DB13-T2595-2017-葡萄霜霉病毒保存技術(shù)規(guī)程-河北省

DB13/T2595—2017ICS65.020DB13B16河北省地方標(biāo)準(zhǔn)DB13/T2595—2017葡萄霜霉病菌保存技術(shù)規(guī)程河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB13/T2595—2017前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：冉隆賢、申紅妙、李正楠、賈招閃、甄志先、劉長遠(yuǎn)、杜興蘭。ⅠDB13/T2595—2017葡萄霜霉病菌保存技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(BerketCurtis)Berl.etdeToni]離體保存技術(shù)的術(shù)語和定義、葡萄霜霉病菌保存概述和葡萄霜霉病菌保存技術(shù)等內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于教育、研究機(jī)構(gòu)、農(nóng)藥研發(fā)部門和藥效測定單位等保存葡萄霜霉病菌。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1葡萄試管苗InvitroGrapePlantlet是指在試管等容器中經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得的葡萄苗。2.2水瓊脂平板WaterAgarPlate用作保濕的平板培養(yǎng)基。6g瓊脂，1000mL蒸餾水，直徑9cm的培養(yǎng)皿每個(gè)約倒入10mL。3葡萄霜霉病菌保存概述葡萄霜霉病菌只能在活體寄主上存活，在離體培養(yǎng)基上不能生長繁殖和保存，致使相關(guān)的研究受到限制。要保持對(duì)該病菌持續(xù)的研究并排除其它雜菌的干擾，需對(duì)葡萄霜霉病菌進(jìn)行保存，且保持病菌的致病力，并提高其存活率和穩(wěn)定性。本規(guī)程針對(duì)不同的用途，分別對(duì)葡萄霜霉病菌進(jìn)行了超低溫保存，主要用于病菌的長期保存；真空冷凍干燥保存，主要用于病菌復(fù)壯；葡萄試管苗葉片保存，主要用于病菌純化，以保證病菌生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。4在田間采集感染葡萄霜霉病的新鮮發(fā)病葉片，裝于保鮮袋中，并放置于0℃～4℃的保溫盒中帶回將蘸濕的脫脂棉球包住葉柄，背面朝上置于墊有濕紗布的培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，置入光照培養(yǎng)箱中（20℃、12h光照，18℃、12h黑暗，相對(duì)濕度100%）培養(yǎng)2d，待其重新長出干凈的霜霉層，備用。1DB13/T2595—20174.1.3孢子囊懸浮液的制備用滅菌的棉簽將新長出霉層上的孢子囊刷至無菌水中，用單層擦鏡紙過濾，去除孢囊梗，得到干凈的孢子囊；用無菌水調(diào)節(jié)濃度為10個(gè)/mL的孢子囊懸浮液，備用。64.1.4孢子囊的保存取4.1.3中獲得的孢子囊懸浮液10mL，加入等量的10%的二甲基亞砜（DMSO），配制成含5%二甲基亞砜的孢子囊懸浮液。將配好的孢子囊懸浮液分裝于規(guī)格為2.0mL的凍存管中，置于-80℃的超低溫冰箱中保存。待需要霜霉病菌時(shí)，取出凍存管，室溫融化后，在2000rpm下離心15min，棄上清，加入無菌水混勻并再次離心，用于清洗孢子囊，去除二甲基亞砜，共離心3次。用無菌水調(diào)節(jié)濃度后接種于干凈健康的葡萄葉片背面繁殖使用。4.1.5保存時(shí)效含5%二甲基亞砜的孢子囊懸浮液-80℃超低溫可以保存至少5年，孢子囊的致病力無明顯降低。4.2真空冷凍干燥保存法4.2.1霜霉病葉冷凍干燥霜霉病樣采集及預(yù)處理同4.1.1和4.1.2；將4.1.2中準(zhǔn)備好的新鮮病葉的病斑部位剪成2cm×2cm大小，放入冷凍干燥機(jī)中，在溫度為-41℃、壓力為13.0Pa下真空冷凍干燥36h，直至材料恒重。將真空冷凍干燥后的病葉碎片取出，分裝進(jìn)規(guī)格為20cm×30cm的鋁箔袋，并用真空封口機(jī)進(jìn)行壓縮封口處理，每袋30片；稱取6g瓊脂粉加入蒸餾水中，并用玻璃棒攪拌，均勻加熱使其完全溶解，定容至1000mL；取200mL分裝于500mL的三角瓶中，置于高壓滅菌鍋內(nèi)121℃下滅菌20min～30min；將滅菌后的三角瓶取出，室溫放置24h，確定無雜菌生長后待用。以1/2MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LIBA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂（pH值為5.8～6.0）進(jìn)行配制；2DB13/T2595—2017將配制好的培養(yǎng)基倒入100mL三角瓶內(nèi)，每瓶40mL，把分裝培養(yǎng)基后的三角瓶置于高壓滅菌鍋內(nèi)121℃下滅菌20min～30min，待用。4.3.2葡萄枝條預(yù)處理與消毒取未木質(zhì)化或半木質(zhì)化的新鮮葡萄枝條，去除葉片，剪成3cm～4cm長的帶腋芽的小段，用流水沖洗5min；在超凈工作臺(tái)上，將洗凈的莖段用70%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞浸泡5min～10min，最后用無菌水清洗4次；將消毒后的莖段放在無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，剪去莖段上下兩端褐化的部分，形態(tài)學(xué)上端平剪，下端剪為馬蹄形；將剪成2cm～2.5cm的帶腋芽莖段接入滅菌好的培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)（25℃、12h光照，20℃、12h黑暗）。4.3.3葡萄試管苗葉片接種待葡萄試管苗高度達(dá)到5cm以上，著生3～5片葉時(shí)，在超凈工作臺(tái)上，用滅菌后的剪刀剪取試管苗葉片，將剪下的葉片背面朝上放置于倒好的水瓊脂平板上；取4.1.2中重新長出干凈霜霉層的葉片，用蘸有無菌水的挑針輕輕挑取干凈的霜霉病菌，將其接種于試管苗葉片上；接種后將平板密封，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d～10d，培養(yǎng)條件同4.1.2。4.3.4霜霉菌的純化按照4.3.3的方法取出試管苗葉片，背面朝上放置于水瓊脂平板上，用蘸有無菌水的解剖針挑取已接