第10章現(xiàn)代生物技術(shù)的應用課件

第十章現(xiàn)代生物技術(shù)的應用

現(xiàn)代生物技術(shù)不僅直接提供IFN、IL、EPO、CSF等基因工程藥物，也廣泛用于改造抗生素和生物制品等傳統(tǒng)醫(yī)藥工業(yè)。主要體現(xiàn)在以下幾個方面①抗生素：可從產(chǎn)生菌中分離出生物合成酶基因，進行克隆，提高生產(chǎn)菌的生物量，或得到新的雜合抗生素②氨基酸：利用生物技術(shù)得到基因克隆的生產(chǎn)菌，或采用融合技術(shù)提高氨基酸產(chǎn)量③維生素：構(gòu)建基因工程菌，簡化維生素的生產(chǎn)工藝（如VitC）④疫苗：利用基因工程技術(shù)將抗原克隆到E.coli或酵母中，用工程菌生產(chǎn)疫苗，產(chǎn)量高、工藝簡單、操作安全一、利用現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)2第一節(jié)基因工程在抗生素生產(chǎn)中的應用3

抗生素生物合成并非單一基因的直接產(chǎn)物，而是由初級代謝產(chǎn)物經(jīng)過一系列酶催化產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其形成過程是一個復雜的、多因素調(diào)節(jié)的過程傳統(tǒng)的提高微生物產(chǎn)生抗生素能力的方法主要是用誘變劑（如紫外線、化學誘變劑等）處理微生物，獲得生產(chǎn)能力較高的突變株。80年代，人們開始將DNA重組技術(shù)應用于次級代謝產(chǎn)物的生物合成上；通過生物合成酶基因的分離、質(zhì)粒的選擇、基因重組與轉(zhuǎn)移、宿主表達等方面4一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法1.抗生素（鏈霉素）生物合成基因的結(jié)構(gòu)特點①鏈霉菌抗生素生物合成基因組的一個典型特性是G-C堿基組成，（G+C）%高達70%以上；且三聯(lián)體密碼子中第3個堿基G、C比例極高②抗生素生物合成基因大多處于一個基因族中③抗生素生物合成基因除定位在染色體上外，有的定位于質(zhì)粒上52.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法①在標準宿主系統(tǒng)中克隆檢測單基因產(chǎn)物②阻斷變株法③突變克隆法④直接克隆法⑤克隆抗生素抗性基因法⑥寡核苷酸探針法⑦同源基因雜交法6③突變克隆法

利用整合質(zhì)?；蚴删w，將原株DNA轉(zhuǎn)入到抗生素產(chǎn)生菌中。由于基因有同源性，有可能發(fā)生基因重組，一旦某DNA片段的插入干擾了原株某個生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，即得到這個生物合成基因的阻斷變株，其相應的DNA片段就是這個階段的生物合成基因此法由于要利用噬菌體，因而有一定局限性9④直接克隆法將抗生素產(chǎn)生菌的ＤＮＡ部分酶切的２０～４０bp的片段連接到質(zhì)粒的表達位點上，轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌，培養(yǎng)，篩選具有抗菌活性轉(zhuǎn)化子由于抗生素生物合成基因往往成族存在，使得有時可能需要克隆整套生物合成基因。故此法主要用于基因族相對較?。ā?0kb）的抗生素生物合成基因10⑤克隆抗生素抗性基因法

抗生素生物合成基因和抗性基因往往是連鎖的，表達也是協(xié)同的（否則菌體本身沒有抗性，容易被自身所產(chǎn)生的抗生素殺滅），且抗性基因一般只有１～２kb，容易檢測于克隆先將抗性基因克隆到標準宿主或產(chǎn)生菌的敏感突變株中，再分析與之緊密連鎖的ＤＮＡ，就可能找到生物合成基因；也可利用已經(jīng)克隆的抗性基因作為探針，從產(chǎn)生菌基因文庫中分離與之同源的并帶有生物合成基因的ＤＮＡ片段11⑥寡核苷酸探針法

根據(jù)抗生素生物合成酶基因的氨基酸序列，推導出其基因序列，然后人工合成寡核苷酸，并以此寡核苷酸作為探針，從基因文庫中克隆出相應的生物合成基因12⑦同源基因雜交法

利用一種已經(jīng)克隆的抗生素生物合成基因片段為探針，探測相關抗生素同源基因，最后分離及克隆抗生素生物合成基因13二、提高抗生素產(chǎn)量

在抗生素生產(chǎn)過程中，獲得高產(chǎn)菌株的傳統(tǒng)方法是通過誘變育種得到的；而利用基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量應從以下方面著手1.將抗生素產(chǎn)生菌基因隨機克隆到原株直接篩選高產(chǎn)菌株

原理：在克隆菌中，增加某一與產(chǎn)量有關的基因（限速階段的正性調(diào)節(jié)基因）的劑量，使產(chǎn)量提高142.增加參與生物合成限速階段基因的拷貝數(shù)

抗生素生物合成途徑中的某個階段可能是整個合成中的限速階段，識別合成途徑中的“限速瓶頸”，并設法導入能提高此階段酶系的基因拷貝數(shù)；只要增加的中間產(chǎn)物不對合成途徑中的某步驟產(chǎn)生負反饋抑制，就可以增加抗生素的產(chǎn)量。故增加生物合成中限速階段酶基因劑量有可能提高抗生素產(chǎn)量153.通過調(diào)節(jié)基因的作用

調(diào)節(jié)基因的作用可增加或降低抗生素的產(chǎn)量，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因族的組成部分。正性調(diào)節(jié)基因可加速抗生素的合成，負性調(diào)節(jié)基因可降低抗生素的產(chǎn)量。因此，增加正性調(diào)節(jié)基因或降低負性調(diào)節(jié)基因也是增加抗生素產(chǎn)量的方法164.增加抗性基因

抗性基因通過其產(chǎn)物滅活胞內(nèi)或胞外的抗生素，保護自身免遭抗生素的殺滅作用；而且有些抗性基因的產(chǎn)物還直接參與抗生素的合成。抗性基因經(jīng)常與生物合成基因連鎖，是激活生物合成基因進行轉(zhuǎn)錄的必需成分。抗性基因必須先進行轉(zhuǎn)錄，建立抗性后，生物合成基因的轉(zhuǎn)錄才能進行?？股氐纳a(chǎn)水平是由抗生素生物合成酶與對自身抗性的酶所共同確定17三、改善抗生素組分許多抗生素產(chǎn)生菌可以同時產(chǎn)生多種抗生素，這些組分的化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似，而其生物活性有時卻相差很大隨著對各種抗生素生物合成途徑的深入了解及基因重組技術(shù)的發(fā)展應用基因工程技術(shù)可定向改造抗生素產(chǎn)生菌，獲得只產(chǎn)生有效成分的菌種18四、改造抗生素生產(chǎn)工藝1.抗生素產(chǎn)生菌一般對氧供應較敏感，供氧不足往往是高產(chǎn)發(fā)酵的限制因素。在培養(yǎng)過程中，進入液相培養(yǎng)基的氧分子需穿過幾層界膜，進入菌體后，再經(jīng)物理擴散，才能到達相應的呼吸細胞器。若在菌體內(nèi)導入血紅蛋白基因，提高呼吸細胞器對溶氧的親合力，從而提高細胞對溶氧的利用率2.在抗生素產(chǎn)生菌中引入耐高溫的調(diào)節(jié)基因，或耐熱的生物合成基因，可使發(fā)酵溫度提高，降低生產(chǎn)成本19五、產(chǎn)生雜合抗生素

雜合抗生素：應用遺傳重組技術(shù)改造菌種，產(chǎn)生新的工程菌，制備的新型抗菌活性化合物1.不同抗生素生物合成基因重組2.生物合成途徑中某個酶基因的突變3.在生物合成途徑中引入一個酶基因4.利用底物特異性不強的酶催化形成新產(chǎn)物20第二節(jié)基因工程在氨基酸和維生素生產(chǎn)中的應用21一、在氨基酸生產(chǎn)中的應用1.在酶法生產(chǎn)方面，主要通過克隆某些酶系基因來生產(chǎn)氨基酸如在L-Trp生產(chǎn)中，利用色氨酸合成酶基因和絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶基因的重組質(zhì)粒，在E.coli中克隆化;可使L-Trp產(chǎn)量高達9g/L2.在利用轉(zhuǎn)氨酶反應生產(chǎn)氨基酸方面，將相應的轉(zhuǎn)氨酶基因克隆到工程菌中22二、在維生素生產(chǎn)中的應用簡化維生素的發(fā)酵工藝如Vit.C的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝為“兩步發(fā)酵法”。如今可將第二步發(fā)酵菌株中與發(fā)酵生產(chǎn)Vit.C相關的基因轉(zhuǎn)移至第一步菌株中，構(gòu)建成新的工程菌株，這樣Vit.C的生產(chǎn)過程只需一步發(fā)酵即可完成23第三節(jié)基因工程在生物制品制造中的應用24傳統(tǒng)方法制備疫苗：免疫動物動物培養(yǎng)抽血分離純化凍干保存有的疾病由于病原微生物具有高度的寄主專一性（如乙肝病毒），只能感染人及與人親緣關系近的動物（如黑猩猩），故不能用傳統(tǒng)方法制備基因工程疫苗制備：尋找病原微生物的致病基因，通過高表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應的宿主，制備成基因工程菌，然后培養(yǎng)工程菌，表達出相應疫苗2526二、現(xiàn)代生物技術(shù)在食品工業(yè)方面的應用2011/3/1126

生物技術(shù)是對生命有機體進行加工改造和利用的技術(shù)，它是21世紀高新技術(shù)的核心之一。目前，生物技術(shù)已被應用于工農(nóng)業(yè)、食品加工、醫(yī)療保健等眾多領域中。而食品生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要分支學科，主要指生物技術(shù)在食品工業(yè)中的應用，其作用主要體現(xiàn)在四個方面，一是利用基因工程、細胞工程技術(shù)對食品資源的改造和改良；二是利用發(fā)酵工程、酶工程技術(shù)將農(nóng)副原材料加工制成商品，如調(diào)味品、酒類、酸奶等發(fā)酵制品；三是利用這些生物技術(shù)產(chǎn)品進行二次開發(fā)，形成新的產(chǎn)品，如高果糖漿，食用添加劑等；四是利用酶工藝、發(fā)酵技術(shù)、生物反應器等對傳統(tǒng)食品加工工藝進行改造，降低能耗、提高產(chǎn)率、改善食品品質(zhì)等。另外，在食品生產(chǎn)相關領域如食品包裝、食品檢測等方面，食品生物技術(shù)也得到越來越廣泛的應用。所以生物技術(shù)在食品領域的應用有著廣闊的市場和發(fā)展前景。生物技術(shù)簡介：272011/3/112728生物技術(shù)：生物技術(shù)包括基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程5個方面。該技術(shù)是應用生物體（微生物、動物細胞、植物細胞）或其組成部分（細胞器、酶）在最適宜條件下，生產(chǎn)有價值的產(chǎn)物或進行有益過程的技術(shù)?；蚬こ涛⑸锏鞍踪|(zhì)或酶動植物個體或細胞工程菌發(fā)酵工程蛋白質(zhì)或酶工程特定產(chǎn)品細胞工程優(yōu)良品系2011/3/112829基因工程：基因工程是以分子遺傳學為基礎，以DNA重組技術(shù)（克隆技術(shù)）為手段，用人工的方法把不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）分離出來，在體外進行剪切、組合、拼裝，形成基因重組體，然后把重組體引入宿主細胞內(nèi)或個體中以得到高效表達，最終獲得人們所需要的基因產(chǎn)物，實現(xiàn)動物、植物、微生物等物種之間的基因轉(zhuǎn)移，或DNA重組，達到食品原料或微生物的改良。2011/3/112930基因工程的應用：1、優(yōu)化食品生物資源及食品品質(zhì)，即食品加工原料的改良2、改良食品工業(yè)菌種，創(chuàng)造新型的工程菌3、通過基因工程可以改變酶的性質(zhì)，生產(chǎn)食品結(jié)構(gòu)改良劑4、基因工程技術(shù)還可用于食品工業(yè)中新型蛋白質(zhì)、單細胞蛋白、維生素酶制劑、微

生物多糖、淀粉糖的生產(chǎn)2011/3/113031蛋白質(zhì)工程:蛋白質(zhì)工程是利用X-射線衍射和電子計算機圖像顯示計算，確定天然蛋白質(zhì)的三維構(gòu)想和活性部位，分析設計需要改造的氨基酸殘基，然后采用基因定位突變的方法，修飾或人工合成基因，按照設計改造天然蛋白質(zhì)或酶，提高其應用價值。蛋白質(zhì)工程可以按照人類的需求創(chuàng)造出原來不曾有過、具有不同功能的蛋白質(zhì)及其新產(chǎn)品，或生產(chǎn)具有特定氨基酸順序、高級結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能的新型蛋白質(zhì)，可以定向改造酶的性能，生產(chǎn)新型功能性食品。2011/3/113132蛋白質(zhì)工程的應用：1、改善酶性質(zhì)，提高酶活性和酶耐性2、創(chuàng)造新型蛋白質(zhì)2011/3/113233細胞工程：

細胞工程是在細胞水平上改造生物遺傳特性和生產(chǎn)性能，以獲得特定的細胞、細胞產(chǎn)品或新生物體的技術(shù)，包括細胞融合、細胞培養(yǎng)及細胞核移植等。利用細胞雜交、細胞培養(yǎng)等技術(shù)可獲得遺傳性狀有所改良的新菌株或動植物細胞、生產(chǎn)食品添加劑與酶制劑等。典型的是用于味精生產(chǎn)的優(yōu)良谷氨酸生產(chǎn)菌的育種，繼而出現(xiàn)的必需氨基酸生產(chǎn)菌株的育種都應用到細胞融合技術(shù)。如L-蘇氨酸和L-賴氨酸均已用于生產(chǎn)；醬油曲霉菌經(jīng)細胞融合技術(shù)選育后，醬油的品質(zhì)明顯提高。另外，酒精酵母、酶制劑生產(chǎn)菌的育種多采用細胞工程技術(shù)，均得到了非凡的成果，在食用酒精和食品專用酶的生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的效能。2011/3/113334細胞工程的應用：1、細胞工程育種：在細胞水平上的原生質(zhì)體制備與融合有利于實現(xiàn)遠緣遺傳物質(zhì)的

直接交換，促進遺傳資源的創(chuàng)新。2、細胞培養(yǎng)：利用細胞工程技術(shù)生產(chǎn)生物來源的天然食品或天然食品添加劑2011/3/113435酶工程：酶工程是指利用酶、細胞或細胞器等具有的特異催化功能，借助生物反應裝置和通過一定的工藝手段生產(chǎn)出人類所需要產(chǎn)品。酶工程在食品工程中的應用技術(shù)已經(jīng)比較成熟，包括各種酶的開發(fā)和生產(chǎn)、酶的分離和純化、酶或細胞的固定化技術(shù)、固定化酶反應器的研制以及酶的應用等。2011/3/113536酶工程的應用：1、開發(fā)新型食品添加劑：酶工程加快了新酶源的開發(fā)，使功能性食品添加劑，如營

養(yǎng)強化劑、低熱量的甜味劑、食甩纖維和脂肪替代品等得到迅速發(fā)展。2、酶工程在食品保鮮中的應用：酶制劑保鮮技術(shù)是利用酶的催化作用，防止或消除

外界因素對食品的不良影響，從而保持食品原有的優(yōu)良品質(zhì)與特性的技術(shù)。3、食品分析與檢測方面的應用：由于酶具有特異性，因此，也適合于動植物化學組

分的定性和定量分析。2011/3/113637發(fā)酵工程：發(fā)酵工程是指采用工程技術(shù)手段，利用微生物和有活性離體酶的某些功能，為人類生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品，或者直接用微生物參與控制某些生產(chǎn)的一種技術(shù)。現(xiàn)代發(fā)酵工程包括微生物資源的開發(fā)利用、微生物菌種的選育固定化細胞技術(shù)、生物反應器設計、發(fā)酵條件的利用及自動化控制、發(fā)酵產(chǎn)品的分離與提純等技術(shù)。發(fā)酵工程技術(shù)涉及到新食品配料、食品加工催化劑、飲料穩(wěn)定劑、D-氨基酸及其衍生物制造等諸多食品工業(yè)領域。2011/3/113738發(fā)酵工程的應用：1、改造傳統(tǒng)的食品加工工藝：從植物中萃取食品添加劑不僅成本高，而且來源有限。

化學合成法生產(chǎn)食品添加劑雖然成本低，但是化學合成率低、周期長，而且可能

危害人體健康。現(xiàn)在，發(fā)酵工程技術(shù)成為食品添加劑生產(chǎn)的首選方法。2、開發(fā)大型真菌：一些藥用真菌，含有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗癌、防衰老的有效成

分，是發(fā)展功能性食品的一個重要原料來源。但傳統(tǒng)的野外采摘和人工種植相結(jié)

合的方式產(chǎn)量低，易受天氣和季節(jié)的影響；采用發(fā)酵工程則能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。3、通過乳酸茵發(fā)酵生