「細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識【學(xué)習(xí)資料】」.ppt

WALVAXIntroduction 玉溪嘉和生物藥業(yè)有限公司 細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識王建清 1 學(xué)習(xí)資料 內(nèi)容 單抗基本知識細(xì)胞基本知識設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制無菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存 復(fù)蘇 2 學(xué)習(xí)資料 抗體基本概念及抗體結(jié)構(gòu) 抗體基本概念B細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白抗體的結(jié)構(gòu)四條肽鏈通過鏈間二硫鍵組成H2L2重鏈 五類 isotype a g m d e 輕鏈 兩型 k l 3 學(xué)習(xí)資料 抗體基本概念及抗體結(jié)構(gòu) 抗體的三個(gè)功能區(qū)可變區(qū) Variableregion VH VL Fv 結(jié)合抗原VH和VL 重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)高變區(qū)HVR 抗原結(jié)合部位 互補(bǔ)決定區(qū)CDR骨架區(qū)FR1 4恒定區(qū) Constantregion CH CL 絞鏈區(qū) Hingeregion 4 學(xué)習(xí)資料 抗體基本概念及抗體結(jié)構(gòu) 免疫球蛋白的類型類型 Class 重鏈C區(qū)抗原性IgG IgA IgM IgD IgE亞類 Subclass 重鏈抗原性 二硫鍵數(shù)目位置IgG1 4 5 學(xué)習(xí)資料 單克隆抗體和基因工程單抗 6 學(xué)習(xí)資料 單克隆抗體和基因工程單抗 人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體 7 學(xué)習(xí)資料 單克隆抗體和基因工程單抗 8 學(xué)習(xí)資料 鼠抗體嵌合抗體66 人源化抗體90 全人抗體100 單克隆抗體和基因工程單抗 9 學(xué)習(xí)資料 單抗基本知識細(xì)胞基本知識設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制無菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存 復(fù)蘇 10 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞基礎(chǔ)知識 細(xì)胞學(xué)的由來細(xì)胞及細(xì)胞學(xué)說的提出 1665年英國學(xué)者Roberthooke 用自制的顯微鏡觀察軟木的薄片 第一次發(fā)現(xiàn)植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu) 并首次借用拉丁文Cella 小室 這個(gè)詞稱呼他們看到的類似于蜂巢的極小的封閉小室 德國植物學(xué)家施萊登 1838 M JSchleiden 動(dòng)物學(xué)家施旺 1839 T schwann 提出動(dòng)植物都是細(xì)胞的集合物 使細(xì)胞及其功能有了一個(gè)較為明確的定義 確立了 細(xì)胞學(xué)說 的基本原則 這時(shí) 細(xì)胞學(xué)說 主要內(nèi)容是 1 細(xì)胞是有機(jī)體 動(dòng)植物都是由細(xì)胞發(fā)育來的 2 每個(gè)細(xì)胞都作為一個(gè)相對的獨(dú)立單位 有自己的 生命 3 新的細(xì)胞可以通過老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生 11 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞基本知識 細(xì)胞的基礎(chǔ)知識1 細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位 細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位 一切機(jī)體均由細(xì)胞構(gòu)成 病毒是非細(xì)胞形態(tài)的生命 細(xì)胞不僅是機(jī)體的基本形態(tài)機(jī)構(gòu)單位 也是機(jī)體的基本功能單位 機(jī)體的生長 發(fā)育 繁殖和進(jìn)化都是以細(xì)胞為基礎(chǔ) 細(xì)胞同時(shí)也是機(jī)體發(fā)生疾病的基礎(chǔ) 2 細(xì)胞的基本共性 構(gòu)成細(xì)胞的基本化學(xué)因素只O C H N P S Ca K Fe Na Cl Mg等 他們構(gòu)成細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)所需的許多無極化合物和各種生物分子 構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基本生物大分子是 核酸 蛋白質(zhì) 脂肪和糖類 這些大分子一般以符合分子形成如核蛋白 脂蛋白 糖蛋白或糖脂等組成細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu) 12 學(xué)習(xí)資料 3 細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)在亞顯微結(jié)構(gòu)水平上 細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)大體可以分成三種體系 主要由脂蛋白構(gòu)成的生物膜系統(tǒng) 如細(xì)胞膜 核膜及一系列重要細(xì)胞器如 線粒體 高爾基體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 溶酶體和液泡等的封閉膜 第二類主要由核酸蛋白成分構(gòu)成的顆粒與顯微結(jié)構(gòu)系統(tǒng) 如染色質(zhì)與核仁基質(zhì) 核蛋白體等 第三類有蛋白質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞骨架 主要是微絲與微管 中心體 紡錘體 纖毛 鞭毛等專門結(jié)構(gòu) 細(xì)胞基本知識 1 核仁2 細(xì)胞核3 核糖體4 囊泡5 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)6 高爾基體7 細(xì)胞骨架8 滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)9 線粒體10 液泡11 細(xì)胞質(zhì)12 溶酶體13 中心粒 13 學(xué)習(xí)資料 4 細(xì)胞作為生命活動(dòng)的基本單位的共同特點(diǎn) 首先所有細(xì)胞表面均有一層脂蛋白成分的生物膜 使細(xì)胞能與周圍環(huán)境保持相對獨(dú)立性 其次所有細(xì)胞都有兩種核酸 即DNA和RNA作為遺傳信息的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)基礎(chǔ) 第三作作為蛋白質(zhì)合成的 機(jī)器 核蛋白 是一切細(xì)胞不可缺少的基本結(jié)構(gòu) 第四所有細(xì)胞都是以一分為二的分裂方式增值 第五細(xì)胞具有多樣性 形狀 大小 懸殊很大 結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度也很不一樣 5 原核細(xì)胞與真核細(xì)胞 這兩種細(xì)胞是根據(jù)進(jìn)化程度與結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度來劃分的 原核細(xì)胞 Procaryticcell 它沒有典型的核結(jié)構(gòu) 沒有核膜 只有一個(gè)比較集中的核區(qū) 其中分布著環(huán)裝DNA絲 細(xì)胞內(nèi)缺少重要細(xì)胞器 但有時(shí)有核蛋白體及游離的質(zhì)粒 plasmid 原核細(xì)胞的繁殖以直接分裂 無絲分裂 為主 DNA復(fù)制 RNA轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成同時(shí)連續(xù)進(jìn)行 細(xì)胞基本知識 14 學(xué)習(xí)資料 6 從進(jìn)化角度真核細(xì)胞與原核細(xì)胞有兩點(diǎn)區(qū)別 第一細(xì)胞膜系統(tǒng)的分化與演變不同 真核細(xì)胞以膜系統(tǒng)的分化為基礎(chǔ) 分化成各種重要的細(xì)胞器 第二遺傳信息與遺傳裝置的擴(kuò)增與復(fù)雜化程度不一 真核細(xì)胞 Eucaryoticcell 進(jìn)化程度高 結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜 細(xì)胞基本知識 15 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞周期 細(xì)胞分裂周期 即單個(gè)細(xì)胞的生長過程 指母細(xì)胞分裂后形成的細(xì)胞到下一次再分裂成兩個(gè)子細(xì)胞之間的時(shí)期 細(xì)胞的增殖是生物最根本的特征 細(xì)胞是借助分裂來進(jìn)行增殖的 通過細(xì)胞分裂即可將復(fù)制的遺傳物質(zhì)平均地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中 我們進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)際是在細(xì)胞群體和個(gè)體的情況下考查細(xì)胞行為的 大部分細(xì)胞群體都由分裂和不分裂兩部細(xì)胞混合組成 而不分裂細(xì)胞又可分為兩類 即保持再進(jìn)入細(xì)胞周期能力的G0期細(xì)胞 或叫靜置細(xì)胞或休止細(xì)胞 及不分裂最終注定要死亡的終止分化細(xì)胞 或稱之終端分化細(xì)胞 他們不能再進(jìn)入周期 進(jìn)入周期內(nèi)的細(xì)胞可以分為兩個(gè)期 間期 G1 S G2 M期 有絲分裂期 整個(gè)細(xì)胞周期組成是G0 G1 S G2 M 細(xì)胞基本知識 16 學(xué)習(xí)資料 間期G1期 DNA合成前期或細(xì)胞分裂后期 這一期細(xì)胞代謝比較活躍 RNA 蛋白質(zhì)合成旺盛 為S期的DNA合成做好準(zhǔn)備 此期后階段 中心體會進(jìn)行分裂 這一期從細(xì)胞生理變化上有一個(gè)矯正點(diǎn) R點(diǎn) 由于各種內(nèi)外因素的影響 它可能控制G1期的延續(xù)時(shí)間變化 因此G1期的長短變化極大 S期 DNA合成期 此期結(jié)束DNA會加倍 早期復(fù)制的DNA富有G C堿基 晚期復(fù)制的DNA富有A T堿基 此期DNA合成的同時(shí) 也有組蛋白的合成 G2期 DNA合成后期 分裂前期 有活躍的RNA蛋白質(zhì)合成 DNA含量已加倍 有微管的合成 為M期紡錘絲微管組裝提供原料 17 學(xué)習(xí)資料 M期 前期 此期的主要特征是染色質(zhì)濃縮 確定分裂極 核仁解體 核膜消失 DNA分子螺旋化和折疊 雙螺旋縮短 形成染色單體 進(jìn)而變成雙結(jié)構(gòu) 中間有著絲粒相連 此時(shí)中心粒出現(xiàn) 周圍有微管形成的星體 逐漸分離 到相對應(yīng)位置形成細(xì)胞兩極 中心粒間的微管延長 形成紡錘體 染色體界于赤道部 中期 進(jìn)入中期的染色體高度濃縮 形成典型中期染色體 部分紡錘體開始附著著絲粒上 染色體在赤道面上形成赤道板 后期 染色體開始一分為二 幾乎所有的染色體同時(shí)分離 染色體被染色體絲拉向兩極 細(xì)胞也向兩極方向延長呈橢圓形 最后在赤道部凹下形成啞鈴狀 末期 染色體達(dá)到細(xì)胞兩極 開始解螺旋 并形成染色質(zhì) 核膜逐漸形成 核仁出現(xiàn) 胞體逐漸分離 形成兩個(gè)子細(xì)胞 兩個(gè)子細(xì)胞進(jìn)入G1期 18 學(xué)習(xí)資料 單抗基本知識細(xì)胞基本知識設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制無菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存 復(fù)蘇 19 學(xué)習(xí)資料 一 細(xì)胞常用設(shè)備和器材 二氧化塔搖床 超凈工作臺 設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制 20 學(xué)習(xí)資料 倒置顯微鏡 電動(dòng)助吸器 程序降溫盒 21 學(xué)習(xí)資料 不銹鋼柱式濾器 22 學(xué)習(xí)資料 液氮罐 細(xì)胞培養(yǎng)板 23 學(xué)習(xí)資料 培養(yǎng)基儲存瓶 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 24 學(xué)習(xí)資料 器材的清洗和滅菌不要讓污染了的器皿變干 清洗的重要性除化學(xué)污染 鹽 油污 蛋白質(zhì) 重金屬等使培養(yǎng)瓶內(nèi)表面帶負(fù)電荷 供細(xì)胞附著 滅菌的重要性除去微生物污染 酸液配方 25 學(xué)習(xí)資料 新的玻璃器皿的清洗滅菌自來水刷洗 除去灰塵 烘干 泡鹽酸 烤箱中烘干 然后再浸入5 稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物 鉛 砷等物 刷洗 烘干 泡酸12小時(shí)后立即用自來水沖洗 再用洗滌劑刷洗 自來水沖洗干凈后用烤箱烘干 泡酸 清洗 用酸浸泡12小時(shí) 然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗10次 最后蒸餾水沖洗3 5次 烘干 包裝 移液管和滴管的尾端要塞入棉花 高壓滅菌 烘干備用 26 學(xué)習(xí)資料 使用后的玻璃器皿的清洗滅菌刷洗 烘干 使用過的玻璃器皿立即用清水刷洗干凈 自來水浸泡過夜 泡酸前用自來水沖洗干凈 烘干 泡酸 清洗 烘干后泡入鹽酸 12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗10次 避免蛋白質(zhì)干后粘附于玻璃上難以清洗 過蒸餾水3次 烘干 包裝高壓滅菌烘干備用 27 學(xué)習(xí)資料 金屬器皿的清洗滅菌金屬器皿不能泡酸 清洗時(shí)可先用洗滌劑刷洗 后用自來水沖干凈 然后用75 酒精擦拭 再用自來水 然后用蒸餾水沖洗 再烘干或空氣中晾干 放入鋁制和內(nèi)包裝好 高壓滅菌 再烘干備用 橡膠和塑料器皿的清洗滅菌刷洗 烘干 使用后立即用清水刷洗干凈 自來水浸泡過夜 泡酸前用自來水沖洗干凈烘干 泡入5 鹽酸過夜 自來水沖洗10次 過蒸餾水3次 烘干高壓蒸汽滅菌烘干備用滴管膠頭可用75 酒精浸泡5分鐘 紫外線照射消毒 28 學(xué)習(xí)資料 二 細(xì)胞常用的培養(yǎng)液和試劑培養(yǎng)用液是維持組織細(xì)胞生存 生長及進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過程中所需的基本溶液 設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制 29 學(xué)習(xí)資料 1 平衡鹽溶液 BSS BSS又稱生理鹽水或鹽溶液 主要由無機(jī)鹽和葡萄糖組成 本身具有維持滲透壓 調(diào)控酸 堿度平衡的作用 同時(shí)能共給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分 用作洗滌組織 細(xì)胞及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液 幾種常用的平衡鹽溶液 Ringer PBS Tyrode Earle Hank s Dulbecco 都有相應(yīng)配方 最簡單的BSS是Ringer D Hank s與Hank s的主要區(qū)別在于前者不含有Ca2 Mg2 因此D Hank s常用于配制胰酶溶液 配制平衡鹽溶液也應(yīng)當(dāng)用新鮮的三蒸水 配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫高壓滅菌 有渾濁或沉淀時(shí) 應(yīng)重新配制 D Hank s 30 學(xué)習(xí)資料 2 培養(yǎng)基培養(yǎng)基就是人工模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境 維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)物質(zhì) 他是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的物質(zhì)基礎(chǔ) 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基有血清 血漿 和組織提取液 如雞胚和牛胚浸液 優(yōu)點(diǎn) 營養(yǎng)成分豐富 培養(yǎng)效果好 缺點(diǎn) 來源受限 成分復(fù)雜 影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 易發(fā)生支原體污染 合成培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量 用人工方法模擬合成的 優(yōu)點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn) 組分和含量相對固定 成本低 缺點(diǎn) 缺少某些成分 不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要 31 學(xué)習(xí)資料 五大常用培養(yǎng)基RPMI1640Dulbecco sModifiedEaglesMedium DMEM MinimumEssentialMedium MEM Iscove sModifiedDulbecco sMedium IMDM Medium199GBM05 21種氨基酸 8種無機(jī)鹽 18種微量元素 12種維生素 11種其它營養(yǎng)物組成 32 學(xué)習(xí)資料 33 學(xué)習(xí)資料 3 其它培養(yǎng)用液消化液胰酶溶液 濃度一般為0 1 0 25 配制時(shí)要用不含Ca2 Mg2 及血清的平衡鹽溶液 EDTA溶液 一種化學(xué)螯合劑 對細(xì)胞有一定離散作用 毒性小 使用方便 濃度為0 02 可與胰酶混合使用 可4 冰箱保存 使用EDTA處理細(xì)胞后 要用平衡鹽液沖洗干凈 因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長 膠原酶溶液 使用濃度0 1 0 3mg L或200000U L 作用最佳pH6 5 膠原酶不受Ca2 Mg2 及血清的抑制 膠原酶作用溫和 不易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷 但價(jià)格昂貴 谷氨酰胺補(bǔ)充液 合成培養(yǎng)基中的必須成分 但容易降解 所以都是在使用前添加 一般配制成100倍濃縮液 20 pH調(diào)整液NaHCO3溶液 保證培養(yǎng)基在5 CO2環(huán)境下PH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn) HEPES 一種弱酸 羥乙基哌嗪乙硫磺酸 對細(xì)胞無毒性 主要是防止培養(yǎng)基pH迅速變化 使用濃度0 01 0 05mol L 抗生素溶液 在培養(yǎng)液內(nèi)加入適量抗生素 以抑制可能存在的細(xì)菌生長 青霉素100u mL 鏈霉素100ug mL 34 學(xué)習(xí)資料 培養(yǎng)基儲存液體培養(yǎng)基分裝后不可在 20 下保存 因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的鹽容易析出 而再次融化后 有的鹽可能無法重新溶解 從而導(dǎo)致培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和滲透壓改變 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí) 容易細(xì)胞破裂而死亡 培養(yǎng)基開瓶后盡快用完 不宜長時(shí)間保存 因?yàn)闀r(shí)間過長會導(dǎo)致液體培養(yǎng)基中鹽分的析出和pH的改變 35 學(xué)習(xí)資料 碳酸氫鈉的作用及含量與CO2一起形成緩沖系統(tǒng) 保持培養(yǎng)基pH值穩(wěn)定 不同的培養(yǎng)基要求添加NaHCO3的量不一樣 如DMEM要求添加3 7g L 為了保持pH值穩(wěn)定 必須用高濃度的CO2平衡 一般不低于8 而1640等要求添加NaHCO32 2g L 還有些培養(yǎng)基要求添加更少 那么這些培養(yǎng)基就要求較低CO2的濃度平衡 一般是5 HEPES的作用及含量培養(yǎng)基中最常用的Buffersystem是碳酸氫鈉 它可以提供營養(yǎng) 但卻在生理pH值條件下會降低緩沖能力 而HEPES是一種很強(qiáng)的Buffer 加入HEPES能使細(xì)胞培養(yǎng)基在pH7 2 7 6條件下緩沖能力增強(qiáng) HEPES在培養(yǎng)基中的終濃度通常為35mmol 非必須 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行添加 36 學(xué)習(xí)資料 丙酮酸鈉的作用丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源 盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源 但是 如果沒有葡萄糖的話 細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉 保證細(xì)胞更好地生長 但非必須成分 谷氨酰胺的作用幾乎所有的細(xì)胞對谷氨酰胺都有較高的要求 谷氨酰胺脫掉氨基后 可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源 參與蛋白質(zhì)的合成和能量代謝 在缺少谷氨酰胺時(shí) 細(xì)胞生長不良而死亡 但同時(shí)L 谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成 而氨對于一些細(xì)胞具有毒性 谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定 加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4 冰箱儲存兩周以上時(shí) 應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺 37 學(xué)習(xí)資料 單抗基本知識細(xì)胞基本知識設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制無菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存 復(fù)蘇 38 學(xué)習(xí)資料 無菌技術(shù) 微生物污染一直是細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題 39 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞污染的種類細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌 真菌 支原體和病毒 污染源無菌操作技術(shù)不當(dāng)操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細(xì)胞細(xì)菌和真菌的污染和鑒別肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法 40 學(xué)習(xí)資料 細(xì)菌污染細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染最常見的有 大腸桿菌 枯草桿菌 假單胞菌 白色葡萄球菌 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后 會出現(xiàn)培養(yǎng)液變渾濁 pH改變 污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變 胞內(nèi)顆粒增多 增粗 最后變圓脫落死亡 真菌污染真菌污染后 細(xì)胞生長變慢 但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡 41 學(xué)習(xí)資料 支原體的污染和鑒別造成支原體高污染的原因 支原體大小0 1 0 8um 無細(xì)胞壁 可透過一般過濾膜 0 22 0 45um 支原體污染時(shí) 沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化過去缺乏簡單 快捷且可靠的檢測方式細(xì)胞流通間缺乏物品管理 造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染研究和操作人員忽略污染問題已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基 血清 42 學(xué)習(xí)資料 支原體的鑒別方法相差顯微鏡觀察法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法PCR方法 43 學(xué)習(xí)資料 病毒的污染和鑒別細(xì)胞的直接觀察動(dòng)物接種檢查電子顯微鏡檢查免疫學(xué)檢查PCR技術(shù) 44 學(xué)習(xí)資料 無菌操作總則 任何時(shí)候都要毫不動(dòng)搖的在每一個(gè)操作環(huán)節(jié)都堅(jiān)持高標(biāo)準(zhǔn)的無菌技術(shù) 預(yù)防為主 不要讓無菌程度低的物品沾染無菌程度高的物品 45 學(xué)習(xí)資料 培養(yǎng)室的滅菌定期打掃培養(yǎng)室 每周打掃一次 用純化水拖地 擦桌子 超凈工作臺 然后用消毒劑擦拭消毒 CO2搖床 先用0 3 新潔爾滅擦拭 然后用75 酒精擦拭或0 5 過氧乙酸 再用紫外燈照射 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈 定期消毒 實(shí)驗(yàn)前 用75 酒精 0 3 新潔爾滅 擦拭超凈臺 邊臺 倒置顯微鏡的載物臺 操作人員的無菌準(zhǔn)備 肥皂洗手 穿好隔離衣 帶好隔離帽 口罩 穿好拖鞋戴乳膠手套 75 酒精擦手 46 學(xué)習(xí)資料 工作面無菌原則 保持工作面干凈 使用前用75 乙醇充分擦洗工作面 打開紫外燈照射30分鐘 盡量少放物品 帶入必須的 移走不必要的 工作臺面物品整齊有序 實(shí)驗(yàn)完畢后移走所有物品 并徹底擦洗工作面 開紫外燈照射30分鐘 47 學(xué)習(xí)資料 凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的物品表面要用消毒劑進(jìn)行外表面消毒 靠近酒精燈火焰操作 玻璃器皿使用前必須過火滅菌 打開和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近 無菌級別高的物品不能觸碰無菌級別低的物品 手不能從敞開的瓶口上方經(jīng)過 各種操作靠近酒精燈燈 動(dòng)作輕 準(zhǔn)確 不能亂碰 吸取兩種以上的溶液時(shí)要注意更換吸管 防止交叉污染 無菌操作 48 學(xué)習(xí)資料 手握試管 移液管時(shí)盡量遠(yuǎn)離工作端 盡可能減少開蓋時(shí)間隨時(shí)擦去任何溢出物 任何時(shí)候都不要把液體從一個(gè)無菌容器倒入另一個(gè)無菌容器 傾倒廢液時(shí)防止濺起和瓶口回流 在視野范圍內(nèi)工作 無菌思想貫穿到細(xì)胞培養(yǎng)的任何操作步驟 49 學(xué)習(xí)資料 單抗基本知識細(xì)胞基本知識設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制無菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存 復(fù)蘇 50 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 從體內(nèi)組織取出細(xì)胞模擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境 在無菌 適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下 使其生長繁殖 并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù) 原代培養(yǎng) 從體內(nèi)取出組織或細(xì)胞的第一次培養(yǎng) 應(yīng)該定義為首次成功地傳代培養(yǎng)之前的培養(yǎng)為原代培養(yǎng) 傳代 無論是稀釋 將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)皿中的繼續(xù)培養(yǎng)即稱為傳代或傳代培養(yǎng) 也稱再培養(yǎng) 單層培養(yǎng) 培養(yǎng)細(xì)胞在底物上分裂增殖 平鋪長成單層細(xì)胞 一方面細(xì)胞可能長滿培養(yǎng)空間 另一方面細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸抑制 細(xì)胞的生長速度逐漸減慢甚至停止 細(xì)胞培養(yǎng) 51 學(xué)習(xí)資料 懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖 這些細(xì)胞無依賴于貼附底物或支持物上生長的性質(zhì) 細(xì)胞系 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系 由原細(xì)胞系分離出具有與原細(xì)胞系不同性狀的細(xì)胞系稱為亞系 細(xì)胞株 通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志 并能穩(wěn)定保持這些特性的培養(yǎng)物為細(xì)胞株 細(xì)胞密度 細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液或細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)時(shí) 在沒毫升懸液中所含細(xì)胞數(shù) 代或世代 從細(xì)胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的一段時(shí)間叫一代 作為群體細(xì)胞要經(jīng)游離期 對數(shù)期與停止期等三個(gè)階段 52 學(xué)習(xí)資料 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型貼壁生長型細(xì)胞 必須依附支持物的表面生存的一類細(xì)胞 這類細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)多有一個(gè)依附的環(huán)境 形態(tài)附著方式也是多態(tài)性 常見有上皮型細(xì)胞 成纖維型細(xì)胞 游走型細(xì)胞 多形型細(xì)胞 貼壁是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式 細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后 同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長 因而屬于貼壁型細(xì)胞 1 上皮型細(xì)胞 2 成纖維型細(xì)胞 3 游走型細(xì)胞 4 多形型細(xì)胞 53 學(xué)習(xí)資料 懸浮生長型細(xì)胞 來源于血液 脾臟 或骨髓細(xì)胞 不依附任何支持物 懸浮于培養(yǎng)液中的單個(gè)或小的細(xì)胞團(tuán)形式生長 54 學(xué)習(xí)資料 培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn) 培養(yǎng)細(xì)胞生長特點(diǎn)上皮型細(xì)胞 易相連成片 想靠 緊密相連 成薄層 鋪路石狀 生長時(shí)呈膜狀移動(dòng) 很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng) 成纖維型細(xì)胞 排列成放射狀 漩渦狀并不緊靠連成片 細(xì)胞 細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng) 游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞 常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起 55 學(xué)習(xí)資料 多行型細(xì)胞 多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞 其細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分 胞突為細(xì)長形 似絲狀偽足 胞體雖略呈多角形 但沒有成纖維細(xì)胞型那樣規(guī)則 體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細(xì)胞最常見的類型是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 游走型細(xì)胞 本型細(xì)胞在支持物上散在生長 一般不連成片 細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起 呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng) 速度快且不規(guī)則 56 學(xué)習(xí)資料 懸浮型細(xì)胞 培養(yǎng)時(shí)不貼附底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形 單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán) 優(yōu)點(diǎn) 生存空間大 提供數(shù)量大 傳代方便 不需要消化 易于收獲缺點(diǎn) 觀察不方便 純化不方便 不能通過離心將死活細(xì)胞分離 57 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞系生長過程原代 初代 培養(yǎng)期 從機(jī)體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代 此代細(xì)胞種類較多 維持時(shí)間因細(xì)胞種類不同 一般1 4周 傳代培養(yǎng)期 初代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到一定程度 即可連接傳代 使其連續(xù)生長 一般二倍體細(xì)胞 不加附加條件 可傳代30 50代 此時(shí)可發(fā)生染色體丟失 突變 細(xì)胞增殖變慢 停止分裂 進(jìn)入衰退期 我們稱之有限細(xì)胞系 有些細(xì)胞的少數(shù)后代 或通過人工條件轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過這一期 獲得持久的增殖傳代能力 我們稱無線細(xì)胞系 細(xì)胞系生長過程 衰退期 傳代細(xì)胞到達(dá)一定代數(shù) 即發(fā)生增殖緩慢 逐漸停止 進(jìn)而發(fā)生衰退 死亡 這一現(xiàn)象可能說明生物學(xué)衰老的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ) 人胚胎成纖維細(xì)胞可以進(jìn)行60代增殖 而80歲老人的肺成纖維細(xì)胞僅傳代了16代后便死亡 培養(yǎng)細(xì)胞生長過程 58 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞傳代生長過程潛伏期 細(xì)胞有生長活動(dòng) 而無細(xì)胞分裂 細(xì)胞株潛伏期一般為6 24小時(shí) 對數(shù)生長期 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長 活力最佳 最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究停滯期 平臺期 細(xì)胞長滿瓶壁 一定細(xì)胞密度 后 細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制 接觸抑制 密度限制 59 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞生長條件與環(huán)境 一 細(xì)胞生長的營養(yǎng)需要 1 基本營養(yǎng)物質(zhì) 1 氨基酸 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位 細(xì)胞培養(yǎng)常需12種氨基酸 谷氨酰胺 異亮氨酸 亮氨酸 胱氨酸 精氨酸 組氨酸 色氨酸 蘇氨酸 蛋氨酸 賴氨酸 頡氨酸 苯丙氨酸 谷氨酸 2 維生素 煙氨酸 葉酸 核黃素 B12 泛酸 吡哆醇 維生素C等 3 碳水化合物 提供細(xì)胞能源主要是葡萄糖 4 無機(jī)離子 鈉 鉀 鎂 鈣 磷2 促細(xì)胞生長因子 種類很多 多因特殊細(xì)胞生長 或一定目的而加入不同促細(xì)胞生長因子 3 血清 是細(xì)胞培養(yǎng)的主要營養(yǎng)成分 除含多種細(xì)胞生長所必須的成分 血清的作用機(jī)制商在探索 也不應(yīng)忽視血清中對某些細(xì)胞的有害成分 因此 實(shí)驗(yàn)室的血清要經(jīng)過篩選 60 學(xué)習(xí)資料 二 細(xì)胞的生存環(huán)境 1 溫度 一般的細(xì)胞培養(yǎng)最適溫度為35 37 不同動(dòng)物種的細(xì)胞 或經(jīng)過處理的細(xì)胞也可能由不同的要求 2 氣相及pH 體外細(xì)胞培養(yǎng)需要一定的氣相環(huán)境 一般為95 空氣加5 二氧化碳 大多數(shù)細(xì)胞所需pH在7 2 7 4 但是 細(xì)胞培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類不同而不同 成纖維細(xì)胞喜歡較高pH 7 4 7 7 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏低pH 7 0 7 4 體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞耐酸能力要強(qiáng)于耐堿能力 3 滲透壓 培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定的適應(yīng)范圍細(xì)胞通?？赡?60mOsm kg 320mOsm kg 四 無污染和無毒1 細(xì)胞培養(yǎng)中的污染問題 1 微生物 細(xì)菌 霉菌 支原體 污染防治 2 實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞交叉污染2 無毒 凡與細(xì)胞接觸的器材 培養(yǎng)基均應(yīng)保持無任何細(xì)胞毒性 細(xì)胞生長條件與環(huán)境 61 學(xué)習(xí)資料 單抗基本知識細(xì)胞基本知識設(shè)備與器材準(zhǔn)備 溶液配制無菌技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)凍存 復(fù)蘇 62 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法1 設(shè)備儀器自動(dòng)計(jì)數(shù)法設(shè)備計(jì)數(shù)速度快 準(zhǔn)確度高 偏差小等特點(diǎn)2 細(xì)胞計(jì)數(shù)版計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)版計(jì)數(shù)速度慢 準(zhǔn)確度低 偏差大 誤差大 63 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞計(jì)數(shù)操作1 制備單細(xì)胞懸液 取一小部分 500ul 至1 5ml取樣管中 加入等體積0 4 臺盼藍(lán)染液 2 75 酒精清洗計(jì)數(shù)版表面 注意不要?jiǎng)潅?jì)數(shù)表面 將已染色待細(xì)胞懸液吹打均勻 然后用移液器吸取20ul細(xì)胞懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入 要保證蓋片下充滿懸液 液體剛好流到計(jì)數(shù)版凹槽邊緣 注意蓋片下不要有氣泡 也不能讓懸液流入旁邊槽中 3 將計(jì)數(shù)版平放在顯微鏡載物臺上計(jì)數(shù) 64 學(xué)習(xí)資料 統(tǒng)計(jì)角上四個(gè)大格的活細(xì)胞數(shù) 對于壓線細(xì)胞的處理 數(shù)上不數(shù)下 數(shù)左不數(shù)右 細(xì)胞團(tuán)按照一個(gè)細(xì)胞計(jì) 計(jì)算結(jié)果 細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù) ml 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)之和 4 104 2 65 學(xué)習(xí)資料 細(xì)胞計(jì)數(shù)的注意事項(xiàng)1 制備單細(xì)胞懸液 不可有較多成團(tuán)細(xì)胞 2 取樣均勻 多次取樣計(jì)數(shù)取平均值 3 細(xì)胞密度 每mm2細(xì)胞數(shù)大于100 一般100 300 若需精確定量