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拮抗劑 antagonist 通常是指能抵抗激動(dòng)劑作用的藥物 拮抗劑與激動(dòng)劑作用于同一受體分子 呈競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 pA2 代表由功能實(shí)驗(yàn)獲得的可逆性競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的pKd值 使激動(dòng)劑EC50增大1倍所需的拮抗劑的濃度 以其10為底的負(fù)對(duì)數(shù)值表示 KB與pKB 與pA2一樣 代表由功能實(shí)驗(yàn)獲得的可逆性競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的pKd值 與pA2的差別只是在作Schild作圖時(shí)假設(shè)斜率為1 0 競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑與受體的親和性通常采用Schild作圖法求得原理 在一定濃度競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑存在下 激動(dòng)劑的濃度 效應(yīng)曲線平行右移 拮抗劑的親和性越高 右移越多 方法 1 pA2通常采用3個(gè)以上濃度的拮抗劑 Schild方程為lg dr 1 lg B lgKB dr 相應(yīng)濃度拮抗劑 B 存在時(shí)濃度 效應(yīng)曲線的EC50值與對(duì)照濃度 效應(yīng)曲線的EC50值的比值 也稱為劑量比 doseratio 以拮抗劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo) 以相應(yīng)濃度拮抗劑的劑量比 1的對(duì)數(shù)值 lg dr 1 為縱坐標(biāo) 得一直線 其與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)即為代表該拮抗劑親和性的pA2值 Schild方程 lg dr 1 lg B lgKB 如果拮抗劑與受體僅有單一位點(diǎn)的結(jié)合 斜率應(yīng)為1 0 此時(shí)僅需用一種拮抗劑濃度 即能得到上述直線 由此方法到的拮抗劑親和性稱KB B為所用拮抗劑的濃度 dr的意義同上 2 pKB B KB dr 1 放射配體結(jié)合測(cè)定法 Radioligandbindingassay 利用受體與配體特異性結(jié)合的特性 將被研究受體的特異性配體標(biāo)記上同位素 放射性配體與組織 細(xì)胞膜 細(xì)胞漿 或細(xì)胞一起溫育 然后采用一定的方法將與受體結(jié)合的放射性配體與游離的放射性配體分離 根據(jù)放射性配體與受體結(jié)合的情況來判斷受體的數(shù)量 親和性等 最常用的兩種方法是Scatchard分析與競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn) 飽和實(shí)驗(yàn)與Scatchard分析 采用不同濃度的放射配體 6 12個(gè)濃度 與組織或細(xì)胞在有受體拮抗劑存在 非特異性結(jié)合管 和無拮抗劑存在 總結(jié)合管 條件下溫育一定時(shí)間 分離與受體結(jié)合的放射性配體 特異性結(jié)合量用mol mg蛋白 特異結(jié)合位點(diǎn) 細(xì)胞表示 受體放射配體結(jié)合測(cè)定計(jì)算公式 L R Kd LR Bmax R LR R YX L Y LR X Bmax Y Kd Y 理想狀態(tài)下的非線性回歸 B 最大結(jié)合容量 fmol mg蛋白 蛋白濃度 mg ml 所用蛋白體積 ml 比放射性 dpm fmol 衰變系數(shù) 計(jì)數(shù)效率 K1 K2 Bmax y 結(jié)合受體量 fmol 比放射性 dpm fmol 衰變系數(shù) 計(jì)數(shù)效率 K2 x 有效配體濃度 fmol ml 配體體積 ml 比放射性 dpm fmol 衰變系數(shù) 計(jì)數(shù)效率 K2 X K3 Y 一種濃度的放射性配體及多種濃度的未標(biāo)記配體 14 16種濃度 與組織或細(xì)胞在一定條件下溫育 分離與受體結(jié)合的放射性配體 未標(biāo)記配體與放射性配體競(jìng)爭(zhēng)性與受體結(jié)合 未標(biāo)記配體的濃度越大 與受體結(jié)合的放射性配體的量越少 依此可得競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合曲線 競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)合實(shí)驗(yàn) 受體與競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的親和性受體亞型分析計(jì)算受體的Bmax和Kd值 0 OneSiteCompetative Curve a 1B AR 10 0 7 5 5 0 2 5 50 100 150 Legend lg BMY mol L SpecificBinding a 1B AR 6 5 4 2 1 0 1 2 Legend lgB lgB Bmax B Hill作圖BMY7378 OneSiteCompetative Curve a 1B AR 10 9 8 7 6 5 4 0 50 100 Legend lg 5 MU mol L SpecificBinding a 1B AR 5 0 4 5 4 0 2 1 0 1 2 Legend logB lgB Bmax B Hill作圖5 MU 受體與競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的親和性 Hill作圖 與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)代表50 受體被非標(biāo)記配體結(jié)合時(shí) 所需非標(biāo)記配體的濃度 即其IC50 免疫學(xué)方法 受體的分離 純化受體的探測(cè) 定位 定量 幾乎所有生命科學(xué)研究方法都可以用于研究受體藥理學(xué)功能分析 受體產(chǎn)生效應(yīng)為指標(biāo)放射配體結(jié)合法 特異結(jié)合為指標(biāo)放射配體結(jié)合法 結(jié)合活性免疫方法 受體抗原分子 Contents MoleculestructureDimerizationInteractionmolecuesTrafficking compartmentsGeneticmodlesDrugselectionDiseasetechnologies 思考題2藥理學(xué)功能分析和放射配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)艿玫侥切┲笜?biāo) 這些指標(biāo)的含義是什么 請(qǐng)你設(shè)計(jì)一個(gè)與受體研究