回歸設(shè)計(jì))（2）回歸方程顯著性檢驗(yàn)FR=MSLf/MSr=(612.45/6)/(78.77/5)=6.479*(F0.05(6,5)=4.95, F0.01(6,5)=10.7)(3)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)還原第四篇 發(fā)酵過(guò)程實(shí)驗(yàn)一 淀粉酶發(fā)酵過(guò)程（4學(xué)時(shí)）目的要求了解淀粉酶生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)規(guī)律和產(chǎn)淀粉酶的代謝規(guī)律。實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶作為產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物，與菌體的生長(zhǎng)有關(guān)聯(lián)作用。 教學(xué)內(nèi)容配置培養(yǎng)基，滅菌、接種、培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定OD值，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算發(fā)酵參數(shù)。實(shí)驗(yàn)器材1.活材料：高產(chǎn)淀粉酶菌株 斜面或培養(yǎng)液。2.器材：高壓鍋、恒溫?fù)u床、振蕩培養(yǎng)箱、顯微鏡、分光光度計(jì)、吸水紙、計(jì)數(shù)器、滴管、擦鏡紙。實(shí)驗(yàn)方法 1.培養(yǎng)基配方：最優(yōu)培養(yǎng)條件。2.配制培養(yǎng)基：每組配制1000mL培養(yǎng)液。每組以4 人計(jì)，每人作2-3瓶，共10瓶，每瓶裝液體培養(yǎng)基100mL，計(jì)1000mL。稱樣后加入容器中，加少量水，攪拌并適當(dāng)加熱加水溶解。用量筒分裝在培養(yǎng)瓶中，每瓶裝95 mL培養(yǎng)液。用8層紗布、或棉塞、或聚丙烯薄膜封口。標(biāo)簽。3.滅菌：0.1MPa，20min。冷卻后出鍋，取出，放入超凈工作臺(tái)中風(fēng)冷，用紫外線照射20min。4.接種：用無(wú)菌的5mL或10mL小量筒或移液管接種，每瓶等量接入5mL菌種。封口。標(biāo)簽。5.培養(yǎng)：接種后的培養(yǎng)瓶放在振蕩培養(yǎng)箱或恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，溫度為30C，150轉(zhuǎn)/min。6.測(cè)定：定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液的OD值。每次重復(fù)測(cè)定3次以上。計(jì)算平均值。7.繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算生長(zhǎng)曲線方程。表3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定時(shí)間/h菌懸液OD值平均OD值淀粉酶活力備注0246810121416182022243648607296120148報(bào)告1.繪淀粉酶活力曲線2.繪制的生長(zhǎng)曲線 3.比較淀粉酶活力和生長(zhǎng)曲線說(shuō)明二者之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)二 生物發(fā)酵罐的操作實(shí)驗(yàn)（2學(xué)時(shí)）生物發(fā)酵罐的操作實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊罅私馍锇l(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)和操作方法實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵罐是最常見(jiàn)和常用的生物反應(yīng)器，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)生物發(fā)酵各種工藝參數(shù)的在位測(cè)定和自動(dòng)控制。教學(xué)內(nèi)容發(fā)酵罐基本結(jié)構(gòu)與操作方法。發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)：生物發(fā)酵罐系統(tǒng)=罐體系統(tǒng)+控制機(jī)箱+空氣壓縮機(jī)+蒸汽發(fā)生器操作流程：開(kāi)機(jī)空罐滅菌加入培養(yǎng)液實(shí)罐滅菌冷卻接種工藝參數(shù)設(shè)定運(yùn)行：發(fā)酵+通氣終點(diǎn)：放料清洗關(guān)機(jī)。報(bào)告1.記錄生物發(fā)酵罐的詳細(xì)結(jié)構(gòu)。2.說(shuō)明生