藥品微生物限度與無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)及體會(huì)課件.ppt

藥品微生物限度與無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)及體會(huì) 中國(guó)藥品生物制品檢定所馬仕洪北京2007年1月 website e mail mash tel 010 67095509 地址 北京市天壇西里2號(hào)郵編 100050 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 2 一 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的背景及程序 1 關(guān)于方法驗(yàn)證 背景 2 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的一般原則和程序 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 3 1 關(guān)于方法驗(yàn)證 背景 中國(guó)藥典 2005版國(guó)食監(jiān)注 2005 234號(hào) 關(guān)于頒布和執(zhí)行 中國(guó)藥典 2005年版有關(guān)事宜的通知 國(guó)藥典發(fā) 2005 98號(hào) 關(guān)于執(zhí)行 中國(guó)藥典 2005年版微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法有關(guān)問(wèn)題的說(shuō)明 中檢藥 2006 862號(hào) 第七屆全國(guó)藥品檢驗(yàn)所抗生素室主任工作會(huì)議暨全國(guó)藥品微生物檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)研討會(huì)會(huì)議紀(jì)要 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 4 為什么驗(yàn)證 1 采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法 是分析測(cè)量科學(xué)的基本要求 是各種法規(guī)遵循工作的基礎(chǔ) 藥品微生物檢查作為整個(gè)藥品質(zhì)量體系中的一個(gè)環(huán)節(jié) 應(yīng)與其他檢驗(yàn)項(xiàng)目一樣 對(duì)方法和條件進(jìn)行考察 以保證結(jié)果的科學(xué)性 如鑒別 含量測(cè)定 2 驗(yàn)證的思想其實(shí)早已貫徹于微生物檢測(cè)的諸多方面 無(wú)菌環(huán)境驗(yàn)證 塵埃離子 浮游菌 沉降菌檢測(cè) 滅菌器的驗(yàn)證 培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè) 陰性對(duì)照 陽(yáng)性對(duì)照等等 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 5 為什么驗(yàn)證 3 2005版充分借鑒發(fā)達(dá)國(guó)家經(jīng)驗(yàn) 將微生物檢查方法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了更加系統(tǒng)化的規(guī)定和要求 驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明 驗(yàn)證 保證其對(duì)結(jié)果判斷沒(méi)有影響 4 有了系統(tǒng)的方法驗(yàn)證 可以避免以往因?yàn)殛?yáng)性菌選擇不合理 方法不合理而造成的漏檢 誤判 以保證結(jié)果的科學(xué)可靠 這一點(diǎn)無(wú)論對(duì)于當(dāng)前無(wú)菌檢查的一次性報(bào)告 還是對(duì)于實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證認(rèn)可 以及新的藥品注冊(cè)管理辦法的要求都是相一致的 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 6 為什么驗(yàn)證 5 驗(yàn)證的必要性 質(zhì)量控制的新手段 不同企業(yè)以及同企業(yè)不同批次黃連上清丸稀釋法的回收率比較試驗(yàn)結(jié)果 可能反映了不同黃連上清丸樣品的質(zhì)量差異 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 7 表5七企業(yè)黃連上清丸稀釋法的回收率比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab1Recoveryofdilutemethodinmicrobiologicaltestofhuanglianshangqingwanfrom7corporations 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 8 表6同廠不同批黃連上清丸稀釋法的回收率比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 200 Tab2recovericeofdilutemethodinmicrobiologicaltestofhuanglianshangqingwanfromdifferentbatchsinsamecorporation 1 200 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 9 2 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的一般原則和程序 驗(yàn)證什么 怎么驗(yàn)證 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 10 驗(yàn)證什么 微生物檢驗(yàn) 某種樣品采用某種方法得到一個(gè)檢查結(jié)果 What 供試品影響 方法的有效性 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 11 驗(yàn)證什么 需前處理 不需前處理 有抑菌作用 無(wú)抑菌作用 樣品 檢查 去除抑菌作用 驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng) 檢出的影響 驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性 以及去除方法對(duì)污染菌生長(zhǎng) 檢出的影響 可以通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判斷 圖1藥品微生物檢查方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié) What 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 12 驗(yàn)證什么 需要驗(yàn)證的重點(diǎn)環(huán)節(jié) 驗(yàn)證實(shí)際上伴隨著整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明 驗(yàn)證 保證其對(duì)結(jié)果判斷沒(méi)有影響 前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性 應(yīng)在驗(yàn)證范圍內(nèi) 已有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程 SOP 和充足實(shí)驗(yàn)證明的前處理方法可以直接采用 但出現(xiàn)疑問(wèn)應(yīng)進(jìn)一步研究提高 供試品中抗菌活性的去除是當(dāng)前驗(yàn)證工作的重點(diǎn) 尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗(yàn)證供試品本身對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 13 方法疑問(wèn)實(shí)例 菌在何處 表710ml菌懸液500r min離心5min離心后離心管不同部位菌懸液的計(jì)數(shù)結(jié)果 cfu mL 離心集菌法 500r min離心5min r min g 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 14 怎么驗(yàn)證 利用供試品與微生物的差異 降低或消除供試品的影響 通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)對(duì)降低或消除效果加以檢驗(yàn) How 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 15 稀釋法薄膜法中和法離心法 供試品 前處理 去除抗菌活性 稀釋溶解分散萃取離心 供試品污染微生物檢查 驗(yàn)證 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 16 供試品中抗菌活性的去除 稀釋法 降低供試品的相對(duì)濃度薄膜法 利用體積差異分離中和法 利用化學(xué) 生物 專屬性滅活離心法 利用沉降系數(shù)差異分離 各方法組合運(yùn)用 效果更佳 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 17 抗菌活性去除效果的檢驗(yàn) 應(yīng)根據(jù)供試品的特點(diǎn) 選擇敏感菌株 對(duì)供試品抗菌活性去除效果加以檢驗(yàn) 陽(yáng)性菌的回收實(shí)驗(yàn) 再按藥典要求全面驗(yàn)證 提高效率 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 18 選擇敏感菌株 間接方法 文獻(xiàn) 技術(shù)資料 可靠 直接方法 預(yù)實(shí)驗(yàn) 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 參考選擇 一般中藥選擇枯草和金葡 一般抗生素根據(jù)抗菌譜選擇 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 19 表8選擇敏感菌株 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 20 二 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)要點(diǎn) 1 無(wú)菌檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)2 微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)實(shí)例 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 21 1 無(wú)菌檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) 樣品菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液標(biāo)準(zhǔn)化操作實(shí)驗(yàn)器材 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 22 無(wú)菌檢查樣品 無(wú)菌檢查樣品 取樣量 量 樣品特性 質(zhì) 抗菌活性 劑型 檢驗(yàn)數(shù)量 檢驗(yàn)量 側(cè)重驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 側(cè)重?zé)o菌檢查 敏感菌選擇去除抗菌活性方法選擇 前處理方法 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 23 無(wú)菌檢查樣品 主要是取樣量的問(wèn)題 中國(guó)藥典 2005年版對(duì)無(wú)菌檢查的 檢驗(yàn)數(shù)量 和 檢驗(yàn)量 作了明確的解釋和規(guī)定 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 24 表2中上市抽驗(yàn)樣品 液體制劑 的最少檢驗(yàn)量 每種培養(yǎng)基各接種10支供試品 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 25 表3中上市抽驗(yàn)樣品 固體制劑 的最少檢驗(yàn)量 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 26 表3注釋 1 每種培養(yǎng)基各接種10支供試品 2 抗生素粉針劑 5g 及抗生素原料藥 5g 的最少檢驗(yàn)數(shù)量為6瓶 或支 桶裝固體原料的檢驗(yàn)數(shù)量為4個(gè)包裝 3 如果醫(yī)用器械體積過(guò)大 培養(yǎng)基用量可在2000ml以上 將其完全浸沒(méi) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 27 無(wú)菌檢查樣品 三點(diǎn)體會(huì) 一是附錄規(guī)定檢驗(yàn)量的表格中不包括陽(yáng)性對(duì)照用樣品量 雖然附錄另處有專門(mén)說(shuō)明 仍然容易忽略 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 28 無(wú)菌檢查樣品 三點(diǎn)體會(huì) 二是無(wú)菌檢查時(shí)應(yīng)強(qiáng)調(diào) 檢驗(yàn)數(shù)量 主要是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的代表性 而陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)僅須滿足 檢驗(yàn)量 總量要求即可 以檢驗(yàn)樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 即保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可以由此減少大量的樣品 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 29 無(wú)菌檢查樣品 三點(diǎn)體會(huì) 三是對(duì) 檢驗(yàn)數(shù)量 和 檢驗(yàn)量 的把握應(yīng)考慮便于實(shí)際操作 比如處理100ml 袋的樣品 取9袋樣品一次分配到一組三聯(lián)濾器 檢驗(yàn)數(shù)量 大于藥典規(guī)定的6個(gè) 但 檢驗(yàn)量 似乎不符合藥典規(guī)定的每袋樣品取半量檢驗(yàn)的規(guī)定 僅為1 3 但根據(jù)藥典 檢驗(yàn)量 即為 一次實(shí)驗(yàn)所用供試品的總量 g或ml 的解釋 這與先將6袋分配兩個(gè)濾筒 再將剩下3袋抽入一個(gè)濾筒作為陽(yáng)性對(duì)照的方法一樣 卻更節(jié)省時(shí)間 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 30 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis CMCC B 63501 金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus CMCC B 26003 生孢梭菌Clostridiumsporogenes CMCC B 64941 銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa CMCC B 10104 大腸埃希菌Escherichiacoli CMCC B 44102 白色念珠菌Candidaalbicans CMCC F 98001 黑曲霉Aspergillusniger CMCC F 98003 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 31 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 驗(yàn)證用菌種的保藏使用頻繁傳代限制 5代 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 32 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 菌種保藏及應(yīng)用參考方法 干菌種 0代 100ml液體培養(yǎng)基復(fù)蘇 1代 100ml液體培養(yǎng)基復(fù)壯 2代 加100ml20 無(wú)菌甘油混勻 1ml 管凍存管分裝 20 或 80 保存每次使用取1支自然 室溫 解凍 取0 1ml接種至10ml液體培養(yǎng)基 生孢梭菌用12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 按規(guī)定培養(yǎng) 稀釋 3代 注意 已經(jīng)解凍的凍存管不能再冷凍保存 以免凍融 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 33 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身操作習(xí)慣總結(jié)出一套切實(shí)可行 快速穩(wěn)定的菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 34 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 參考菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序 取經(jīng)34 培養(yǎng)18 24小時(shí)的枯草芽孢桿菌 金黃色葡萄球菌 綠假單胞菌與大腸埃希菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml 加入9ml0 9 無(wú)菌氯化鈉溶液中 分別10倍稀釋備用 枯草芽孢桿菌至10 5 金黃色葡萄球菌10 6 綠假單胞菌與大腸埃希菌至10 7 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 35 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 參考菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序 取經(jīng)34 培養(yǎng)18 24小時(shí)的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物1ml 加入9ml0 9 無(wú)菌氯化鈉溶液中 10倍稀釋至10 7備用 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 36 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 參考菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序 取經(jīng)24 培養(yǎng)18 24小時(shí)的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)物1ml 加入9ml0 9 無(wú)菌氯化鈉溶液中 10倍稀釋至10 5備用 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 37 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 參考菌液制備標(biāo)準(zhǔn)程序 取經(jīng)培養(yǎng)一周的黑曲霉菌改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物 加0 9 無(wú)菌氯化鈉溶液5ml 洗下孢子 轉(zhuǎn)移至另一空管 加0 9 無(wú)菌氯化鈉溶液至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)后 取1ml加入9ml0 9 無(wú)菌氯化鈉溶液中 10倍稀釋至10 4備用 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 38 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 關(guān)于黑曲霉 轉(zhuǎn)種操作應(yīng)在超凈工作臺(tái) 或相當(dāng)此環(huán)境 中進(jìn)行 關(guān)閉風(fēng)機(jī) 靠近酒精燈操作 置23 28 培養(yǎng)5 7日 培養(yǎng)斜面形態(tài)可參照下圖 轉(zhuǎn)種完畢的凍存管和使用過(guò)的器具應(yīng)經(jīng)121 濕熱滅菌30分鐘再作處理 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 39 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 關(guān)于黑曲霉 黑曲霉孢子相當(dāng)穩(wěn)定 可以保存于4 0 9 氯化鈉溶液中較長(zhǎng)時(shí)間 作為孢子懸液儲(chǔ)備液使用 由此可以減少菌液制備工作量和反復(fù)操作黑曲霉的風(fēng)險(xiǎn) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 40 菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 菌液檢驗(yàn) 結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù) 生孢梭菌可在同步硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基靈敏度實(shí)驗(yàn)中計(jì)數(shù) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 41 標(biāo)準(zhǔn)化操作 方法選擇樣品處理沖洗方法和條件中和劑加入菌液加入 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 42 標(biāo)準(zhǔn)化操作 方法選擇取樣量大于5ml 支直接接種法不再適用 除非樣品不許可 難溶解 發(fā)展趨勢(shì)應(yīng)采用全封閉的薄膜過(guò)濾法 2020 1 29 43 可編輯 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 44 標(biāo)準(zhǔn)化操作 樣品處理主要強(qiáng)調(diào)固體樣品的溶解 轉(zhuǎn)移 均勻分配問(wèn)題 通常將規(guī)定取樣量全部轉(zhuǎn)移到400 500ml稀釋劑或者適宜溶液 再進(jìn)行分配 各廠家均專門(mén)開(kāi)發(fā)有固體制劑 粉針 專用濾器 我們提出了更為簡(jiǎn)便的無(wú)菌三針單聯(lián)管 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 45 標(biāo)準(zhǔn)化操作 沖洗方法強(qiáng)調(diào)少量多次 50ml 次 強(qiáng)調(diào)充分振搖 操作細(xì)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范 如集菌儀轉(zhuǎn)速 沖洗過(guò)程中蓋還是不蓋濾筒下口等等 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 46 標(biāo)準(zhǔn)化操作 菌液加入菌液組 供試品加菌液組嚴(yán)格一致 生孢梭菌的加入 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 47 標(biāo)準(zhǔn)化操作 中和劑加入不同中和劑加入方式可能效果不一樣 通過(guò)我們的經(jīng)驗(yàn) 基本傾向于直接加入培養(yǎng)基中效果最好 但如果某些中和劑對(duì)微生物生長(zhǎng)不利可考慮其他步驟加入 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 48 標(biāo)準(zhǔn)化操作 菌液加入按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽(yáng)性菌液 主要是考慮濾器的有效性 濾器的有效性應(yīng)由提供企業(yè)控制 用戶可采用適當(dāng)方法抽查 如檢查陽(yáng)性菌液通過(guò)濾筒的流出液 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 49 標(biāo)準(zhǔn)化操作 菌液加入而驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)主要考慮濾膜 濾器殘留抗菌物質(zhì)對(duì)陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的影響 可以與對(duì)照濾筒比較而做出判斷 所以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中加菌時(shí)機(jī)與方式只要與對(duì)照一致即可 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 50 實(shí)驗(yàn)器材 藥品無(wú)菌檢查最關(guān)鍵的器材是一次性過(guò)濾器 價(jià)格和質(zhì)量影響應(yīng)用 近期主要考慮安全可靠 使用方便 物美價(jià)廉 遠(yuǎn)期應(yīng)進(jìn)一步考慮低殘留 低吸附等 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 51 實(shí)驗(yàn)器材 關(guān)于實(shí)驗(yàn)器材問(wèn)題 我們認(rèn)為引入競(jìng)爭(zhēng) 改進(jìn)設(shè)計(jì) 推廣應(yīng)用 使產(chǎn)量 質(zhì)量和用量穩(wěn)步增長(zhǎng) 成本和價(jià)格下降 使用戶和企業(yè)雙贏 有利于促進(jìn)無(wú)菌檢查方法更加規(guī)范和科學(xué) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 52 2 微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)要點(diǎn) 樣品菌種和實(shí)驗(yàn)用菌液 同無(wú)菌檢查 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)控制菌檢查的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)器材 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 53 首先應(yīng)是合格的樣品 微生物限度檢查樣品 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 54 微生物限度檢查樣品 樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證一般口服制劑驗(yàn)證大腸埃希菌外用制劑驗(yàn)證金葡和銅綠假單胞含藥材原粉 含豆豉 神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗(yàn)證 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 55 抽樣量和檢驗(yàn)量分別單列一項(xiàng) 抽樣量一般抽樣量為檢驗(yàn)用量 2個(gè)以上最小包裝 的3倍 檢驗(yàn)量指供試品一次檢驗(yàn)的用量 一般為10g或10ml 化學(xué)藥膜劑為100cm2 貴重或微量包裝的藥品可酌減 不得少于3g 檢查沙門(mén)菌的供試品其檢驗(yàn)量改為10g或10ml 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按檢驗(yàn)量執(zhí)行 微生物限度檢查樣品 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 56 微生物限度檢查樣品 制劑形式多樣 決定前處理各異難溶固體制劑非水溶性制劑軟膏 油膏栓劑等 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 57 供試液的制備制備供試液所用的乳化劑 分散劑 中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證 在該檢驗(yàn)條件無(wú)抗菌作用 7類供試品供試液的制備 其中增訂 微生物限度檢查樣品前處理 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 58 非水溶性供試品 司盤(pán)80 單硬脂酸甘油酯 聚山梨酯80 供試品10g 20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯和無(wú)菌玻璃珠 必要時(shí)再加適量十四烷酸異丙酯 充分振搖 使供試品溶解 然后加45 100mlpH7 0蛋白胨氯化鈉緩沖液 振搖5 10分鐘 萃取 待油水分層后 取水層作為1 10供試液 微生物限度檢查樣品前處理 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 59 非水溶性膜劑供試品二部未變動(dòng) 化學(xué)藥膜劑取100cm2 剪碎 加100mlpH7 0氯化鈉 蛋白胨緩沖液 浸泡 振搖 作供試液 一部中藥膜劑取50cm2 剪碎 加適量的pH7 0氯化鈉 蛋白胨緩沖溶液 50或100ml 浸泡 振搖 以供試品浸液為供試液 SOP2000版規(guī)定 中藥膜劑取30 50cm2 剪碎 加水100ml 微生物限度檢查樣品前處理 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 60 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品10g 加100mlpH6 8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 腸溶制劑 或pH7 6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 結(jié)腸制劑 于45 水浴振搖 使溶解 微生物限度檢查樣品前處理 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 61 氣霧劑 噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品 置冷凍室冷凍1h 取出 迅速消毒供試品開(kāi)啟部位周圍 用無(wú)菌鋼錐鉆一小孔 放置室溫 并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器 使拋射劑全部拋出 以無(wú)菌注射器吸出全部藥液 按標(biāo)示量加稀釋劑至足量 若含非水溶性成份 加適量無(wú)菌聚山梨酯 80液 使勻 取相當(dāng)于10g或10ml的供試品 再稀釋成1 10的供試液 微生物限度檢查樣品前處理 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 62 具抑菌活性的供試品供試品接種至較大量的培養(yǎng)基中 1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿 控制菌檢查 可加大增菌培養(yǎng)基的用量 或采用薄膜過(guò)濾法 離心集菌法薄膜過(guò)濾法 微生物限度檢查樣品前處理 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 63 微生物限度檢查樣品前處理 很有用處的低速離心法 500r minX5min 阿奇霉素緩釋干混懸劑紅霉素片 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 64 微生物限度檢查樣品前處理 制劑形式多樣 決定前處理各異目標(biāo)是使不便于取樣的供試品分散均勻 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 65 微生物限度檢查法驗(yàn)證 細(xì)菌 霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證定量 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)控制菌檢查方法驗(yàn)證定性 能否生長(zhǎng) 專屬性實(shí)驗(yàn) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 66 在建立供試品的細(xì)菌 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性 應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證 驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn) 以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 67 驗(yàn)證用菌株大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 白色念株菌 黑曲霉 菌液制備 同無(wú)菌檢查法 取培養(yǎng)物用無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成1ml含50 100cfu的菌液 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 68 驗(yàn)證方法試驗(yàn)組取規(guī)定量最低稀釋級(jí)的供試液 加入50 100cfu的菌液 按平板菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)或薄膜過(guò)濾計(jì)數(shù) 菌液組測(cè)定加入的試驗(yàn)菌液的菌數(shù) 供試品對(duì)照組測(cè)定供試品稀釋液 本底 的菌數(shù) 稀釋劑對(duì)照組取稀釋液加入50 100cfu的菌液 按供試品組供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù) 驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)獨(dú)立平行進(jìn)行3次 分別計(jì)算各次試驗(yàn)菌的回收率 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 69 回收率計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率 試驗(yàn)組平均菌落數(shù) 供試品對(duì)照組平均菌落數(shù) 菌液組平均菌落數(shù) 100 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率 稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù) 菌液組的平均菌落數(shù) 100 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 70 結(jié)果判斷稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)大于70 若試驗(yàn)組的菌回收率均大于70 符合驗(yàn)證試驗(yàn) 可按此方法測(cè)定細(xì)菌 霉菌及酵母菌數(shù) 若任一次平行試驗(yàn)中供試品組的菌回收率均小于70 不符合驗(yàn)證試驗(yàn) 應(yīng)建立新的檢驗(yàn)方法 并重新驗(yàn)證 驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 71 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 常規(guī)法 平皿法 薄膜過(guò)濾法 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 72 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 常規(guī)法 平皿法 在采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí) 應(yīng)注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 73 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 常規(guī)法 平皿法 稀釋法 0 5ml 皿 0 2ml 皿 每一平皿均應(yīng)加1ml菌液 培養(yǎng)基稀釋的表示 1 200 1 400 1 1000 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 74 回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) 薄膜過(guò)濾法菌液檢驗(yàn) 計(jì)數(shù) 應(yīng)與供試液同法處理 也要采用薄膜過(guò)濾法 2020 1 29 中國(guó)藥品生物制品檢定所 75 在建立供試品的控制菌檢查法或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性 應(yīng)對(duì)檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證 驗(yàn)證時(shí)做規(guī)定菌的回收試驗(yàn) 以判斷供試品是否具有抗菌活性的實(shí)驗(yàn)方法 控制菌檢查方法驗(yàn)證 20