電化學(xué)生物傳感器：開啟人乳頭瘤病毒精準(zhǔn)檢測新時代

電化學(xué)生物傳感器：開啟人乳頭瘤病毒精準(zhǔn)檢測新時代一、引言1.1研究背景與意義人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）作為一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其感染在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出高流行態(tài)勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2023年9月發(fā)布的數(shù)據(jù)，全球約1/3男性已感染HPV，在全球約40億男性中，有高達13.2億人已感染過HPV，其中高危型HPV感染率為21%，即約8.4億男性感染高危型HPV。而在女性群體中，研究數(shù)據(jù)表明全球范圍內(nèi)宮頸HPV感染率波動在6.1%-33.5%之間，國內(nèi)部分地區(qū)普通人群的HPV感染率在10%-14%之間。HPV主要通過性接觸傳播，也有部分亞型可通過非性接觸途徑，如母嬰傳播、皮膚接觸傳播等。絕大多數(shù)人在一生中的某個階段都可能感染HPV。HPV依據(jù)其致癌性可劃分為高危型（HR-HPV）與低危型（LR-HPV）。高危型HPV的持續(xù)性感染是誘發(fā)宮頸癌及多種生殖道癌癥的主要原因。在中國，69.1%的宮頸癌病例由HPV16和HPV18感染所致，14.7%由HPV31、33、52、58和59引起。低危型HPV則主要引發(fā)各種良性的皮膚或黏膜病變，如扁平疣和尖銳濕疣等。感染HPV后，大多數(shù)為一過性感染，80%的感染者在6-8個月內(nèi)可將病毒清除，但35歲以上感染者中大約有10%-15%為長期感染狀態(tài)，這部分長期感染是影響健康的重要因素。若高危型HPV持續(xù)感染，可能歷經(jīng)10-20年逐漸演變?yōu)榘?。宮頸癌已成為威脅世界女性健康的第四大惡性腫瘤，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例達60.4萬人，死亡34.2萬人，我國近年來宮頸癌發(fā)病率亦呈上升趨勢。除宮頸癌外，HPV感染還與肛門癌、陰莖癌等多種惡性腫瘤以及尖銳濕等良性病變相關(guān)，嚴重威脅著人類的健康。鑒于HPV感染帶來的嚴重危害，對其進行準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測顯得尤為重要。及時檢測出HPV感染，能夠幫助患者盡早采取干預(yù)措施，對于一過性感染可通過增強免疫力等方式促進病毒清除；對于持續(xù)性感染，可及時進行治療，阻止病情進展為癌癥，從而降低相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率，提高患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的HPV檢測方法，如細胞學(xué)檢測、雜交捕獲法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等，雖然在臨床診斷中發(fā)揮了重要作用，但它們存在一定的局限性。細胞學(xué)檢測依賴于細胞形態(tài)學(xué)的觀察，對操作人員的經(jīng)驗要求較高，且存在一定的誤診率和漏診率；雜交捕獲法靈敏度有限，無法檢測出低水平的HPV感染；PCR技術(shù)雖然靈敏度高，但操作復(fù)雜、耗時較長，需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，且容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，同時檢測成本也較高，在資源有限的地區(qū)難以廣泛應(yīng)用。電化學(xué)生物傳感器作為一種新型的檢測技術(shù)，在HPV檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。它以生物分子識別為基礎(chǔ)，將生物識別過程轉(zhuǎn)化為可測量的電信號，具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、操作簡便、成本低等特點。電化學(xué)生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對HPV的快速檢測，滿足臨床對檢測時效性的需求；其高靈敏度使其能夠檢測出極低濃度的HPV，有助于早期診斷；而且操作簡便，無需復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，便于在基層醫(yī)療機構(gòu)推廣應(yīng)用。因此，電化學(xué)生物傳感器為HPV檢測提供了一種新的解決方案，有望革新HPV檢測的方式，對HPV相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重要的變革意義，在臨床診斷和公共衛(wèi)生領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。1.2人乳頭瘤病毒概述1.2.1HPV結(jié)構(gòu)與分類人乳頭瘤病毒（HPV）屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，無包膜，直徑在45-55nm之間。HPV病毒主要由蛋白衣殼和核心單拷貝的病毒基因組DNA構(gòu)成，其中蛋白衣殼由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成，L1蛋白約占衣殼蛋白總量的80%，它高度保守，在病毒組裝和感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠自我組裝成病毒樣顆粒（Virus-LikeParticles，VLP），這些VLP與天然病毒顆粒具有相同的抗原表位，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和保護性抗體，但不含有病毒DNA，不具備感染性和致病性；L2蛋白則相對可變，在病毒進入宿主細胞等過程中起重要作用。HPV基因組約由7800-7900個堿基對（bp）組成，根據(jù)其功能可分為三個編碼區(qū)：早期區(qū)（Earlygene，E）包含E1、E2、E4、E5、E6和E7共6個基因，全長約4500bp，主要參與病毒基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及細胞轉(zhuǎn)化過程；晚期區(qū)（Lategene，L）含有L1和L2兩個基因，長度約為2500bp，主要負責(zé)編碼病毒的衣殼蛋白；上游調(diào)節(jié)區(qū)（Upstreamregulatoryregion，URR），又稱為長控制區(qū)（Longcontrolregion，LCR）或非編碼區(qū)，位于L1基因和E6基因之間，含有多個結(jié)合位點和調(diào)控元件，如啟動子等，對病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起著重要的調(diào)控作用。依據(jù)HPV的致癌性，可將其分為高危型（HR-HPV）和低危型（LR-HPV）。目前已知的HPV型別有200多種，其中高危型HPV約有18種，常見的包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59等。高危型HPV的E6和E7蛋白能夠與宿主細胞內(nèi)的抑癌基因產(chǎn)物p53和Rb結(jié)合，導(dǎo)致細胞周期調(diào)控異常，促進細胞增殖和轉(zhuǎn)化，從而引發(fā)癌癥。在中國，69.1%的宮頸癌病例由HPV16和HPV18感染所致，這兩種型別是導(dǎo)致宮頸癌的主要“元兇”，其中HPV16多見于宮頸鱗癌，HPV18多見于宮頸腺癌。此外，HPV16、HPV18等高危型HPV還與肛門癌、陰莖癌、口咽癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。低危型HPV常見的有HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等，主要引起各種良性的皮膚或黏膜病變，如扁平疣、尖銳濕疣等，其中HPV6和HPV11與90%的尖銳濕疣病例相關(guān)。低危型HPV雖然一般不會引發(fā)癌癥，但會影響患者的生活質(zhì)量，如尖銳濕疣會在外生殖器、肛門周圍等部位出現(xiàn)乳頭狀、菜花狀、雞冠狀贅生物，且具有傳染性，可通過性生活途徑傳播。1.2.2HPV感染現(xiàn)狀與危害HPV感染在全球范圍內(nèi)極為普遍，呈現(xiàn)出高流行態(tài)勢。世界衛(wèi)生組織（WHO）2023年9月發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球約1/3男性已感染HPV，在全球約40億男性中，有高達13.2億人已感染過HPV，其中高危型HPV感染率為21%，即約8.4億男性感染高危型HPV。在女性群體中，全球范圍內(nèi)宮頸HPV感染率波動在6.1%-33.5%之間，國內(nèi)部分地區(qū)普通人群的HPV感染率在10%-14%之間。HPV主要通過性接觸傳播，性行為活躍的人群感染風(fēng)險較高，初次性行為年齡越小、性伴侶越多，感染HPV的幾率就越大。也有部分亞型可通過非性接觸途徑傳播，如母嬰傳播，母親在分娩過程中，若攜帶HPV，可能將病毒傳染給新生兒；皮膚接觸傳播，如接觸被HPV污染的物品，像毛巾、浴巾、馬桶座圈等，也可能感染HPV。絕大多數(shù)人在一生中的某個階段都可能感染HPV。HPV感染帶來的危害不容小覷。低危型HPV感染主要導(dǎo)致各種良性病變，如扁平疣好發(fā)于青少年的面部、手背及前臂等部位，表現(xiàn)為米粒至黃豆大小的扁平丘疹，表面光滑，境界清楚，可因搔抓而自體接種，沿抓痕呈串珠狀排列；尖銳濕疣則是一種常見的性傳播疾病，主要發(fā)生在外生殖器及肛門周圍皮膚黏膜濕潤區(qū)，初起為淡紅色小丘疹，后逐漸增大增多，形成乳頭狀、菜花狀或雞冠狀贅生物，質(zhì)地柔軟，表面濕潤，易出血，患者常伴有瘙癢、灼痛等不適癥狀，不僅影響患者的身體健康，還會對患者的心理造成較大壓力，同時增加了其他性傳播疾病感染的風(fēng)險。高危型HPV的持續(xù)性感染是引發(fā)多種惡性腫瘤的重要原因。宮頸癌是HPV感染導(dǎo)致的最常見惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例達60.4萬人，死亡34.2萬人，已成為威脅世界女性健康的第四大惡性腫瘤，我國近年來宮頸癌發(fā)病率亦呈上升趨勢。除宮頸癌外，高危型HPV感染還與肛門癌、陰莖癌、陰道癌、外陰癌、口咽癌等多種癌癥相關(guān)。例如，在肛門癌患者中，HPV16、HPV18等高危型HPV的感染率較高；在陰莖癌患者中，也有相當(dāng)比例是由高危型HPV持續(xù)感染引起。高危型HPV感染引發(fā)癌癥的過程通常較為漫長，從感染到發(fā)展為癌前病變，再到浸潤癌，可能需要經(jīng)歷10-20年的時間。在這個過程中，若能早期檢測出HPV感染，并及時采取干預(yù)措施，如增強免疫力、進行抗病毒治療等，可有效阻止病情進展，降低癌癥的發(fā)生風(fēng)險。因此，早檢測、早干預(yù)對于HPV感染的防治至關(guān)重要，能夠極大地改善患者的預(yù)后，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.3電化學(xué)生物傳感器簡介電化學(xué)生物傳感器是一類將生物識別元件與電化學(xué)換能器相結(jié)合的分析檢測裝置，它能夠利用生物分子之間的特異性相互作用，將生物識別事件轉(zhuǎn)化為可測量的電信號，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的定性或定量分析。其工作原理基于生物分子識別和電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換兩個關(guān)鍵過程。在生物分子識別過程中，生物識別元件，如酶、抗體、核酸、細胞等，能夠特異性地識別目標(biāo)分析物，形成生物識別復(fù)合物。例如，在檢測HPV時，若采用核酸作為生物識別元件，HPV的特定DNA序列會與核酸探針通過堿基互補配對原則特異性結(jié)合。隨后，在電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換過程中，這種生物識別事件會引起電極表面的電化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，如電極表面的電荷分布、電子轉(zhuǎn)移速率等改變，基礎(chǔ)電極將這些變化轉(zhuǎn)化為可測量的電信號，如電勢、電流、電阻或電容等。通過檢測這些電信號的變化，并與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進行對比，就可以確定目標(biāo)分析物，即HPV的濃度。電化學(xué)生物傳感器主要由生物識別元件、信號轉(zhuǎn)換器和數(shù)據(jù)分析儀三個部分組成。生物識別元件是傳感器的核心部分，它決定了傳感器的特異性。不同類型的生物識別元件對不同的目標(biāo)分析物具有特異性識別能力，如酶能夠特異性地催化特定的化學(xué)反應(yīng)，抗體能夠與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，核酸探針能夠與互補的核酸序列特異性雜交。在HPV檢測中，常用的生物識別元件有針對HPV特定基因序列的核酸探針，它們可以精準(zhǔn)地識別HPV的DNA。信號轉(zhuǎn)換器則負責(zé)將生物識別過程中產(chǎn)生的生物信號轉(zhuǎn)換為電信號，常見的信號轉(zhuǎn)換器有各類電極，如固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等。例如，在電流型電化學(xué)生物傳感器中，電極通過檢測生物識別反應(yīng)中電活性物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流變化來實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)換；在電位型電化學(xué)生物傳感器中，電極則通過檢測生物識別反應(yīng)過程中產(chǎn)生或消耗的活性物質(zhì)濃度對數(shù)變化引起的電位變化來轉(zhuǎn)換信號。數(shù)據(jù)分析儀用于對信號轉(zhuǎn)換器輸出的電信號進行處理和分析，最終得到目標(biāo)分析物的濃度信息，它可以是計算機、電化學(xué)工作站等設(shè)備。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，電化學(xué)生物傳感器具有諸多顯著優(yōu)勢。首先，它具有高靈敏度，能夠檢測到極低濃度的目標(biāo)分析物。例如，一些基于納米材料修飾電極的電化學(xué)生物傳感器，通過增大電極表面積、提高電子轉(zhuǎn)移速率等方式，可將檢測靈敏度提高到飛摩爾（fM）甚至阿托摩爾（aM）級別，能夠檢測出極微量的HPV。其次，響應(yīng)速度快，生物識別和電信號轉(zhuǎn)換過程在較短時間內(nèi)即可完成，通?？梢栽趲追昼姷綆资昼妰?nèi)給出檢測結(jié)果，滿足臨床快速檢測的需求。再者，操作簡便，不需要復(fù)雜的樣品前處理過程，且儀器設(shè)備相對簡單，易于攜帶和現(xiàn)場檢測，在基層醫(yī)療機構(gòu)或資源有限的地區(qū)也能方便應(yīng)用。此外，電化學(xué)生物傳感器成本較低，不需要昂貴的試劑和設(shè)備，有利于大規(guī)模的篩查和檢測。而且，它還具有良好的選擇性，生物識別元件的特異性使得傳感器能夠準(zhǔn)確地區(qū)分目標(biāo)分析物與其他干擾物質(zhì)，減少檢測誤差。電化學(xué)生物傳感器憑借這些優(yōu)勢，在生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，尤其是在HPV檢測方面，為實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測提供了有力的技術(shù)支持。二、電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的原理與技術(shù)2.1基本原理2.1.1生物識別元件與HPV的特異性結(jié)合電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的核心基礎(chǔ)是生物識別元件與HPV之間的特異性結(jié)合，這種特異性結(jié)合是實現(xiàn)準(zhǔn)確檢測的關(guān)鍵。生物識別元件種類繁多，在HPV檢測中，常用的主要有DNA探針和抗體等。DNA探針是一段特定的DNA序列，其設(shè)計基于HPV的獨特基因序列。由于DNA分子遵循嚴格的堿基互補配對原則，即腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）配對，使得DNA探針能夠與HPV的靶標(biāo)DNA序列特異性雜交。例如，針對HPV16型的檢測，研究人員會設(shè)計一段與HPV16型病毒基因組中某段特征序列互補的DNA探針。當(dāng)將含有該DNA探針的電化學(xué)生物傳感器與待檢測樣本接觸時，若樣本中存在HPV16型病毒，其DNA序列就會與DNA探針通過堿基互補配對緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。這種特異性結(jié)合就如同鑰匙與鎖的關(guān)系，只有特定的HPVDNA序列才能與對應(yīng)的DNA探針準(zhǔn)確匹配，從而實現(xiàn)對HPV的特異性識別。抗體也是一類重要的生物識別元件?？贵w是由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫球蛋白，能夠特異性地識別并結(jié)合抗原。在HPV檢測中，利用HPV病毒的衣殼蛋白L1或L2等作為抗原，免疫動物（如小鼠、兔子等），使其產(chǎn)生針對HPV的特異性抗體。這些抗體具有高度的特異性，能夠與HPV表面的抗原決定簇精準(zhǔn)結(jié)合。以HPV6型和HPV11型為例，針對這兩種低危型HPV制備的抗體，能夠特異性地識別并結(jié)合HPV6型和HPV11型病毒顆粒表面的抗原表位，而對其他型別的HPV以及樣本中的其他雜質(zhì)幾乎沒有結(jié)合能力。這種特異性結(jié)合使得抗體能夠在復(fù)雜的樣本中準(zhǔn)確地捕獲目標(biāo)HPV，為后續(xù)的檢測提供了基礎(chǔ)。無論是DNA探針還是抗體，它們與HPV的特異性結(jié)合都具有高度的選擇性和親和力。這種特異性結(jié)合不僅能夠準(zhǔn)確地區(qū)分不同型別的HPV，還能有效避免其他非目標(biāo)物質(zhì)的干擾，確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實際檢測過程中，生物識別元件與HPV的特異性結(jié)合是一個快速而高效的過程，能夠在較短時間內(nèi)完成，為電化學(xué)生物傳感器實現(xiàn)快速檢測HPV提供了保障。2.1.2電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換機制電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換機制，它負責(zé)將生物識別元件與HPV特異性結(jié)合的生物識別事件轉(zhuǎn)化為可測量的電信號，從而實現(xiàn)對HPV的檢測和定量分析。在電化學(xué)生物傳感器中，常見的電化學(xué)信號包括電流、電位和阻抗等，這些信號的產(chǎn)生和變化與HPV的檢測密切相關(guān)。在電流型電化學(xué)生物傳感器中，其信號轉(zhuǎn)換機制基于電活性物質(zhì)在電極表面的氧化還原反應(yīng)。當(dāng)生物識別元件與HPV特異性結(jié)合后，會引發(fā)電極表面的電化學(xué)反應(yīng)。例如，在一些基于酶標(biāo)記的電流型傳感器中，若以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體作為生物識別元件，HRP能夠催化底物（如過氧化氫，H_2O_2）發(fā)生氧化還原反應(yīng)。在有HPV存在的情況下，抗體與HPV結(jié)合形成免疫復(fù)合物，該復(fù)合物會靠近電極表面。此時，電極表面的HRP催化H_2O_2發(fā)生還原反應(yīng)，H_2O_2+2e^-\longrightarrow2OH^-，產(chǎn)生的電子會通過電極傳遞，從而形成可測量的電流信號。電流的大小與HPV的濃度呈正相關(guān)，通過檢測電流的變化，就可以定量分析樣本中HPV的含量。電位型電化學(xué)生物傳感器則主要依據(jù)能斯特方程來實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)換。能斯特方程表明，電極電位與溶液中參與電化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系。在檢測HPV時，當(dāng)生物識別元件與HPV特異性結(jié)合后，會導(dǎo)致電極表面附近溶液中離子濃度發(fā)生變化。例如，基于離子選擇性電極的電位型傳感器，若在檢測過程中，生物識別反應(yīng)導(dǎo)致電極表面附近氫離子（H^+）濃度改變，根據(jù)能斯特方程E=E^0+\frac{RT}{nF}\ln\frac{[氧化態(tài)]}{[還原態(tài)]}（對于H^+參與的反應(yīng)，可簡化為E=E^0+\frac{2.303RT}{nF}\lg[H^+]），電極電位會相應(yīng)發(fā)生變化。通過測量電極電位的變化，就可以間接反映出HPV的存在及其濃度信息。阻抗型電化學(xué)生物傳感器的信號轉(zhuǎn)換機制基于電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻和界面電容的變化。當(dāng)生物識別元件與HPV特異性結(jié)合后，會改變電極表面的電荷分布和電子轉(zhuǎn)移速率，進而導(dǎo)致電極的阻抗發(fā)生變化。例如，在基于納米材料修飾電極的阻抗型傳感器中，若將納米金修飾在電極表面，納米金具有良好的導(dǎo)電性和較大的比表面積，能夠促進電子轉(zhuǎn)移。當(dāng)HPV與生物識別元件（如DNA探針）結(jié)合后，會在電極表面形成一層生物膜，這層生物膜會阻礙電子的轉(zhuǎn)移，使得電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻增大，同時界面電容也會發(fā)生改變。通過測量電極阻抗的變化，就可以實現(xiàn)對HPV的檢測。在實際檢測中，通常采用電化學(xué)阻抗譜（EIS）技術(shù)，通過測量不同頻率下電極的阻抗，得到阻抗隨頻率變化的曲線，從曲線中提取電荷轉(zhuǎn)移電阻等參數(shù)，從而分析HPV的濃度。電化學(xué)生物傳感器的電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換機制是一個復(fù)雜而精密的過程，它將生物識別事件轉(zhuǎn)化為可測量的電信號，為HPV的檢測提供了可靠的技術(shù)手段。不同類型的電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換機制各有特點，在實際應(yīng)用中，可以根據(jù)檢測需求和樣本特性選擇合適的電化學(xué)生物傳感器類型，以實現(xiàn)對HPV的準(zhǔn)確、快速檢測。2.2關(guān)鍵技術(shù)與材料2.2.1電極材料的選擇與修飾電極材料作為電化學(xué)生物傳感器的關(guān)鍵組成部分，其性能直接影響著傳感器的檢測靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性。在HPV檢測中，常見的電極材料主要包括碳基電極、金屬電極和半導(dǎo)體電極等，它們各自具有獨特的性能特點。碳基電極，如玻碳電極（GCE）、碳糊電極（CPE）和絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE）等，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、導(dǎo)電性以及較低的背景電流。其中，玻碳電極表面光滑、易修飾，能夠通過物理或化學(xué)方法在其表面引入各種功能基團，從而實現(xiàn)對生物分子的固定和檢測；碳糊電極制備簡單，成本較低，可根據(jù)實際需求靈活調(diào)整電極組成，但其重現(xiàn)性相對較差；絲網(wǎng)印刷碳電極則具有易于大規(guī)模生產(chǎn)、成本低、可一次性使用等優(yōu)點，適合于現(xiàn)場快速檢測。例如，在一項研究中，采用絲網(wǎng)印刷碳電極構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感器用于HPV16的檢測，通過在電極表面修飾特定的DNA探針，實現(xiàn)了對HPV16的快速、靈敏檢測，檢測限低至1.0×10?12mol/L。金屬電極，如金電極（AuE）、銀電極（AgE）和鉑電極（PtE）等，具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和良好的生物相容性。金電極因其表面容易形成自組裝膜，能夠穩(wěn)定地固定生物分子，在電化學(xué)生物傳感器中應(yīng)用廣泛。例如，利用金硫鍵的特異性結(jié)合作用，可將帶有巰基的DNA探針或抗體固定在金電極表面，用于HPV的檢測。銀電極在某些情況下具有獨特的電化學(xué)性質(zhì)，可用于特定的檢測體系；鉑電極則常用于電催化反應(yīng)，能夠加速電活性物質(zhì)的氧化還原過程，提高檢測靈敏度。半導(dǎo)體電極，如氧化鋅（ZnO）、二氧化鈦（TiO?）等，具有較高的電子遷移率和催化活性。ZnO納米材料由于其獨特的納米結(jié)構(gòu)和電學(xué)性能，能夠增強電極與生物分子之間的相互作用，提高傳感器的性能。例如，將ZnO納米棒修飾在電極表面，構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器用于HPV檢測時，能夠顯著提高檢測的靈敏度和選擇性，其檢測原理是ZnO納米棒增大了電極的比表面積，促進了電子轉(zhuǎn)移，同時與生物識別元件之間的協(xié)同作用增強了對HPV的捕獲能力。為了進一步提升電極的性能，常常需要對電極進行修飾。修飾方法多種多樣，其中納米材料修飾是一種常用且有效的手段。納米材料具有尺寸小、比表面積大、表面活性高等特點，能夠顯著改善電極的性能。例如，納米金（AuNPs）具有良好的生物相容性和導(dǎo)電性，將其修飾在電極表面，不僅可以增大電極的有效表面積，促進生物分子的固定，還能加速電子轉(zhuǎn)移，提高檢測靈敏度。在檢測HPV的電化學(xué)生物傳感器中，通過在玻碳電極表面修飾納米金，再固定DNA探針，使得傳感器對HPV的檢測限降低了一個數(shù)量級。碳納米管（CNTs）也是一種常用的納米修飾材料，它具有優(yōu)異的電學(xué)性能和機械性能，能夠增強電極的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性。將碳納米管與電極復(fù)合，可制備出高性能的電化學(xué)生物傳感器，用于HPV檢測時，能夠?qū)崿F(xiàn)對低濃度HPV的快速檢測。自組裝膜修飾也是一種重要的電極修飾方法。自組裝膜是由分子通過自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)在固體表面形成的有序分子層，它能夠精確地控制電極表面的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，提高電極的選擇性和穩(wěn)定性。例如，利用硫醇類化合物在金電極表面形成自組裝單分子層（SAMs），可以有效地固定生物識別元件，減少非特異性吸附。在檢測HPV時，先在金電極表面形成6-巰基己醇（MCH）的自組裝膜，封閉電極表面的非特異性位點，再固定DNA探針，能夠顯著提高傳感器的特異性，降低背景信號。此外，還可以通過層層自組裝技術(shù)，將不同的功能分子或納米材料逐層組裝在電極表面，構(gòu)建具有復(fù)雜功能的修飾電極，進一步優(yōu)化電化學(xué)生物傳感器的性能，以滿足對HPV檢測的高要求。2.2.2信號放大技術(shù)在電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的過程中，由于目標(biāo)HPV的含量往往較低，直接檢測得到的電信號可能較弱，難以滿足準(zhǔn)確檢測的需求。因此，信號放大技術(shù)成為提高電化學(xué)生物傳感器檢測靈敏度的關(guān)鍵手段。常見的信號放大技術(shù)主要包括酶催化放大、核酸擴增放大和納米材料放大等，它們各自基于不同的原理，在HPV檢測中發(fā)揮著重要作用。酶催化放大技術(shù)是利用酶的高效催化活性，通過催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的電活性產(chǎn)物，從而實現(xiàn)信號的放大。在檢測HPV時，常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）等。以HRP為例，它能夠催化過氧化氫（H_2O_2）和電子供體（如對苯二胺，p-PD）之間的氧化還原反應(yīng)。在有HPV存在的情況下，生物識別元件（如抗體或DNA探針）與HPV特異性結(jié)合，形成免疫復(fù)合物或雜交復(fù)合物，該復(fù)合物會靠近電極表面。此時，電極表面標(biāo)記的HRP催化H_2O_2氧化p-PD，p-PD+H_2O_2\stackrel{HRP}{\longrightarrow}p-苯醌二亞胺+2H_2O，產(chǎn)生的p-苯醌二亞胺是電活性物質(zhì)，在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生可測量的電流信號。由于一個HRP分子能夠催化大量的底物反應(yīng)，從而使電流信號得到顯著放大，大大提高了檢測的靈敏度。例如，在一項基于酶催化放大的電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的研究中，通過將HRP標(biāo)記的抗體與HPV特異性結(jié)合，利用HRP對H_2O_2和p-PD的催化反應(yīng)，實現(xiàn)了對HPV的高靈敏檢測，檢測限達到了1.0×10?1?mol/L。核酸擴增放大技術(shù)是借助核酸擴增反應(yīng)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、滾環(huán)擴增（RCA）等，將HPV的核酸序列進行大量擴增，從而增加檢測信號。PCR是一種經(jīng)典的核酸擴增技術(shù)，它以HPV的DNA為模板，在引物、脫氧核糖核苷酸（dNTPs）和DNA聚合酶等的作用下，通過變性、退火和延伸三個步驟的循環(huán)，使目標(biāo)DNA序列呈指數(shù)級擴增。擴增后的DNA產(chǎn)物可以通過多種方式進行檢測，如在電極表面固定互補的DNA探針，利用雜交反應(yīng)產(chǎn)生電信號，由于擴增后的DNA數(shù)量大幅增加，雜交反應(yīng)產(chǎn)生的電信號也相應(yīng)增強，實現(xiàn)了信號的放大。RCA則是一種等溫擴增技術(shù)，它以環(huán)形DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，從引物開始沿著環(huán)形模板不斷延伸，形成一條包含多個重復(fù)序列的長鏈DNA。這種長鏈DNA可以與電極表面的探針雜交，產(chǎn)生更強的電信號。例如，利用RCA技術(shù)結(jié)合電化學(xué)生物傳感器檢測HPV時，通過設(shè)計特異性的環(huán)形探針與HPV的DNA雜交，引發(fā)RCA反應(yīng)，擴增后的產(chǎn)物與電極表面的捕獲探針雜交，產(chǎn)生的電化學(xué)信號比未擴增時增強了數(shù)倍，有效提高了檢測的靈敏度。納米材料放大技術(shù)是利用納米材料的特殊性質(zhì)，如大比表面積、高導(dǎo)電性、良好的催化活性等，來增強電化學(xué)生物傳感器的信號。納米材料可以作為信號標(biāo)簽、載體或催化劑，參與到檢測過程中，實現(xiàn)信號的放大。例如，金納米粒子（AuNPs）由于其良好的導(dǎo)電性和生物相容性，常被用作信號標(biāo)簽。在檢測HPV時，將AuNPs標(biāo)記在生物識別元件（如抗體或DNA探針）上，當(dāng)生物識別元件與HPV特異性結(jié)合后，大量的AuNPs靠近電極表面，AuNPs能夠促進電子轉(zhuǎn)移，增強電化學(xué)反應(yīng)的速率，從而使電信號得到放大。此外，一些具有催化活性的納米材料，如納米酶，能夠模擬天然酶的催化活性，催化底物發(fā)生反應(yīng)，實現(xiàn)信號放大。例如，納米二氧化錳（MnO_2）具有類似過氧化物酶的活性，在檢測HPV時，將MnO_2修飾在電極表面或與生物識別元件結(jié)合，利用其對H_2O_2的催化分解作用，產(chǎn)生更多的氧氣或其他電活性物質(zhì)，從而增強電信號，提高檢測靈敏度。這些信號放大技術(shù)在電化學(xué)生物傳感器檢測HPV中具有廣泛的應(yīng)用前景。它們能夠顯著提高傳感器的檢測靈敏度，使檢測限降低至極低水平，滿足臨床對HPV早期檢測和微量檢測的需求。同時，多種信號放大技術(shù)還可以相互結(jié)合，形成更高效的信號放大策略，進一步提升電化學(xué)生物傳感器的性能，為HPV的準(zhǔn)確、快速檢測提供有力的技術(shù)支持。三、電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的應(yīng)用實例分析3.1基于納米材料的電化學(xué)生物傳感器納米材料由于其獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，如高比表面積、良好的導(dǎo)電性、強催化活性和量子尺寸效應(yīng)等，在電化學(xué)生物傳感器中得到了廣泛應(yīng)用，顯著提升了傳感器的性能。以下將詳細介紹兩種基于納米材料的電化學(xué)生物傳感器在HPV檢測中的應(yīng)用。3.1.1納米氧化鋅/鋯有機金屬骨架復(fù)合物傳感器納米氧化鋅（ZnO）具有優(yōu)異的電學(xué)性能、高催化活性和良好的生物相容性，而鋯有機金屬骨架（Zr-MOF）則擁有大比表面積、高孔隙率和可調(diào)控的結(jié)構(gòu)，將兩者復(fù)合形成的納米氧化鋅/鋯有機金屬骨架復(fù)合物，兼具了兩者的優(yōu)勢，為HPV檢測提供了更優(yōu)越的平臺。復(fù)合物的制備過程通常采用溶劑熱法。以制備用于檢測HPV-16的納米氧化鋅/鋯有機金屬骨架復(fù)合物為例，首先稱取一定量的六水合硝酸鋅（Zn(NO_3)_2·6H_2O）和對苯二甲酸（BDC）溶解于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲使其充分溶解，形成均勻的溶液A。同時，稱取適量的氯氧化鋯（ZrOCl_2·8H_2O）溶解于DMF中，得到溶液B。將溶液B緩慢滴加到溶液A中，在攪拌條件下混合均勻，然后將混合液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，在一定溫度（如120℃）下反應(yīng)數(shù)小時（如12h）。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，通過離心分離得到沉淀，用DMF和乙醇多次洗滌沉淀，以去除雜質(zhì)，最后在真空干燥箱中干燥，即可得到納米氧化鋅/鋯有機金屬骨架復(fù)合物。在構(gòu)建傳感器時，首先對玻碳電極（GCE）進行預(yù)處理，將其在0.05μm的氧化鋁拋光粉上拋光至鏡面，然后依次用硝酸、無水乙醇和去離子水超聲清洗，以去除電極表面的雜質(zhì)和氧化物，使其表面清潔且具有良好的電化學(xué)活性。將制備好的納米氧化鋅/鋯有機金屬骨架復(fù)合物分散在適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ鏝afion溶液）中，超聲分散形成均勻的懸浮液。取一定量的懸浮液滴涂在預(yù)處理后的玻碳電極表面，在室溫下晾干，使復(fù)合物牢固地附著在電極表面，形成修飾電極GCE/ZnO-Zr-MOF。接著，將含有巰基的捕獲DNA探針通過金硫鍵自組裝的方式固定在修飾電極表面，由于復(fù)合物的大比表面積和良好的生物相容性，能夠促進DNA探針的固定，提高固定量和穩(wěn)定性。固定好DNA探針后，用6-巰基己醇（MCH）封閉電極表面的非特異性位點，以減少非特異性吸附，提高傳感器的特異性。該傳感器對HPV-16的檢測性能優(yōu)異。在檢測過程中，當(dāng)含有HPV-16的樣本與傳感器接觸時，HPV-16的DNA會與固定在電極表面的捕獲DNA探針通過堿基互補配對原則特異性雜交，形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。由于納米氧化鋅的高導(dǎo)電性和鋯有機金屬骨架的大比表面積，能夠加速電子轉(zhuǎn)移，增強電化學(xué)反應(yīng)的信號。通過電化學(xué)阻抗譜（EIS）技術(shù)檢測雜交前后電極阻抗的變化，發(fā)現(xiàn)隨著HPV-16濃度的增加，電極表面的電荷轉(zhuǎn)移電阻增大，阻抗值顯著增加，且阻抗變化值與HPV-16的濃度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。實驗結(jié)果表明，該傳感器對HPV-16的檢測限低至1.0×10?12mol/L，線性范圍為1.0×10?12-1.0×10??mol/L。此外，該傳感器還具有良好的選擇性，對其他型別的HPV以及樣本中的常見干擾物質(zhì)幾乎沒有響應(yīng)，能夠準(zhǔn)確地檢測出HPV-16。同時，其重復(fù)性和穩(wěn)定性也較好，經(jīng)過多次重復(fù)檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，在4℃保存數(shù)周后，仍能保持較好的檢測性能。3.1.2銀納米團簇修飾的電化學(xué)DNA生物傳感器銀納米團簇（AgNCs）具有獨特的光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)，如尺寸小、熒光特性良好、表面活性高以及優(yōu)異的電子傳導(dǎo)能力，將其修飾在電化學(xué)DNA生物傳感器上，能夠有效提高傳感器的檢測靈敏度和選擇性，為HPV-16的檢測提供了一種新穎的方法。傳感器的制備步驟較為精細。首先，對玻碳電極（GCE）進行預(yù)處理，將其在麂皮上用0.3μm和0.05μm的氧化鋁拋光粉依次拋光，使其表面光滑平整，然后在硝酸溶液（1:1，v/v）中超聲清洗5min，以去除表面的雜質(zhì)和有機物，接著用無水乙醇和去離子水分別超聲清洗3min，去除殘留的硝酸，最后在氮氣氛圍下吹干備用。采用恒電位沉積法在預(yù)處理后的玻碳電極表面修飾納米金（Au），將玻碳電極作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉑電極作為對電極，構(gòu)成三電極體系插入含有0.1mol/L氯化鉀（KCl）和1mmol/L氯金酸（HAuCl_4）的溶液中，在-0.2V的電位下沉積500s，使納米金均勻地沉積在電極表面，得到修飾電極GCE/Au。納米金的修飾能夠增大電極的有效表面積，促進電子轉(zhuǎn)移，同時為后續(xù)生物分子的固定提供良好的基底。取8μL含有巰基的脫氧核糖核酸1（DNA1）溶液（濃度為1μmol/L）滴加到GCE/Au表面，室溫避光反應(yīng)12h，DNA1通過金硫鍵與納米金牢固結(jié)合，形成GCE/Au/DNA1修飾電極。DNA1的序列設(shè)計為與HPV-16的特定基因序列互補，具有高度的特異性。用超純水沖洗掉多余的DNA1，以去除未結(jié)合的DNA1，避免對后續(xù)檢測產(chǎn)生干擾。取8μL6-巰基己醇（MCH）溶液（濃度為1mmol/L）滴加到GCE/Au/DNA1電極表面，反應(yīng)30min，MCH能夠封閉電極表面的非特異性位點，減少非特異性吸附，提高傳感器的特異性。用超純水沖洗掉多余的MCH，得到GCE/Au/DNA1/MCH修飾電極。以脫氧核糖核酸2（DNA2）為模板合成銀納米團簇（DNA2-AgNCs）。取10μLDNA2（濃度為1μmol/L）于離心管中，并在離心管中加入10μL3-(N-嗎啡啉)-丙磺酸（MOPS，10mmol/L，pH=7.8），2.5μL硝酸銀溶液（濃度為10mmol/L），混合均勻，反應(yīng)30min，使銀離子與DNA2充分結(jié)合。然后加入2.5μL硼氫化鈉溶液（濃度為10mmol/L），反應(yīng)30min，硼氫化鈉將銀離子還原為銀原子，在DNA2的模板作用下，銀原子逐漸聚集形成銀納米團簇，得到DNA2-AgNCs。取8μLDNA2-AgNCs溶液滴加到GCE/Au/DNA1/MCH電極表面，由于DNA1與DNA2可發(fā)生雜交反應(yīng)，DNA2-AgNCs可以與DNA1特異性結(jié)合，1h后，用超純水沖洗電極表面，去除未結(jié)合的DNA2-AgNCs，得到最終的修飾電極GCE/Au/DNA1/MCH/DNA2-AgNCs。該傳感器檢測HPV-16的原理基于DNA鏈置換反應(yīng)和銀納米團簇的電化學(xué)信號放大作用。當(dāng)加入HPV-16時，由于HPV-16與DNA1的堿基互補對數(shù)多于DNA1與DNA2-AgNCs的，于是引發(fā)了DNA鏈置換反應(yīng)，HPV-16將DNA2-AgNCs從電極表面置換出來。在檢測過程中，采用電化學(xué)阻抗法（EIS）進行檢測，將修飾好的電極作為工作電極、以甘汞電極作為參比電極，鉑電極作為對電極，構(gòu)成三電極體系插入含有5mmol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀（[Fe(CN)_6]^{3-/4-}）的溶液中。當(dāng)DNA2-AgNCs結(jié)合在DNA1上時，由于銀納米團簇具有良好的導(dǎo)電性，可促進電子轉(zhuǎn)移，使得電化學(xué)阻抗（EIS）響應(yīng)明顯減?。划?dāng)HPV-16置換出DNA2-AgNCs后，電極表面的電子傳遞受阻，EIS響應(yīng)信號便增大。通過測定阻抗值的變化來檢測HPV-16的濃度。該傳感器對HPV-16的檢測性能出色。實驗結(jié)果表明，其檢測限低至5.0×10?13mol/L，線性范圍為5.0×10?13-1.0×10??mol/L。在選擇性方面，對其他型別的HPV以及常見的干擾物質(zhì)如牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖、氯化鈉等幾乎沒有響應(yīng)，能夠準(zhǔn)確地檢測出HPV-16。重復(fù)性實驗中，對同一濃度的HPV-16進行6次重復(fù)檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3%，表明該傳感器具有良好的重復(fù)性。在穩(wěn)定性方面，將傳感器在4℃保存4周后，其檢測性能基本保持不變，仍能準(zhǔn)確檢測HPV-16。3.2基于電化學(xué)發(fā)光的生物傳感器3.2.1基于Zr-MOF的比率電化學(xué)發(fā)光傳感器在眾多用于HPV檢測的電化學(xué)生物傳感器中，基于Zr-MOF（鋯基金屬有機骨架）的比率電化學(xué)發(fā)光傳感器展現(xiàn)出獨特的性能優(yōu)勢，為HPV-16的檢測提供了一種高靈敏度和高選擇性的方法。該傳感器的核心在于合成具有特殊結(jié)構(gòu)和性能的Zr-DPA@TCPP發(fā)光體，其合成過程基于有機配體與金屬節(jié)點的自組裝原理。以9，10-二(對羧基苯基)蒽（DPA）和5，10，15，20-四(4-羧基苯基)卟啉（TCPP）為有機配體，以Zr簇為金屬節(jié)點，通過自組裝有效地合成了具有核殼結(jié)構(gòu)的化合物（Zr-DPA@TCPP）。在合成過程中，將適量的DPA、TCPP與含Zr簇的溶液在特定條件下混合，如在一定的溫度、溶劑環(huán)境中充分反應(yīng)。DPA和TCPP分子中的羧基與Zr簇通過配位鍵相互作用，逐漸自組裝形成具有核殼結(jié)構(gòu)的Zr-DPA@TCPP。這種結(jié)構(gòu)使得Zr-DPA@TCPP在分辨電勢下具有雙發(fā)射電化學(xué)發(fā)光（ECL）特性，即能夠同時產(chǎn)生陽極和陰極ECL信號。將具有ECL性質(zhì)的兩個有機配體DPA和TCPP合理地整合到單個單體中，Zr-DPA@TCPP成功地表現(xiàn)出同步的陽極和陰極ECL信號。由于二茂鐵（Fc）具有獨特的性質(zhì)，可以猝滅陽極ECL，但不會影響陰極ECL信號，因此利用陰極信號作為內(nèi)部參考，巧妙地設(shè)計了比率型ECL生物傳感器。在構(gòu)建傳感器時，先對玻碳電極（GCE）進行預(yù)處理，使其表面具有良好的電化學(xué)活性。然后將Zr-DPA@TCPP修飾在玻碳電極表面，通過物理吸附或化學(xué)結(jié)合的方式固定。為了進一步提高傳感器的性能，還可以在Zr-DPA@TCPP修飾電極表面修飾金納米粒子（AuNPs），AuNPs具有良好的導(dǎo)電性和大比表面積，能夠促進電子轉(zhuǎn)移，增強傳感器的信號響應(yīng)。將帶有二茂鐵（Fc）的捕獲探針固定在電極表面，F(xiàn)c能夠猝滅Zr-DPA@TCPP的陽極ECL信號。當(dāng)加入HPV-16DNA時，其與捕獲探針發(fā)生特異性雜交反應(yīng)，導(dǎo)致Fc與Zr-DPA@TCPP的距離改變，從而影響陽極ECL信號，而陰極ECL信號不受影響。通過檢測陽極ECL信號與陰極ECL信號的比值變化，實現(xiàn)對HPV-16DNA的靈敏檢測。該傳感器對HPV-16的檢測性能優(yōu)異。結(jié)合DNA循環(huán)擴增反應(yīng)，實現(xiàn)了對HPV-16DNA的超靈敏檢測，其線性范圍為1fM-100pM，檢測限（LOD）低至596aM。在選擇性方面，對其他型別的HPV以及常見的干擾物質(zhì)如牛血清白蛋白（BSA）、葡萄糖等幾乎沒有交叉反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確地檢測出HPV-16。重復(fù)性實驗中，對同一濃度的HPV-16進行多次檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，表明該傳感器具有良好的重復(fù)性。在穩(wěn)定性方面，將傳感器在4℃保存數(shù)周后，其檢測性能基本保持不變，仍能準(zhǔn)確檢測HPV-16。基于Zr-MOF的比率電化學(xué)發(fā)光傳感器憑借其高靈敏度、良好的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為HPV-16的檢測提供了一種可靠的技術(shù)手段，在臨床診斷和疾病防控中具有重要的應(yīng)用潛力。3.2.2基于表面靜電相互作用的電化學(xué)發(fā)光傳感器基于表面靜電相互作用的電化學(xué)發(fā)光傳感器為HPV-16的檢測提供了一種創(chuàng)新的思路，其獨特的構(gòu)建方案和檢測原理使其在HPV檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的性能。該傳感器的構(gòu)建基于帶負電荷的信號分子與修飾電極表面的長鏈和短鏈DNA相互作用的差異。將短單股捕獲探針（CP）首先修飾在僅帶少量負電荷的金電極表面。帶負電荷的三(2,2’-聯(lián)吡啶)氯化釕(II)六水合SiO?納米粒子（Ru@SiO?NPs）與CP之間的靜電相互作用較弱，因此Ru@SiO?NPs容易擴散到電極表面產(chǎn)生強ECL信號。在實際樣品中，癌基因濃度較低，為了放大目標(biāo)引起的電極界面電荷的變化，達到信號放大的效果，在均相溶液中預(yù)先制備雜化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）擴增產(chǎn)物（長鏈dsDNA）。當(dāng)目標(biāo)HPV-16存在時，其DNA與短單股捕獲探針（CP）雜交，引發(fā)HCR反應(yīng)，使長鏈dsDNA連接在電極表面，導(dǎo)致電極表面負電荷顯著增強。由于靜電作用和空間位阻，Ru@SiO?NPs難以擴散到電極表面，從而使ECL信號顯著降低。通過檢測ECL信號的變化，即可實現(xiàn)對HPV-16的檢測。該傳感器檢測HPV-16的性能表現(xiàn)出色。在最佳條件下，ECL信號的下降與HPV-16濃度的對數(shù)呈線性相關(guān)，檢測范圍為0.1fM-5pM，檢測限低至1.41aM。在選擇性方面，對其他型別的HPV以及常見的干擾物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等具有良好的抗干擾能力，能夠準(zhǔn)確地檢測出HPV-16。重復(fù)性實驗中，對同一濃度的HPV-16進行多次檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3%，表明該傳感器具有良好的重復(fù)性。在穩(wěn)定性方面，將傳感器在4℃保存一段時間后，其檢測性能依然穩(wěn)定，能夠滿足實際檢測的需求?；诒砻骒o電相互作用的電化學(xué)發(fā)光傳感器利用獨特的靜電相互作用和信號放大機制，實現(xiàn)了對HPV-16的高靈敏、高選擇性檢測，為HPV的早期診斷和疾病防控提供了有力的技術(shù)支持，在臨床檢測和生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。3.3用于HPV癌蛋白檢測的電化學(xué)傳感器人乳頭瘤病毒16型（HPV16）的E6癌蛋白在HPV相關(guān)癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，對其進行準(zhǔn)確檢測對于宮頸癌等疾病的早期診斷和病情評估具有重要意義。以用于HPV16型E6癌蛋白檢測的電化學(xué)傳感器為例，其制備過程涉及多種材料的合成與組裝，通過一系列精細的步驟構(gòu)建出高靈敏度和高特異性的檢測平臺。該電化學(xué)傳感器的制備方法較為復(fù)雜。首先是合成樹枝狀三元納米粒子PdBPNSs，向5mL9mg/mL的DODAC溶液中加入500μL0.337M的NH?F、500μL0.101M的H?BO?和800μL8.5M的Na?PdCl?，在400rpm磁力攪拌5min后，向混合溶液中加入400μL10wt％NH??H?O持續(xù)攪拌至溶液變?yōu)闊o色。接著加入500μL2.5mg的NaH?PO?，將得到的混合溶液置于硅油浴中95℃加熱20min后，滴加500μLDMAB，繼續(xù)加熱30min。反應(yīng)結(jié)束后，在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，去除上清收集沉淀，再在相同離心條件下分別用超純水、無水乙醇和超純水各清洗一次，最后通過冷凍干燥處理得到PdBP粉末。然后是合成介孔二氧化硅MSN，將一定量的正硅酸乙酯（TEOS）緩慢滴加到含有模板劑（如十六烷基三甲基溴化銨，CTAB）的堿性水溶液中，在一定溫度（如60℃）下攪拌反應(yīng)數(shù)小時（如6h）。反應(yīng)完成后，通過離心或過濾分離出沉淀，用乙醇多次洗滌，以去除雜質(zhì)和未反應(yīng)的物質(zhì)。再將沉淀在高溫（如550℃）下煅燒，去除模板劑，得到介孔二氧化硅MSN。合成信號標(biāo)簽時，通常采用生物分子標(biāo)記的方法。例如，將具有特異性識別E6癌蛋白能力的抗體與具有電化學(xué)活性的物質(zhì)（如辣根過氧化物酶，HRP）進行偶聯(lián)。具體步驟為，先將抗體和HRP分別用交聯(lián)劑（如戊二醛）進行活化，然后在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中混合，在一定溫度（如4℃）下反應(yīng)過夜，使抗體與HRP通過共價鍵結(jié)合，形成信號標(biāo)簽。反應(yīng)結(jié)束后，通過透析或凝膠過濾等方法去除未結(jié)合的HRP和其他雜質(zhì)，得到純化的信號標(biāo)簽。在建立電化學(xué)生物傳感器時，首先對玻碳電極（GCE）進行預(yù)處理，將其在0.05μm的氧化鋁拋光粉上拋光至鏡面，然后依次用硝酸、無水乙醇和去離子水超聲清洗，以去除電極表面的雜質(zhì)和氧化物，使其表面清潔且具有良好的電化學(xué)活性。將合成的樹枝狀三元納米粒子PdBPNSs修飾在玻碳電極表面，可采用滴涂法或電沉積法等。以滴涂法為例，將PdBPNSs分散在適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ鏝afion溶液）中，超聲分散形成均勻的懸浮液。取一定量的懸浮液滴涂在預(yù)處理后的玻碳電極表面，在室溫下晾干，使PdBPNSs牢固地附著在電極表面，形成修飾電極GCE/PdBPNSs。接著，將合成的介孔二氧化硅MSN修飾在GCE/PdBPNSs電極表面，同樣采用滴涂法，將MSN分散液滴涂在電極表面并晾干，得到GCE/PdBPNSs/MSN修飾電極。由于MSN具有大比表面積和豐富的孔道結(jié)構(gòu)，能夠增加生物分子的負載量。將制備好的信號標(biāo)簽固定在GCE/PdBPNSs/MSN電極表面，利用抗體與E6癌蛋白的特異性結(jié)合作用，實現(xiàn)對E6癌蛋白的特異性識別。該傳感器對HPV16型E6癌蛋白的檢測性能優(yōu)異。在檢測過程中，當(dāng)含有E6癌蛋白的樣本與傳感器接觸時，E6癌蛋白會與固定在電極表面的抗體特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。由于信號標(biāo)簽中的HRP具有催化活性，能夠催化底物（如過氧化氫，H_2O_2）發(fā)生氧化還原反應(yīng)，H_2O_2+2e^-\longrightarrow2OH^-，產(chǎn)生的電子會通過電極傳遞，從而形成可測量的電流信號。電流的大小與E6癌蛋白的濃度呈正相關(guān)，通過檢測電流的變化，就可以定量分析樣本中E6癌蛋白的含量。實驗結(jié)果表明，該傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測，操作簡單，不需要額外的專業(yè)技術(shù)人員。其線性范圍較寬，能夠檢測不同濃度水平的E6癌蛋白，檢測限低，可檢測到極低濃度的E6癌蛋白，有效解決了現(xiàn)有檢測E6癌蛋白方法中存在的操作相對復(fù)雜、設(shè)備昂貴、需要專業(yè)技術(shù)人員等問題。在重復(fù)性方面，對同一濃度的E6癌蛋白進行多次檢測，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，表明該傳感器具有良好的重復(fù)性。在穩(wěn)定性方面，將傳感器在4℃保存數(shù)周后，其檢測性能基本保持不變，仍能準(zhǔn)確檢測E6癌蛋白。在特異性方面，對其他非目標(biāo)蛋白以及樣本中的常見干擾物質(zhì)幾乎沒有響應(yīng)，能夠準(zhǔn)確地檢測出E6癌蛋白。四、電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)4.1優(yōu)勢電化學(xué)生物傳感器在檢測HPV方面具有諸多顯著優(yōu)勢，這些優(yōu)勢使其在臨床診斷和疾病防控領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。操作簡便性是電化學(xué)生物傳感器的一大突出優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的HPV檢測方法，如細胞學(xué)檢測需要專業(yè)人員在顯微鏡下仔細觀察細胞形態(tài)，操作過程繁瑣且對操作人員的經(jīng)驗要求極高；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)不僅需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員進行復(fù)雜的操作，還涉及多個實驗步驟，如核酸提取、擴增、檢測等，操作流程復(fù)雜，且容易受到污染導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確相比，電化學(xué)生物傳感器的操作流程大大簡化。它不需要復(fù)雜的樣品前處理過程，通常只需將樣品直接滴加到傳感器表面，即可進行檢測。例如，基于納米材料修飾電極的電化學(xué)生物傳感器，在檢測HPV時，只需將含有HPV的樣本滴加到修飾好的電極表面，通過簡單的電化學(xué)測量儀器，如電化學(xué)工作站，就可以快速檢測出樣本中是否存在HPV以及其濃度信息，整個操作過程簡單易懂，即使是沒有專業(yè)背景的人員，經(jīng)過簡單培訓(xùn)也能熟練操作。成本低是電化學(xué)生物傳感器的另一重要優(yōu)勢。傳統(tǒng)的HPV檢測方法，如雜交捕獲法需要使用昂貴的試劑和設(shè)備，檢測成本較高，這在一定程度上限制了其在大規(guī)模篩查中的應(yīng)用；而PCR技術(shù)雖然靈敏度高，但試劑成本、設(shè)備維護成本以及對專業(yè)技術(shù)人員的要求，都使得檢測成本居高不下。電化學(xué)生物傳感器則不同，其所需的儀器設(shè)備相對簡單，價格較為親民，如常見的電化學(xué)工作站價格相對較低，且部分電化學(xué)生物傳感器還可以實現(xiàn)一次性使用，避免了儀器的重復(fù)使用和維護成本。此外，電化學(xué)生物傳感器的檢測試劑成本也較低，例如一些基于DNA探針的電化學(xué)生物傳感器，DNA探針的合成成本相對較低，且用量較少，這使得電化學(xué)生物傳感器的整體檢測成本大幅降低，有利于在資源有限的地區(qū)和大規(guī)模篩查中推廣應(yīng)用。電化學(xué)生物傳感器還具有靈敏度高的優(yōu)勢。由于其獨特的信號轉(zhuǎn)換機制和生物識別元件的特異性結(jié)合，能夠檢測到極低濃度的HPV。例如，基于納米材料的電化學(xué)生物傳感器，通過納米材料的修飾，增大了電極的比表面積，提高了電子轉(zhuǎn)移速率，從而大大提高了傳感器的靈敏度。一些基于納米氧化鋅/鋯有機金屬骨架復(fù)合物的電化學(xué)生物傳感器，對HPV-16的檢測限低至1.0×10?12mol/L，能夠檢測出極微量的HPV，這對于HPV的早期診斷具有重要意義，能夠在病毒感染的早期階段及時發(fā)現(xiàn)，為患者的治療爭取寶貴的時間。檢測快速也是電化學(xué)生物傳感器的顯著特點。生物識別和電信號轉(zhuǎn)換過程在較短時間內(nèi)即可完成，通?？梢栽趲追昼姷綆资昼妰?nèi)給出檢測結(jié)果。以基于電化學(xué)發(fā)光的生物傳感器為例，在檢測HPV時，從樣品加入到檢測出結(jié)果，整個過程可能只需要15-30分鐘，遠遠快于傳統(tǒng)檢測方法，如PCR技術(shù)通常需要數(shù)小時才能完成檢測。這種快速檢測的特性，能夠滿足臨床對檢測時效性的需求，尤其是在急診、疫情防控等場景下，能夠快速為醫(yī)生提供診斷依據(jù)，及時采取治療措施。電化學(xué)生物傳感器還具有良好的選擇性。生物識別元件，如DNA探針、抗體等，與HPV的特異性結(jié)合使得傳感器能夠準(zhǔn)確地區(qū)分目標(biāo)HPV與其他干擾物質(zhì)，減少檢測誤差。例如，針對HPV16型設(shè)計的DNA探針，能夠特異性地識別HPV16型的DNA序列，而對其他型別的HPV以及樣本中的雜質(zhì)幾乎沒有結(jié)合能力，從而確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.2面臨的挑戰(zhàn)4.2.1傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性問題電化學(xué)生物傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性是影響其實際應(yīng)用的重要因素。在實際檢測HPV的過程中，傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性面臨著諸多挑戰(zhàn)。從電極材料的角度來看，電極表面的修飾層在長期使用過程中可能會發(fā)生脫落、降解等現(xiàn)象，從而影響生物識別元件的固定和電信號的傳導(dǎo)。例如，在基于納米材料修飾電極的電化學(xué)生物傳感器中，納米材料與電極之間的結(jié)合力可能不夠穩(wěn)定，在檢測過程中，受到溶液的沖刷、化學(xué)反應(yīng)等因素影響，納米材料容易從電極表面脫落，導(dǎo)致傳感器性能下降。以納米金修飾的電極為例，納米金顆粒在長期使用后可能會發(fā)生團聚，改變電極表面的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，使得生物識別元件的固定量減少，從而降低傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。生物識別元件的穩(wěn)定性也是一個關(guān)鍵問題。DNA探針和抗體等生物識別元件在保存和使用過程中，可能會受到溫度、濕度、pH值等環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致其活性降低或失活。例如，DNA探針在高溫、高濕度的環(huán)境下，可能會發(fā)生變性，使得其與HPV的特異性結(jié)合能力下降；抗體則可能會受到酸堿度的影響，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而失去對HPV的識別能力。在檢測過程中，每次檢測的條件難以完全一致，也會導(dǎo)致傳感器的重復(fù)性較差。例如，溶液的離子強度、溫度、檢測時間等因素的微小變化，都可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。在實際操作中，很難保證每次檢測時溶液的離子強度完全相同，而離子強度的變化會影響電極表面的電荷分布和電化學(xué)反應(yīng)速率，進而影響電信號的大小和穩(wěn)定性。為了解決這些問題，需要從多個方面入手。在電極材料的選擇和修飾方面，應(yīng)研發(fā)更加穩(wěn)定的修飾方法和材料，增強修飾層與電極之間的結(jié)合力。例如，采用化學(xué)鍵合的方式將納米材料固定在電極表面，提高納米材料的穩(wěn)定性。對于生物識別元件，應(yīng)優(yōu)化其保存條件，采用合適的保護劑，如在DNA探針溶液中添加適量的甘油、EDTA等保護劑，提高其穩(wěn)定性；同時，在檢測前，對生物識別元件進行嚴格的質(zhì)量控制，確保其活性和特異性。在檢測過程中，應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，嚴格控制檢測條件，如使用恒溫裝置控制溶液溫度，采用精確的移液器控制溶液體積，減少檢測條件的波動對檢測結(jié)果的影響。還可以通過數(shù)據(jù)處理方法，如多次測量取平均值、采用統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行分析等，提高傳感器的重復(fù)性和穩(wěn)定性。4.2.2復(fù)雜樣本檢測的干擾問題在實際檢測HPV時，樣本往往較為復(fù)雜，包含多種成分，這些成分可能會對電化學(xué)生物傳感器的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，影響檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。樣本中的蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子是常見的干擾物質(zhì)。例如，樣本中的蛋白質(zhì)可能會非特異性地吸附在電極表面，阻礙生物識別元件與HPV的特異性結(jié)合，同時也會影響電極表面的電化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致電信號的背景噪聲增大，從而降低檢測的靈敏度和選擇性。在檢測HPV的電化學(xué)生物傳感器中，若樣本中存在牛血清白蛋白（BSA），BSA可能會在電極表面形成一層蛋白膜，干擾DNA探針與HPVDNA的雜交反應(yīng)，使得檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。樣本中的核酸雜質(zhì)，如其他病毒的DNA、RNA，以及宿主細胞的核酸等，也可能與生物識別元件發(fā)生非特異性雜交，產(chǎn)生假陽性信號，影響對HPV的準(zhǔn)確檢測。樣本中的小分子物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸、維生素等，也可能對檢測產(chǎn)生干擾。這些小分子物質(zhì)可能會參與電極表面的電化學(xué)反應(yīng)，改變電極的電位或電流響應(yīng)，從而干擾對HPV的檢測。例如，葡萄糖在某些電極表面可能會發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生額外的電流信號，掩蓋了HPV檢測的真實信號，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)誤差。樣本的物理性質(zhì)，如pH值、離子強度、粘度等，也會對電化學(xué)生物傳感器的性能產(chǎn)生影響。pH值的變化會影響生物識別元件的活性和穩(wěn)定性，以及電化學(xué)反應(yīng)的速率和方向。例如，在基于抗體的電化學(xué)生物傳感器中，抗體的活性在不同的pH值下可能會發(fā)生改變，當(dāng)pH值偏離抗體的最適活性范圍時，抗體與HPV的結(jié)合能力下降，影響檢測結(jié)果。離子強度的變化會影響電極表面的電荷分布和電子轉(zhuǎn)移速率，從而影響電信號的大小和穩(wěn)定性。樣本粘度的增加則可能會阻礙生物識別元件與HPV的擴散和結(jié)合，降低檢測的靈敏度。為了克服復(fù)雜樣本檢測的干擾問題，需要采取一系列抗干擾策略。在樣本預(yù)處理方面，可以采用離心、過濾、核酸提取等方法，去除樣本中的雜質(zhì)，減少干擾物質(zhì)的影響。例如，通過離心去除樣本中的細胞碎片和蛋白質(zhì)沉淀，利用核酸提取試劑盒提取樣本中的核酸，可有效減少蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)對HPV檢測的干擾。在傳感器設(shè)計方面，可以優(yōu)化電極表面的修飾，提高其抗干擾能力。例如，在電極表面修飾一層抗干擾膜，如聚電解質(zhì)膜、分子印跡聚合物膜等，這些膜可以選擇性地阻擋干擾物質(zhì)，同時允許HPV和生物識別元件通過，從而提高傳感器的選擇性。還可以采用多信號檢測技術(shù)，如同時檢測電流、電位和阻抗等多個電化學(xué)信號，利用不同信號對干擾物質(zhì)的響應(yīng)差異，進行數(shù)據(jù)融合和分析，提高檢測的準(zhǔn)確性。通過優(yōu)化檢測條件，如調(diào)整溶液的pH值、離子強度等，使其處于生物識別元件和電化學(xué)反應(yīng)的最佳條件，也可以減少樣本物理性質(zhì)對檢測的干擾。4.2.3臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化與驗證電化學(xué)生物傳感器在HPV檢測的臨床應(yīng)用中，標(biāo)準(zhǔn)化與驗證是確保其檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有至關(guān)重要的意義。標(biāo)準(zhǔn)化是指建立統(tǒng)一的檢測方法、操作流程和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，以保證不同實驗室、不同操作人員在相同條件下得到一致的檢測結(jié)果。在電化學(xué)生物傳感器檢測HPV的過程中，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化會導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異較大，影響臨床診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。例如，不同實驗室使用的電極材料、修飾方法、生物識別元件以及檢測儀器和條件等可能各不相同，這會使得同一HPV樣本在不同實驗室檢測時得到不同的結(jié)果，給臨床診斷帶來困擾。因此，建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測體系十分必要。首先，需要制定統(tǒng)一的樣本采集、處理和保存方法，確保樣本的一致性和穩(wěn)定性。在采集宮頸樣本檢測HPV時，應(yīng)明確規(guī)定采集的部位、方法和采集量，以及樣本采集后的保存條件和時間限制，以減少樣本因素對檢測結(jié)果的影響。其次，要規(guī)范傳感器的制備和檢測流程，包括電極的修飾步驟、生物識別元件的固定方法、檢測儀器的參數(shù)設(shè)置等，使每個實驗室都能按照相同的標(biāo)準(zhǔn)進行操作。還應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量控制體系，定期對傳感器進行校準(zhǔn)和驗證，確保其性能的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。臨床驗證是指將電化學(xué)生物傳感器在臨床實際應(yīng)用中進行測試，評估其在真實臨床樣本中的檢測性能，包括靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性等指標(biāo)。臨床驗證的流程通常包括選擇合適的臨床樣本，如不同年齡段、不同HPV感染狀態(tài)的患者樣本；確定對照樣本，如健康人群樣本或已知HPV感染型別的樣本；按照標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程對樣本進行檢測，并與傳統(tǒng)的HPV檢測方法，如PCR、雜交捕獲法等進行對比分析。通過臨床驗證，可以評估電化學(xué)生物傳感器在臨床應(yīng)用中的可行性和有效性，為其臨床推廣提供依據(jù)。例如，一項針對電化學(xué)生物傳感器檢