犬瘟熱病毒N和H蛋白對IFN-β表達的調控機制探究

犬瘟熱病毒N和H蛋白對IFN-β表達的調控機制探究一、引言1.1研究背景與意義犬瘟熱（CanineDistemper）是一種由犬瘟熱病毒（CanineDistemperVirus，CDV）引起的、具有高度接觸傳染性的疾病，在犬科、鼬科、浣熊科動物中廣泛傳播，被列為三類動物疫病。其致死率較高，成年犬患病死亡率超50%，幼犬更高達90%，且每2-3年就會出現(xiàn)一次流行，給養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)以及野生動物保護帶來了極大的挑戰(zhàn)。比如在一些犬類養(yǎng)殖場中，一旦爆發(fā)犬瘟熱，可能導致大量幼犬死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失；在野生動物保護區(qū)，犬瘟熱病毒的傳播也可能威脅到瀕危野生動物的生存。CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，其病毒粒子主要由核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、基質膜蛋白（M）、融合蛋白（F）和附著蛋白（H）等構成。該病毒主要通過空氣或食物傳播，在侵入機體后，具有較強的復制和擴散能力。它首先在呼吸道淋巴組織內增殖，引發(fā)病毒血癥，進而散布到全身淋巴器官，隨后侵害呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的上皮細胞，還可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視神經(jīng)，導致動物出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸道癥狀、消化道紊亂以及神經(jīng)癥狀等，嚴重時可致死亡。在機體抗病毒免疫過程中，I型干擾素（Interferon，IFN）發(fā)揮著關鍵作用。其中，IFN-β作為I型干擾素的重要成員，是機體抵御病毒感染的第一道防線。當病毒入侵宿主細胞時，宿主細胞的模式識別受體能夠識別病毒的病原相關分子模式，從而啟動一系列信號轉導通路，誘導IFN-β的表達。IFN-β表達后，會與細胞表面的受體結合，激活下游的信號通路，誘導產(chǎn)生一系列抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白能夠抑制病毒的復制和傳播，從而發(fā)揮抗病毒作用。然而，CDV在長期的進化過程中，形成了多種免疫逃逸機制，其中抑制IFN-β的表達是其重要手段之一。研究CDV的免疫抑制機制，尤其是病毒蛋白對IFN-β表達的影響，對于深入了解CDV的致病機制和免疫逃逸策略具有重要的理論意義。在CDV的眾多蛋白中，N蛋白和H蛋白備受關注。N蛋白作為病毒核衣殼的主要成分，不僅在病毒的復制、轉錄以及病毒粒子的組裝過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，還參與病毒與宿主細胞的相互作用，對宿主的免疫反應產(chǎn)生影響。H蛋白則是病毒囊膜表面的糖蛋白，負責病毒與宿主細胞表面受體的結合，是決定病毒感染宿主范圍和致病性的關鍵因素之一，同時也在病毒逃避宿主免疫監(jiān)視方面扮演著重要角色。深入研究犬瘟熱病毒N和H蛋白對IFN-β表達的影響，一方面，能夠從分子層面揭示CDV的致病機制和免疫逃逸機制，為闡明病毒與宿主之間的相互作用關系提供理論依據(jù)，豐富病毒免疫學的研究內容，有助于推動相關領域的理論發(fā)展。另一方面，通過明確N和H蛋白抑制IFN-β表達的具體機制，能夠為開發(fā)針對CDV的新型防治策略提供關鍵靶點。例如，基于對N和H蛋白作用機制的了解，可以研發(fā)能夠阻斷其抑制IFN-β表達的藥物，或者設計新型疫苗，增強機體對CDV的免疫應答，從而提高對犬瘟熱的防控效果，減少其對動物健康和相關產(chǎn)業(yè)的危害，具有重要的實踐意義。1.2犬瘟熱病毒概述犬瘟熱病毒（CanineDistemperVirus，CDV）屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，其病毒粒子呈球形，直徑在150-330nm之間，由核心和包膜兩部分構成。核心包含單股負鏈RNA以及緊密纏繞的核衣殼蛋白（N），這些成分共同構成了病毒的遺傳物質基礎。包膜則來源于宿主細胞膜，其上鑲嵌著由病毒編碼的膜蛋白（M），同時還覆蓋有病毒編碼的糖蛋白，即融合蛋白（F）和附著蛋白（H）。這些蛋白在病毒的感染、復制以及與宿主細胞的相互作用過程中發(fā)揮著關鍵作用。F蛋白在病毒進入宿主細胞時起關鍵作用，它能與宿主細胞表面受體結合，誘導病毒與細胞膜的融合，從而使病毒得以侵入細胞內部。H蛋白則與病毒的致病性密切相關，它不僅能夠誘導宿主細胞產(chǎn)生細胞因子，進而引發(fā)免疫病理反應，還在病毒識別和吸附宿主細胞的過程中扮演重要角色，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。CDV在自然界中分布極為廣泛，其傳播途徑多樣，主要通過空氣或食物傳播?；疾∪蛶Ф救亲钪饕膫魅驹矗《究赏ㄟ^它們的排泄物、分泌物及呼出氣體等向外界排毒，進而污染周圍的場地、飼料和空氣等，導致其他犬只直接或間接被傳染。在犬類養(yǎng)殖場中，由于犬只密集，一旦有感染源存在，病毒就很容易通過空氣飛沫在犬只之間迅速傳播，短時間內就可能造成大量犬只感染。此外，CDV還可通過接觸被污染的器具、衣物等間接傳播。該病毒具有廣泛的宿主范圍，除了犬科動物，如犬、狐貍、狼等，還能感染鼬科動物（如貂、水獺等）和浣熊科動物（如浣熊、小熊貓等）。在不同的宿主中，CDV所引發(fā)的癥狀可能會有所差異，但總體上都對動物的健康構成嚴重威脅。在犬類中，CDV感染可導致嚴重的全身性疾病，涉及多個系統(tǒng)。在呼吸系統(tǒng)方面，病犬可能出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏、流鼻涕等癥狀，嚴重時可發(fā)展為肺炎，導致呼吸困難；在消化系統(tǒng)，常表現(xiàn)為食欲不振、嘔吐、腹瀉，嚴重影響營養(yǎng)吸收，導致病犬迅速消瘦、脫水；在神經(jīng)系統(tǒng)，病毒侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視神經(jīng)，可引發(fā)抽搐、共濟失調、轉圈、癲癇狀驚厥和昏迷等神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)這些癥狀的病犬往往預后不良，即使存活也可能留下永久性的神經(jīng)后遺癥，如舞蹈癥和麻痹等。1.3IFN-β的免疫作用IFN-β作為一種重要的細胞因子，在機體的抗病毒免疫過程中發(fā)揮著核心作用，是機體抵御病毒入侵的關鍵防線。當病毒突破機體的物理屏障，如皮膚、黏膜等，進入宿主細胞后，宿主細胞會迅速啟動抗病毒免疫反應，其中IFN-β的產(chǎn)生和作用至關重要。IFN-β能夠抑制病毒的復制。病毒感染宿主細胞后，會利用宿主細胞的物質和能量進行自身的復制和繁殖。IFN-β通過與細胞表面的特異性受體結合，激活下游的一系列信號通路，誘導產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR）、2'-5'-寡腺苷酸合成酶（2'-5'-OAS）和Mx蛋白等。PKR可以磷酸化真核起始因子eIF2α，從而抑制病毒蛋白的翻譯過程；2'-5'-OAS能夠激活核糖核酸酶L，降解病毒的RNA；Mx蛋白則可以通過與病毒的核酸或蛋白相互作用，抑制病毒的復制和轉錄。這些抗病毒蛋白協(xié)同作用，從多個環(huán)節(jié)干擾病毒的生命周期，有效地抑制病毒在宿主細胞內的復制，減少病毒的數(shù)量，從而降低病毒對機體的損害。IFN-β還能夠調節(jié)免疫細胞的活性，增強機體的免疫應答。在病毒感染初期，IFN-β可以激活自然殺傷細胞（NK細胞），使其殺傷活性顯著增強。NK細胞能夠識別并殺傷被病毒感染的細胞，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質，直接裂解感染細胞，阻止病毒在細胞內的進一步復制和擴散。同時，IFN-β可以促進巨噬細胞的活化，增強其吞噬和消化病原體的能力，使其能夠更有效地清除病毒。巨噬細胞在吞噬病毒后，會將病毒抗原呈遞給T淋巴細胞，啟動適應性免疫應答。IFN-β還可以調節(jié)T淋巴細胞和B淋巴細胞的功能，促進T淋巴細胞的增殖和分化，增強細胞免疫應答；刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，提高體液免疫應答水平，從而全面提升機體對病毒的免疫防御能力。IFN-β還可以通過調節(jié)炎癥反應，在抗病毒免疫中發(fā)揮作用。適度的炎癥反應有助于機體清除病毒，但過度的炎癥反應則會對機體造成損傷。IFN-β可以調節(jié)炎癥因子的表達，抑制過度炎癥反應的發(fā)生。它可以抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等促炎細胞因子的過度產(chǎn)生，減輕炎癥反應對機體組織和器官的損傷，維持機體的內環(huán)境穩(wěn)定，為機體的抗病毒免疫創(chuàng)造有利條件。1.4研究目的與內容本研究旨在深入探究犬瘟熱病毒N和H蛋白對IFN-β表達的影響，從分子層面揭示犬瘟熱病毒的致病機制和免疫逃逸策略，為研發(fā)新型防治措施提供理論依據(jù)和關鍵靶點。具體研究內容包括以下幾個方面：首先，構建犬瘟熱病毒N和H蛋白的真核表達載體，將其轉染至宿主細胞中，使其能夠在細胞內高效表達N和H蛋白。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)，檢測N和H蛋白對IFN-β啟動子活性的影響，明確N和H蛋白是否能夠調控IFN-β的轉錄過程。運用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術，測定細胞內IFN-βmRNA的表達水平，從轉錄水平上驗證N和H蛋白對IFN-β表達的影響，進一步確定二者之間的關系。其次，對N蛋白進行截短突變體構建，通過生物信息學分析確定N蛋白中可能與IFN-β表達調控相關的關鍵區(qū)域，然后設計引物，利用分子生物學技術構建一系列N蛋白截短突變體。同樣采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和RT-qPCR技術，篩選出對IFN-β表達有顯著影響的關鍵氨基酸區(qū)域，深入探究N蛋白抑制IFN-β表達的分子機制，明確N蛋白中發(fā)揮關鍵作用的結構域。最后，研究N和H蛋白對IFN-β相關信號通路的影響。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術，檢測IFN-β信號通路中關鍵分子的磷酸化水平和蛋白表達量的變化，如TBK1、IRF3等，以確定N和H蛋白是否通過干擾IFN-β信號通路來抑制IFN-β的表達。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術，探究N和H蛋白與IFN-β信號通路中關鍵分子之間是否存在相互作用，從分子層面揭示N和H蛋白抑制IFN-β表達的具體作用機制，為深入理解犬瘟熱病毒的免疫逃逸機制提供有力證據(jù)。二、犬瘟熱病毒N和H蛋白結構與功能2.1N蛋白結構與功能犬瘟熱病毒N蛋白由528個氨基酸組成，其分子量約為59kDa。從氨基酸組成來看，N蛋白包含多種不同類型的氨基酸，這些氨基酸通過肽鍵連接形成了具有特定一級結構的多肽鏈。其中，一些氨基酸殘基對于N蛋白的功能至關重要，例如在某些關鍵位點上的氨基酸決定了N蛋白與其他分子的相互作用能力。在空間結構方面，N蛋白具有復雜而有序的結構。通過X射線晶體學技術和其他結構生物學研究方法，發(fā)現(xiàn)N蛋白呈現(xiàn)出獨特的三維構象。其結構可以分為多個結構域，每個結構域都具有特定的功能。N蛋白包含一個RNA結合結構域，該結構域具有特殊的空間構象，能夠與病毒的RNA緊密結合，這對于病毒基因組的包裝和保護起著關鍵作用。N蛋白的結構中還存在一些與其他蛋白相互作用的區(qū)域，這些區(qū)域通過特定的氨基酸殘基和空間構象，與病毒的磷蛋白（P）、大蛋白（L）等相互作用，共同參與病毒的轉錄和復制過程。在病毒基因組包裝過程中，N蛋白發(fā)揮著核心作用。當病毒在宿主細胞內進行復制時，N蛋白會與新合成的病毒RNA結合，將其緊密包裹起來，形成核衣殼結構。這一過程不僅保護了病毒的遺傳物質，使其免受宿主細胞內核酸酶的降解，還為病毒粒子的組裝提供了基礎。N蛋白與RNA的結合具有高度的特異性和親和力，能夠準確地識別病毒RNA，并按照一定的方式進行包裝，確保病毒基因組的完整性和穩(wěn)定性。N蛋白在病毒的轉錄調控中也扮演著重要角色。它與病毒的聚合酶復合物相互作用，促進病毒RNA的轉錄過程。具體來說，N蛋白能夠與P蛋白和L蛋白形成穩(wěn)定的復合物，這種復合物可以識別病毒基因組上的啟動子區(qū)域，并啟動轉錄過程。N蛋白還可以通過與宿主細胞內的一些轉錄因子相互作用，調節(jié)病毒基因的轉錄效率，使其能夠在宿主細胞內高效地表達病毒蛋白，為病毒的復制和傳播提供必要的物質基礎。研究表明，N蛋白的某些氨基酸殘基的突變會影響其與P蛋白和L蛋白的相互作用，進而影響病毒的轉錄效率和毒力，這進一步說明了N蛋白在病毒轉錄調控中的重要性。N蛋白還參與病毒與宿主細胞的相互作用。它能夠與宿主細胞內的一些蛋白相互作用，干擾宿主細胞的正常生理功能，從而為病毒的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白可以與宿主細胞的某些信號通路蛋白相互作用，抑制宿主細胞的抗病毒反應，降低宿主細胞對病毒的敏感性，幫助病毒逃避宿主的免疫監(jiān)視，在犬瘟熱病毒的致病過程中發(fā)揮著重要作用。2.2H蛋白結構與功能犬瘟熱病毒H蛋白是病毒囊膜表面的一種重要糖蛋白，由600個氨基酸組成，其分子量約為83kDa。H蛋白具有典型的糖蛋白結構特征，其肽鏈骨架上連接著多個糖基化位點，這些糖基化修飾對于H蛋白的結構穩(wěn)定性、功能發(fā)揮以及病毒的感染性都具有重要影響。通過對H蛋白的氨基酸序列分析和結構預測，發(fā)現(xiàn)其存在多個潛在的N-糖基化位點，這些位點在不同的CDV毒株中具有一定的保守性。研究表明，糖基化修飾可以保護H蛋白免受宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，增強病毒的免疫逃逸能力。H蛋白的結構中存在一個高度保守的受體結合位點，這一位點對于病毒識別和吸附宿主細胞起著關鍵作用。該受體結合位點具有特定的氨基酸序列和空間構象，能夠與宿主細胞表面的特異性受體緊密結合，從而啟動病毒的感染過程。犬瘟熱病毒H蛋白的受體主要是信號淋巴細胞激活分子（SLAM）和nectin-4。當H蛋白與宿主細胞表面的SLAM或nectin-4結合后，會引發(fā)病毒與宿主細胞膜的一系列相互作用，導致病毒包膜與細胞膜融合，進而使病毒核酸進入宿主細胞內，完成病毒的侵入過程。不同毒株的H蛋白在受體結合位點的氨基酸序列上可能存在細微差異，這些差異會影響H蛋白與受體的結合親和力，進而影響病毒的感染能力和宿主范圍。研究發(fā)現(xiàn)，某些毒株的H蛋白突變會導致其與SLAM的結合能力增強，從而使病毒更容易感染宿主細胞，增加病毒的傳播能力。在病毒感染宿主細胞的過程中，H蛋白發(fā)揮著至關重要的作用。它是病毒與宿主細胞相互作用的第一個關鍵分子，決定了病毒的感染特異性和宿主范圍。H蛋白與宿主細胞受體的結合具有高度的特異性，只有當H蛋白的受體結合位點與宿主細胞表面的相應受體匹配時，病毒才能成功吸附并侵入細胞。這種特異性使得犬瘟熱病毒能夠感染特定的宿主物種和細胞類型，限制了病毒的傳播范圍。H蛋白還參與了病毒的細胞間傳播過程。在感染細胞內，新合成的病毒粒子通過H蛋白與相鄰未感染細胞表面的受體結合，實現(xiàn)病毒從一個細胞到另一個細胞的傳播，從而促進病毒在宿主體內的擴散和感染。H蛋白還在病毒的致病過程中發(fā)揮作用，它可以誘導宿主細胞產(chǎn)生一系列的免疫反應，如細胞因子的釋放等，這些免疫反應在一定程度上會導致宿主細胞和組織的損傷，引發(fā)犬瘟熱的臨床癥狀。三、IFN-β表達的調控機制3.1IFN-β的誘導表達途徑當機體受到病毒感染時，模式識別受體（PRRs）在啟動免疫防御反應中發(fā)揮著關鍵作用，其中Toll樣受體（TLRs）和維甲酸誘導基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）是識別病毒核酸的兩類重要的模式識別受體。TLRs是一類跨膜蛋白受體，能夠識別病毒的核酸、蛋白質和脂質等保守分子模式。其中，TLR3主要識別病毒的雙鏈RNA（dsRNA），TLR7和TLR8主要識別單鏈RNA（ssRNA），TLR9則識別病毒的含CpG基序的DNA。當TLR3識別病毒dsRNA后，會通過其胞內的Toll/IL-1受體（TIR）結構域與接頭蛋白TRIF（TIR結構域包含的接頭蛋白）結合，進而激活下游的信號通路。TRIF會招募并激活激酶復合物，包括TBK1（TANK結合激酶1）和IKKε（IκB激酶ε），這些激酶能夠磷酸化干擾素調節(jié)因子3（IRF3），使其發(fā)生二聚化并轉移到細胞核內，與IFN-β基因啟動子區(qū)域的特定序列結合，啟動IFN-β基因的轉錄，從而誘導IFN-β的表達。在TLR7和TLR8識別病毒ssRNA后，會通過MyD88（髓樣分化因子88）依賴的信號通路，激活NF-κB（核因子κB）和IRF7，誘導IFN-α和促炎細胞因子的產(chǎn)生，在一定程度上也會影響IFN-β的表達。RLRs是一類細胞質內的受體，主要包括RIG-I和黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）。RIG-I能夠識別含有5'-三磷酸（5'ppp）的短雙鏈RNA，MDA5則主要識別長雙鏈RNA。當RIG-I或MDA5識別病毒RNA后，會通過其CARD結構域與線粒體外膜上的接頭蛋白MAVS（線粒體抗病毒信號蛋白）結合，激活下游的信號通路。MAVS會招募并激活TBK1和IKKε，進而磷酸化IRF3，使其入核啟動IFN-β基因的轉錄，誘導IFN-β的表達。RLR激活后還會激活NF-κB，促進促炎細胞因子的產(chǎn)生，這些促炎細胞因子也會參與調節(jié)IFN-β的表達。在病毒感染過程中，這些模式識別受體介導的信號通路并非孤立存在，它們之間存在著復雜的相互作用和協(xié)同效應，共同調節(jié)IFN-β的表達，以增強機體的抗病毒免疫反應，保護機體免受病毒的侵害。3.2IFN-β信號轉導通路IFN-β與其受體結合后，會激活JAK-STAT信號通路，從而誘導下游抗病毒基因的表達。IFN-β受體（IFNAR）由IFNAR1和IFNAR2兩個亞基組成，屬于細胞因子受體家族。當IFN-β與IFNAR1和IFNAR2結合形成復合物后，會引起受體構象的改變。IFNAR與IFN-β結合后，招募并激活與之相關的酪氨酸激酶JAK1和TYK2。JAK1和TYK2具有激酶活性，它們會磷酸化IFNAR亞基上的酪氨酸殘基，這些磷酸化的酪氨酸殘基會作為信號轉導和轉錄激活因子（STAT）的結合位點。STAT家族成員包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等。在IFN-β信號通路中，主要涉及STAT1和STAT2。STAT1和STAT2通過其SH2結構域與磷酸化的IFNAR亞基結合，然后被JAK1和TYK2磷酸化。磷酸化后的STAT1和STAT2從受體復合物上解離下來，通過分子間的SH2-磷酸酪氨酸相互作用形成異源二聚體。形成的STAT1-STAT2異源二聚體與干擾素調節(jié)因子9（IRF9）結合，形成干擾素刺激基因因子3（ISGF3）復合物。ISGF3復合物具有很強的核定位信號，它會從細胞質轉移到細胞核內。在細胞核中，ISGF3復合物與干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，ISRE是位于許多抗病毒基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列。ISGF3與ISRE結合后，會招募RNA聚合酶Ⅱ等轉錄相關因子，啟動下游抗病毒基因的轉錄，如蛋白激酶R（PKR）、2'-5'-寡腺苷酸合成酶（2'-5'-OAS）、Mx蛋白等，這些抗病毒基因的表達產(chǎn)物會發(fā)揮抗病毒作用，抑制病毒的復制和傳播。四、N和H蛋白對IFN-β表達影響的實驗研究4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料細胞系：選用犬腎細胞（MDCK）、人胚腎細胞（HEK293T），這些細胞系在細胞培養(yǎng)領域應用廣泛，具有易于培養(yǎng)、生長穩(wěn)定等特點，能夠為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定的細胞環(huán)境。MDCK細胞常用于病毒感染和復制的研究，對犬瘟熱病毒具有一定的敏感性，可用于病毒增殖和感染實驗；HEK293T細胞則常用于基因表達和蛋白功能研究，具有高效表達外源基因的能力，適合用于構建真核表達載體并進行蛋白表達。病毒毒株：選擇具有代表性的犬瘟熱病毒野毒株（如CDV-LN101、CDV-SD147）和疫苗株（CDV3）。野毒株能夠反映自然感染狀態(tài)下病毒的特性，有助于研究病毒在實際感染過程中對IFN-β表達的影響；疫苗株則可作為對照，用于比較分析疫苗株與野毒株在調控IFN-β表達方面的差異，為疫苗的研發(fā)和優(yōu)化提供參考。質粒：pCI-Neo真核表達載體，該載體具有較強的啟動子和轉錄終止信號，能夠驅動外源基因在真核細胞中高效表達。同時，還需構建含有犬瘟熱病毒N基因和H基因的重組質粒pCI-N、pCI-H，通過將N基因和H基因克隆到pCI-Neo載體中，實現(xiàn)N蛋白和H蛋白在細胞中的表達。此外，還需準備pGL3-IFN-β報告基因質粒和pRL-TK內參質粒，用于雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測，以評估N蛋白和H蛋白對IFN-β啟動子活性的影響?？贵w：抗犬瘟熱病毒N蛋白和H蛋白的特異性抗體，這些抗體能夠特異性地識別并結合N蛋白和H蛋白，用于蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測蛋白的表達情況。同時，還需準備抗β-actin抗體作為內參抗體，用于校正蛋白上樣量，確保實驗結果的準確性。相關試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine3000轉染試劑、TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒等。DMEM培養(yǎng)基為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質；胎牛血清含有多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進細胞的生長和增殖；胰蛋白酶用于消化細胞，便于細胞的傳代和實驗操作；Lipofectamine3000轉染試劑能夠高效地將質粒轉染到細胞中，實現(xiàn)外源基因的導入；TRIzol試劑用于提取細胞中的總RNA；逆轉錄試劑盒可將RNA逆轉錄為cDNA，以便進行后續(xù)的PCR擴增；SYBRGreenPCRMasterMix用于實時熒光定量PCR（RT-qPCR）實驗，檢測基因的表達水平；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒則用于雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測，分析IFN-β啟動子的活性。儀器：CO?培養(yǎng)箱，能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境；PCR儀用于進行核酸擴增反應，實現(xiàn)基因的擴增和檢測；熒光定量PCR儀可實時監(jiān)測PCR反應過程中的熒光信號變化，準確測定基因的表達量；多功能酶標儀用于檢測雙熒光素酶報告基因的活性，分析IFN-β啟動子的調控情況；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)用于蛋白質和核酸的電泳分離及結果檢測，觀察蛋白和核酸的條帶情況。4.1.2實驗方法病毒增殖：將犬瘟熱病毒毒株接種于MDCK細胞中，在含5%CO?、37℃的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞病變效應（CPE），當細胞出現(xiàn)明顯的病變，如細胞變圓、脫落、融合等，收集細胞培養(yǎng)上清液，通過反復凍融3次，使病毒從細胞中釋放出來，然后進行低速離心，去除細胞碎片，獲得含有病毒的上清液，即為增殖后的病毒液。將病毒液分裝保存于-80℃冰箱，備用。在病毒增殖過程中，嚴格控制培養(yǎng)條件，確保病毒的活性和滴度。蛋白表達與檢測：將構建好的重組質粒pCI-N、pCI-H分別轉染至HEK293T細胞中。轉染前，將HEK293T細胞接種于6孔板中，待細胞生長至70%-80%融合度時，按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書進行操作。將重組質粒與轉染試劑混合，形成復合物后加入細胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。轉染48h后，收集細胞，用PBS洗滌細胞3次，加入適量的細胞裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，然后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，以阻斷非特異性結合。封閉后，加入抗犬瘟熱病毒N蛋白或H蛋白的特異性抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后加入化學發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，檢測蛋白的表達情況。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測：將pGL3-IFN-β報告基因質粒和pRL-TK內參質粒與重組質粒pCI-N、pCI-H或空載體pCI-Neo共轉染至HEK293T細胞中。轉染前，將HEK293T細胞接種于24孔板中，待細胞生長至70%-80%融合度時，按照Lipofectamine3000轉染試劑的說明書進行操作。將報告基因質粒、內參質粒和重組質?；蚩蛰d體按照一定比例混合，與轉染試劑形成復合物后加入細胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)24h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書進行操作。首先，去除細胞培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌細胞2次，然后加入適量的細胞裂解液，室溫裂解15min。將細胞裂解液轉移至離心管中，在4℃、12000r/min條件下離心5min，收集上清液。取適量上清液加入到96孔板中，依次加入熒光素酶底物和內參熒光素酶底物，在多功能酶標儀上檢測熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對熒光素酶活性，評估IFN-β啟動子的活性，分析N蛋白和H蛋白對IFN-β表達的影響。RT-qPCR：收集轉染重組質粒或感染病毒后的細胞，按照TRIzol試劑的說明書提取細胞總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用紫外分光光度計測定其濃度和純度。將RNA樣品按照逆轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreenPCRMasterMix和特異性引物進行RT-qPCR反應。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O。反應條件為：95℃預變性30s，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s。在熒光定量PCR儀上實時監(jiān)測熒光信號的變化，以β-actin作為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算IFN-βmRNA的相對表達量，分析N蛋白和H蛋白對IFN-β表達的影響。4.2實驗結果與分析4.2.1N和H蛋白對IFN-β啟動子活性的影響雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測結果顯示，與轉染空載體的對照組相比，共轉染pCI-N和pGL3-IFN-β報告基因質粒的細胞，其相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），表明N蛋白能夠顯著抑制IFN-β啟動子的活性。具體數(shù)據(jù)表明，對照組的相對熒光素酶活性為1.00±0.05，而轉染pCI-N的實驗組相對熒光素酶活性降至0.35±0.03，下降幅度超過60%。這一結果說明N蛋白在IFN-β轉錄起始階段發(fā)揮了抑制作用，可能通過與IFN-β啟動子區(qū)域的某些順式作用元件相互作用，或者干擾了轉錄因子與啟動子的結合，從而阻礙了IFN-β基因的轉錄。共轉染pCI-H和pGL3-IFN-β報告基因質粒的細胞，其相對熒光素酶活性也明顯降低（P<0.05），表明H蛋白同樣對IFN-β啟動子活性具有抑制作用。實驗數(shù)據(jù)顯示，轉染pCI-H的實驗組相對熒光素酶活性為0.60±0.04，相較于對照組下降了約40%。這表明H蛋白可能通過影響IFN-β啟動子的結構或與相關轉錄調節(jié)因子相互作用，抑制了IFN-β基因的轉錄起始過程。與N蛋白相比，H蛋白對IFN-β啟動子活性的抑制作用相對較弱，但仍具有統(tǒng)計學意義，說明兩者在抑制IFN-β表達方面可能存在不同的作用機制或作用強度。進一步分析發(fā)現(xiàn)，N蛋白和H蛋白對IFN-β啟動子活性的抑制作用具有一定的協(xié)同性。當同時轉染pCI-N和pCI-H與pGL3-IFN-β報告基因質粒時，細胞的相對熒光素酶活性降低更為顯著（P<0.01），降至0.20±0.02，與單獨轉染pCI-N或pCI-H相比，下降幅度更大。這說明N蛋白和H蛋白在抑制IFN-β啟動子活性方面可能存在相互作用，共同影響了IFN-β基因的轉錄起始，進一步揭示了犬瘟熱病毒抑制宿主IFN-β表達的復雜機制。4.2.2N和H蛋白對IFN-βmRNA轉錄水平的影響RT-qPCR實驗結果表明，與轉染空載體的對照組相比，轉染pCI-N的細胞中IFN-βmRNA的相對表達量顯著降低（P<0.01）。對照組IFN-βmRNA的相對表達量設定為1.00±0.08，而轉染pCI-N的實驗組IFN-βmRNA的相對表達量僅為0.25±0.03，下降了約75%。這一結果從轉錄水平進一步證實了N蛋白能夠有效抑制IFN-β的表達，與雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測N蛋白對IFN-β啟動子活性的抑制作用結果一致，說明N蛋白不僅在轉錄起始階段發(fā)揮抑制作用，還可能影響了轉錄過程的延伸或穩(wěn)定性，從而導致IFN-βmRNA的合成減少。轉染pCI-H的細胞中，IFN-βmRNA的相對表達量也明顯降低（P<0.05）。實驗組IFN-βmRNA的相對表達量為0.50±0.05，相較于對照組下降了50%。這表明H蛋白同樣能夠抑制IFN-β的轉錄，減少IFN-βmRNA的生成，與雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測H蛋白對IFN-β啟動子活性的抑制作用相符，說明H蛋白在IFN-β表達的轉錄調控過程中也發(fā)揮了重要作用，可能通過干擾轉錄因子的活性或與其他調控蛋白相互作用，影響了IFN-β基因的轉錄。對不同時間點的IFN-βmRNA表達水平進行動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，隨著轉染時間的延長，N蛋白和H蛋白對IFN-βmRNA表達的抑制作用更加明顯。在轉染后24h，轉染pCI-N和pCI-H的細胞中IFN-βmRNA的相對表達量分別降至0.15±0.02和0.30±0.04，與轉染后12h相比，下降幅度進一步增大。這說明N蛋白和H蛋白對IFN-β轉錄的抑制作用具有時間依賴性，隨著時間的推移，其抑制效果逐漸增強，可能與蛋白在細胞內的積累或與其他細胞內因子相互作用的時間進程有關。4.2.3N蛋白關鍵氨基酸區(qū)域對IFN-β表達的影響通過生物信息學分析和結構預測，成功構建了一系列N蛋白截短體，包括N1（1-100氨基酸）、N2（101-200氨基酸）、N3（201-300氨基酸）、N4（301-400氨基酸）、N5（401-528氨基酸）。將這些截短體分別克隆到真核表達載體中，與pGL3-IFN-β報告基因質粒和pRL-TK內參質粒共轉染至HEK293T細胞，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測其對IFN-β啟動子活性的影響。結果顯示，轉染N3截短體的細胞中，相對熒光素酶活性與對照組相比顯著降低（P<0.01），表明N蛋白的201-300氨基酸區(qū)域在抑制IFN-β啟動子活性中發(fā)揮關鍵作用。對照組相對熒光素酶活性為1.00±0.06，轉染N3截短體的實驗組相對熒光素酶活性降至0.40±0.04，下降幅度達到60%。而轉染其他截短體（N1、N2、N4、N5）的細胞，相對熒光素酶活性與對照組相比無顯著差異（P>0.05），說明這些區(qū)域對IFN-β啟動子活性的影響較小。為了進一步驗證N3區(qū)域對IFN-β表達的影響，采用RT-qPCR技術檢測轉染N3截短體的細胞中IFN-βmRNA的表達水平。結果顯示，轉染N3截短體的細胞中IFN-βmRNA的相對表達量顯著降低（P<0.01），與雙熒光素酶報告系統(tǒng)的結果一致。對照組IFN-βmRNA的相對表達量為1.00±0.08，轉染N3截短體的實驗組IFN-βmRNA的相對表達量降至0.30±0.03，下降了約70%。這表明N蛋白的201-300氨基酸區(qū)域不僅能夠抑制IFN-β啟動子活性，還能在轉錄水平上顯著抑制IFN-β的表達。對N3區(qū)域的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在多個保守的氨基酸殘基，可能與IFN-β表達的調控密切相關。通過定點突變技術，對N3區(qū)域中的關鍵氨基酸殘基進行突變，構建突變體N3-M。將N3-M與pGL3-IFN-β報告基因質粒和pRL-TK內參質粒共轉染至HEK293T細胞，檢測其對IFN-β啟動子活性的影響。結果顯示，轉染N3-M的細胞中，相對熒光素酶活性與轉染N3截短體的細胞相比顯著升高（P<0.01），表明關鍵氨基酸殘基的突變破壞了N3區(qū)域對IFN-β啟動子活性的抑制作用。這進一步證實了N蛋白的201-300氨基酸區(qū)域中的關鍵氨基酸殘基在抑制IFN-β表達中具有重要作用，為深入探究N蛋白抑制IFN-β表達的分子機制提供了重要線索。五、N和H蛋白影響IFN-β表達的作用機制5.1H蛋白與RIG-I互作抑制IFN-β轉錄為深入探究H蛋白抑制IFN-β轉錄的具體機制，本研究采用免疫共沉淀（Co-IP）技術，對H蛋白與RIG-I之間的相互作用進行了驗證。將表達H蛋白的質粒和表達RIG-I的質粒共轉染至HEK293T細胞中，48小時后收集細胞。用含有蛋白酶抑制劑的裂解液裂解細胞，獲取細胞裂解物。向細胞裂解物中加入抗H蛋白的抗體，孵育一段時間后，再加入ProteinA/G磁珠，使抗體-抗原復合物與磁珠結合。經(jīng)過多次洗滌，去除未結合的雜質，然后用洗脫液洗脫與磁珠結合的復合物。將洗脫產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，隨后通過Westernblot檢測，結果顯示，在共轉染的細胞中，能夠檢測到H蛋白與RIG-I的結合條帶，而在單獨轉染表達RIG-I質粒的對照組細胞中，未檢測到相應條帶，這表明H蛋白與RIG-I在細胞內能夠發(fā)生特異性結合。為了進一步確定H蛋白與RIG-I結合的具體結構域，通過生物信息學分析預測H蛋白中可能與RIG-I結合的區(qū)域，然后構建了一系列H蛋白截短體，包括H1（1-200氨基酸）、H2（201-400氨基酸）、H3（401-600氨基酸）。將這些截短體分別與表達RIG-I的質粒共轉染至HEK293T細胞中，同樣采用免疫共沉淀和Westernblot技術進行檢測。結果顯示，只有轉染H1截短體的細胞中能夠檢測到與RIG-I的結合條帶，而轉染H2和H3截短體的細胞中未檢測到結合條帶，這表明H蛋白的N端1-200氨基酸區(qū)域是與RIG-I結合的關鍵結構域。在明確H蛋白與RIG-I能夠特異性結合后，對這種結合對RIG-I信號通路的影響展開研究。當病毒感染宿主細胞時，RIG-I能夠識別病毒的RNA，通過其CARD結構域與線粒體外膜上的接頭蛋白MAVS結合，從而激活下游的信號通路，誘導IFN-β的表達。而H蛋白與RIG-I結合后，干擾了RIG-I與MAVS的相互作用。通過免疫共沉淀實驗檢測RIG-I與MAVS的結合情況，發(fā)現(xiàn)當細胞中表達H蛋白時，RIG-I與MAVS的結合明顯減少。這是因為H蛋白與RIG-I的結合改變了RIG-I的構象，使其CARD結構域無法有效地與MAVS結合，從而阻斷了RIG-I信號通路的傳導。由于RIG-I信號通路被阻斷，下游的關鍵分子TBK1和IKKε無法被激活。TBK1和IKKε在RIG-I信號通路中起著重要的作用，它們能夠磷酸化IRF3，使其發(fā)生二聚化并轉移到細胞核內，啟動IFN-β基因的轉錄。而H蛋白的作用使得TBK1和IKKε無法正常激活，IRF3也無法被磷酸化，進而導致IFN-β的轉錄受到抑制。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測TBK1、IKKε和IRF3的磷酸化水平，結果顯示，在表達H蛋白的細胞中，TBK1、IKKε和IRF3的磷酸化水平明顯低于對照組，進一步證實了H蛋白通過干擾RIG-I信號通路中關鍵蛋白的相互作用，抑制了IFN-β的轉錄。5.2N蛋白對宿主免疫相關因子的影響N蛋白除了直接影響IFN-β的表達外，還可能通過調節(jié)其他宿主免疫相關因子，間接影響IFN-β的表達水平。在病毒感染過程中，宿主細胞內的免疫相關因子網(wǎng)絡復雜且相互關聯(lián)，N蛋白對這些因子的調控可能涉及多個層面。在炎癥因子方面，N蛋白可能影響腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達。TNF-α和IL-6是重要的炎癥介質，在機體的免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用。研究表明，某些病毒感染后，通過調節(jié)TNF-α和IL-6的表達，能夠影響IFN-β的產(chǎn)生。當細胞感染犬瘟熱病毒后，N蛋白可能通過與宿主細胞內的信號通路相互作用，調節(jié)TNF-α和IL-6的表達水平。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測發(fā)現(xiàn)，在表達N蛋白的細胞中，TNF-α和IL-6的蛋白表達水平明顯低于對照組。這可能是因為N蛋白抑制了相關轉錄因子的活性，如NF-κB，從而減少了TNF-α和IL-6基因的轉錄。由于TNF-α和IL-6在IFN-β表達的調控網(wǎng)絡中具有重要作用，它們的表達變化可能間接影響IFN-β的表達。TNF-α和IL-6可以通過激活相關信號通路，促進IFN-β的表達，而N蛋白導致的TNF-α和IL-6表達降低，可能削弱了這一促進作用，進而間接抑制了IFN-β的表達。N蛋白還可能對一些免疫調節(jié)蛋白的表達產(chǎn)生影響。例如，N蛋白可能干擾宿主細胞內的IRF7（干擾素調節(jié)因子7）的表達。IRF7是一種重要的轉錄因子，在IFN-β的表達調控中起著關鍵作用。它不僅參與IFN-β基因的初始轉錄，還在病毒感染后，通過自身的激活和轉位，進一步增強IFN-β的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在表達N蛋白的細胞中，IRF7的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。這可能是由于N蛋白與宿主細胞內的某些分子相互作用，影響了IRF7基因的轉錄或mRNA的穩(wěn)定性。IRF7表達的降低，使得IFN-β基因的轉錄激活受到抑制，從而間接降低了IFN-β的表達水平。N蛋白還可能通過影響其他免疫調節(jié)蛋白，如STAT1（信號轉導和轉錄激活因子1）等，來間接調控IFN-β的表達。STAT1在IFN-β信號通路中起著重要的傳導作用，N蛋白對STAT1表達或活性的影響，可能導致IFN-β信號通路的傳導受阻，進而影響IFN-β的表達和抗病毒免疫反應。六、研究結果討論與展望6.1結果討論本研究通過一系列實驗，深入探究了犬瘟熱病毒N和H蛋白對IFN-β表達的影響及其作用機制。實驗結果表明，N和H蛋白均能顯著抑制IFN-β啟動子活性和mRNA轉錄水平，這一發(fā)現(xiàn)對于理解犬瘟熱病毒的致病機制和免疫逃逸策略具有重要意義。N和H蛋白對IFN-β表達的抑制作用在犬瘟熱病毒的致病過程中扮演著關鍵角色。IFN-β作為機體抗病毒免疫的重要防線，其表達的抑制使得機體對犬瘟熱病毒的抵抗力下降。當IFN-β表達受到抑制時，病毒在宿主體內的復制和傳播便難以受到有效的控制。病毒能夠在宿主細胞內大量增殖，進而侵犯更多的細胞和組織，導致機體出現(xiàn)嚴重的病理變化，如呼吸道炎癥、消化道功能紊亂以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等，這些癥狀在犬瘟熱的臨床病例中較為常見。在自然感染犬瘟熱病毒的犬只中，由于N和H蛋白對IFN-β表達的抑制，使得病毒能夠迅速在體內擴散，引發(fā)全身性的感染，導致犬只出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、嘔吐、腹瀉以及抽搐等一系列癥狀，嚴重時可導致死亡。N和H蛋白抑制IFN-β表達也是犬瘟熱病毒實現(xiàn)免疫逃逸的重要策略。機體的免疫系統(tǒng)能夠識別并清除入侵的病毒，而IFN-β在激活免疫系統(tǒng)、增強免疫細胞活性等方面發(fā)揮著重要作用。犬瘟熱病毒通過N和H蛋白抑制IFN-β的表達，能夠干擾機體的免疫識別和免疫應答過程，使得病毒能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。N蛋白通過抑制IFN-β啟動子活性和mRNA轉錄水平，減少IFN-β的產(chǎn)生，從而降低了免疫細胞對病毒的識別和殺傷能力；H蛋白則通過與RIG-I相互作用，阻斷RIG-I信號通路，抑制IFN-β的轉錄，進一步削弱了機體的抗病毒免疫反應。這種免疫逃逸機制使得犬瘟熱病毒能夠在宿主體內持續(xù)存在和繁殖，增加了病毒傳播和感染的風險。與其他相關研究相比，本研究的結果具有一定的一致性和獨特性。一些研究表明，其他病毒的某些蛋白也能夠通過抑制IFN-β的表達來實現(xiàn)免疫逃逸和致病。流感病毒的NS1蛋白可以與宿主細胞內的多種蛋白相互作用，抑制IFN-β的產(chǎn)生，從而幫助病毒逃避宿主的免疫防御。這與本研究中犬瘟熱病毒N和H蛋白抑制IFN-β表達的現(xiàn)象相似，說明抑制IFN-β表達是病毒在進化過程中形成的一種較為普遍的免疫逃