




已閱讀5頁,還剩18頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
病理學(xué)常用研究方法,主講人:王恩華,1,2,3,一、免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化問題探討,本世紀(jì)70年代問世抗體種類急速增加,交叉反應(yīng)存在免疫組化技術(shù)方法不斷問世使用的試劑或?qū)嶒?yàn)室條件不同操作人員的熟練程度病理醫(yī)生的結(jié)果判定水平及關(guān)聯(lián)知識(shí)解決標(biāo)準(zhǔn)化的問題勢在必行,4,(一)方法的選擇,目前常用的免疫組化方法有:PAP、ABC、APAAP法、S-P方法等各種方法只要運(yùn)用得好,都會(huì)得到滿意的結(jié)果建議:在我們省內(nèi)都采用S-P法,5,S-P法的優(yōu)點(diǎn) 方法統(tǒng)一 有配套的即用型抗體、試劑盒和顯色試劑盒 一般2-3小時(shí)(30-60),而ABC法需1天,分 子量小(60KD),穿透力強(qiáng) 靈敏性高,特異性強(qiáng),4個(gè)亞基都能于二抗上的生 物素結(jié)合,而且結(jié)合鍵強(qiáng) 背景低,非特異性反應(yīng)少,等電點(diǎn)為6.5,接近于 中性,不與內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)結(jié)合,而ABC法為10,6,S-P法與ABC法的區(qū)別,S-P法:Streptaridin peroxidase conjugataed method 鏈霉菌素抗生物素蛋白過氧化物酶連接法ABC法: Avidin-Biotin peroxidase complex method 卵白素親生物素過氧化酶復(fù)合物法,S-P法中的鏈霉菌素抗生物素蛋白取代了ABC方法中的卵白 素和生物素即:卵白素中的4個(gè)亞基一方面與第二抗體上的生物素結(jié) 合,另一方面還與復(fù)合物中的生物素結(jié)合,7,ABC法:,S-P法:,8,(二) 固定、包埋,固定液:一般10%中性緩沖福爾馬林,PH7.3-7.4(PBS配制)固定時(shí)間:應(yīng)少于24小時(shí),固定時(shí)間越長,抗原丟失越多固定液量或組織塊大?。航M織為1/3,固定液2/3大體標(biāo)本:切下一塊固定,9,包埋:起初免疫組化對蠟溫的要求很嚴(yán),溫度一高會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果?,F(xiàn)在由于抗體質(zhì)量的提高,以及抗原恢復(fù)方法的問世,多數(shù)人又忽視了蠟溫的問題。個(gè)人認(rèn)為:盡管有抗原修復(fù)方法,但不如開始就不使抗原破壞,另外,蠟溫過高,組織變脆,不易切成大片,容易脫片。因此,要控制蠟溫在65以下,10,(三) 抗原修復(fù)(抗原暴露、抗原復(fù)原),組織中存在某種抗原、但用特異性抗體,卻為陰性其原因是:固定、包埋后部分抗原決定簇與核酸或其它蛋白抗原發(fā)生了交聯(lián),形成網(wǎng)絡(luò)固定液中的醛基本身也會(huì)發(fā)生交聯(lián),而封閉抗原,11,抗原修復(fù)的目的:就是要打開交聯(lián),暴露抗原決定簇,有利于抗原抗體反應(yīng),抗原修復(fù)的方法從大的方面講有兩種:,12,熱修復(fù): 0.01M檸檬酸緩沖液,PH=6.0,95,10分鐘注意:脫片多多聚L賴氨酸 干片 選醫(yī)用微波爐酶消化:1.細(xì)胞內(nèi)抗原0.1%胰蛋白酶 2037 2.間質(zhì)抗原4%胃蛋白酶37,4-8小時(shí),13,(八)免疫組織化學(xué)的發(fā)展,1. 免疫PCR:主要用于臨床生物分子檢測方面 血清(Ag)電泳+Ab+無關(guān)引物擴(kuò)增顯色 意義:1. 原來較弱、水平較低的酶等,用免疫PCR就可以檢測出來 2. 需要較長或一定時(shí)間才能查出來用免疫PCR法,就可提前查出來如:病毒性心肌炎、血腫CPK檢測 心梗早期心肌酶譜的檢測等,心梗預(yù)報(bào):心絞痛一般認(rèn)為沒有酶 譜改變,設(shè)想用免疫PCR就可能發(fā)現(xiàn)改變,14,2. 原位免疫PCR在組織切片上有定位 Ag+Ab1+Ab2卵白素洗凈生物素標(biāo)記的DNA片斷洗凈原位PCR擴(kuò)增洗凈ACB或S-P顯色 特點(diǎn):提高陽性率 定位好,15,2. 擴(kuò)增:,Total: 25l PCR buffer 2.5l mixed dNTP 2.0l dH2O 16.375l primer 1 1.0l primer 2 1.0l Taq 0.125l DNA template 2.0l94 25” 55 25” 72 40” 30 cycles,16,3. Agarose 2-5%,用1TBE電泳 擴(kuò)增后液 5l + 1l loading buffer 溴化乙淀染色 20,UV照射下確認(rèn)泳帶照相,4. DNA收集 RECOCHIP法,17,三、Western Blotting,1. 提取蛋白 500l的hypotonic buffer + 組織2mm3勻漿器粉碎 冰上放置30 15000轉(zhuǎn)/分,4,30。上清:細(xì)胞質(zhì)蛋白,+250l 3loading buffer沉淀物 + 750l loading buffer再次粉碎、離心,上清為細(xì)胞膜蛋白 2-氫硫基乙醇 7.5l(1/100)混合 95沸騰5分鐘 冰上放置,18,2. 蛋白定量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度制備:BSA,0,0.5,1,2mg/ml 比色:測定系數(shù) 換算成含量 計(jì)算出每個(gè)樣品加樣量3. 電泳 丙烯酰胺 上部膠、下部膠 marker樣品4. 轉(zhuǎn)膜5. 洗膜 一抗、二抗 顯色或自顯影,19,四、組織芯片(Tissue Micro-Array, TMA),組織芯片技術(shù)是一種特殊生物芯片技術(shù),它是將幾十個(gè)或幾百個(gè)不同個(gè)體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究,是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時(shí)對幾百甚至上千種正常或疾病以及疾病發(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本,進(jìn)行某一個(gè)或多個(gè)特定的基因,或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。,20,應(yīng)用免疫組化DNA或RNA原位雜交FISH原位PCR,低密度芯片(50-70個(gè)標(biāo)本)、高密度芯片(500個(gè)標(biāo)本),21,制作過程,1. 組織處理:固定、石蠟包埋、HE染色、組織定位2. 組織打孔/陣列儀鉆取組織,直徑0.6mm3. 制作陣列蠟塊,將鉆取的組織按設(shè)定的位置放入空白蠟塊內(nèi)4. 切片厚度為5m,以40為宜,56烤片3小時(shí),備用,2
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 美國環(huán)評基金管理辦法
- 脫貧人口貸款管理辦法
- 藥品貼身保存管理辦法
- 車間扭矩保證管理辦法
- 西南醫(yī)院進(jìn)修管理辦法
- 西安城市垃圾管理辦法
- 西安購買物資管理辦法
- 西昌學(xué)院食堂管理辦法
- 西藏地市督學(xué)管理辦法
- 西藏財(cái)政付款管理辦法
- 4輸變電工程施工質(zhì)量驗(yàn)收統(tǒng)一表式(電纜工程電氣專業(yè))-2024年版
- 2024年中國心力衰竭診斷和治療指南2024版
- 青海省2024年7月普通高中學(xué)業(yè)水平考試化學(xué)試題含解析
- JJG 693-2011可燃?xì)怏w檢測報(bào)警器
- 口腔工藝管理基教學(xué)課件
- 少兒財(cái)商的培養(yǎng)(課堂)課件
- 混凝土橋面鋪裝施工方案-
- 自卸車司機(jī)培訓(xùn)考試題
- 勾股定理說課稿,勾股定理說課稿范文
- 普工三級安全教育試題及答案
- 常規(guī)公司完稅證明
評論
0/150
提交評論