mRNA 藥物生產(chǎn)技術(shù)和現(xiàn)狀

Part1、mRNADS生產(chǎn)平臺

1RNA的化學合成RNA的化學合成是一個自動化的循環(huán)過程，可實現(xiàn)連續(xù)的RNA合成，被認為是生產(chǎn)短RNA（<100nt）的標準且穩(wěn)健的方法。該方法利用亞磷酰胺化學和固相支持促進鏈從3'末端到5'末端延長。然而，固相合成的主要缺點是其100nt限制。較長的RNA只能通過使用DNA夾板連接平臺連接較小的RNA來構(gòu)建，加上亞磷酰胺部分的成本，可能會阻礙該技術(shù)用于大規(guī)模生產(chǎn)。2RNA的重組生產(chǎn)宿主細胞（大腸桿菌）中蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)是一個成熟的平臺。重組RNA生產(chǎn)遵循類似的原則：編碼目的mRNA的DNA被包裝到表達載體中，然后轉(zhuǎn)移到宿主細胞中，用于隨后合成異源mRNA，然后是一系列下游工藝(DSP)步驟。然而，生產(chǎn)重組RNA的局限性包括轉(zhuǎn)錄mRNA的5'和3'末端異質(zhì)性、轉(zhuǎn)錄的mRNA被宿主核酸酶降解以及無法摻入化學修飾的核糖核苷酸。利用Ponchon和Dardel的技術(shù)保護轉(zhuǎn)錄的mRNA免受宿主機制的影響，以及使用Jacob等人的創(chuàng)新以促進高度穩(wěn)定的環(huán)狀mRNA，該領(lǐng)域的進步正在解決這些缺點。有一些研究認為，與化學合成和針對大規(guī)模生產(chǎn)的體外轉(zhuǎn)錄相比，重組RNA生產(chǎn)的成本更低。一種方法利用現(xiàn)有的重組蛋白生產(chǎn)基礎(chǔ)設施，允許行業(yè)轉(zhuǎn)變，以及升級已經(jīng)符合良好生產(chǎn)規(guī)范（GMP）指南的蛋白質(zhì)生產(chǎn)單元。Part2、RNA的酶促合成

1聚合酶鏈式反應(PCR)

和聚合酶鏈式轉(zhuǎn)錄(PCT)PCR是一種用于擴增寡核苷酸(DNA)的成熟方法。然而，RNA聚合酶較差的熱穩(wěn)定性阻礙了通過PCR進行的RNA合成。Christopher等人開發(fā)了一種獨特的雙突變DNA聚合酶，能夠使用核糖核苷酸合成RNA，同樣，Tingjian等人報道了通過PCT以SFM4-3（DNA聚合酶）使用未修飾和2'-F修飾的rNTP合成RNA。修飾和工程聚合酶的發(fā)展使PCT能夠高效生產(chǎn)RNA；然而，修飾DNA聚合酶技術(shù)仍處于起步階段，需要進一步發(fā)展才能將其用于大規(guī)模RNA生產(chǎn)。2mRNA的體外轉(zhuǎn)錄（IVT）IVT（圖1）被認為是大規(guī)模生產(chǎn)mRNADS的金標準方法。IVT依賴于源自噬菌體的RNA聚合酶，在修飾的RNA聚合酶的幫助下，使用化學修飾的三磷酸核糖核苷(rNTP)可實現(xiàn)穩(wěn)健的轉(zhuǎn)錄并促進mRNA合成。但是，存在兩個重要的限制。首先，RNA聚合酶需要一個序列特異性啟動子來啟動轉(zhuǎn)錄，從而防止5'特異性修飾。其次，由于RNA聚合酶的非特異性跑漏，IVTRNA表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄mRNA的末端異質(zhì)性。圖1.IVT和DS純化工藝以及生產(chǎn)DNA模板的上游工藝。首字母縮略詞：IPRPHPLC=離子對反相高效液相色譜；IEX=離子交換層析；AC=親和層析法；TFF=切向流過濾。IVT的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是mRNA生產(chǎn)過程的工藝參數(shù)獨立于模板DNA的序列，允許設計一個通用的生產(chǎn)過程來生產(chǎn)任何目的mRNA，從而有可能加快監(jiān)管部門批準生產(chǎn)新型DS。然而，酶、帽類似物和rNTP等消耗品提高了成本。此外，RNA聚合酶極易發(fā)生氧化失活，從而導致mRNA產(chǎn)物斷裂?？偠灾?，經(jīng)過必要的改進，IVT是當前最先進的技術(shù)，可提供無細胞、經(jīng)濟高效、直接且連貫的技術(shù)，實現(xiàn)臨床使用mRNA的大規(guī)模生產(chǎn)。隨著對GMPmRNA需求的增加，生物制造商正在經(jīng)歷對生產(chǎn)符合GMP規(guī)范的mRNA的快速需求，Aldevron等公司投資建設了新的GMP生產(chǎn)基地。中國在COVID-19mRNA疫苗中的足跡持續(xù)增長，成為在過去兩年中注冊的COVID-19疫苗試驗數(shù)量最多的國家之一。為了支持mRNA技術(shù)在中國的快速發(fā)展，金斯瑞生物宣布在江蘇鎮(zhèn)江開設GMP生產(chǎn)基地，這將是中國最大的商業(yè)GMP設施之一，此設施將使公司的產(chǎn)能翻倍。Part3mRNADS的純化

mRNADS的純化對于實現(xiàn)具有生物活性和治療性的mRNA至關(guān)重要。實驗室規(guī)模產(chǎn)生的mRNA可以使用DNA酶去除DNA進行純化，然后通過氯化鋰沉淀進行分離。但是，需要采用多個復雜的DSP步驟來大規(guī)模純化臨床級mRNA。層析法被認為是生物制藥行業(yè)用于純化工藝的標準DSP方法，并因其適應性、可放大性和經(jīng)濟可行性而被廣泛接受。尺寸排阻層析(SEC)可提供對mRNA的穩(wěn)健純化；然而，它受限于無法分離相似大小的RNA。同樣，離子交換層析、親和層析和離子對反相層析促進高效的大規(guī)模RNA純化并提高產(chǎn)量。切向流過濾(TFF)有助于去除較小的污染物并濃縮DS，以及沉淀反應，促進mRNA的快速純化。盡管如此，DSP的成本和效率在很大程度上取決于各個制造商設計的特定產(chǎn)品純化工藝。Part4RNA-LNPDP制劑的挑戰(zhàn)和機遇

將RNADS制劑成LNPDP對功效至關(guān)重要，因為帶電核酸自發(fā)穿過脂質(zhì)雙層進入具有生物活性的細胞質(zhì)的可能性很低。目前的方法涉及通過基于乙醇沉淀的連續(xù)自組裝LNP與水性緩沖液中的核酸混合，致使核酸包封。最初的報告并未具體說明混合方法，但通過T形接頭混合已被認為是一種可放大的方法。為確保靜電負載，含有RNA的水相的pH值緩沖低于可電離脂質(zhì)的表觀pKa。細胞內(nèi)核酸遞送的機制發(fā)生了變化：陽離子脂質(zhì)復合物破壞細胞膜以使核酸進入細胞質(zhì)，而含有膽固醇的可電離LNP通過內(nèi)源性受體介導的內(nèi)吞途徑進入細胞，并在酸化后介導核酸從內(nèi)體釋放。這些LNP被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)小干擾RNA(siRNA)活性方面比通過預制囊泡法產(chǎn)生的產(chǎn)品活性更強。脂質(zhì)膜水合一直是生產(chǎn)LNP的傳統(tǒng)方法，其中使用含有核酸的水性緩沖液用于被動封裝治療藥物，這通常會導致較大的異質(zhì)性囊泡(>100nm)，這需要下游粒徑減小方法，例如超聲處理，以減小囊泡尺寸。缺乏控制、再現(xiàn)性以及要求額外的下游工藝限制了該方法的放大潛力。近十年來，多篇文獻報道了使用微流控混合方法來制劑用于癌癥治療、蛋白質(zhì)替代療法、基因編輯和RNA疫苗的RNA-LNP。微流控能夠?qū)崿F(xiàn)水相和有機相的非湍流混合，以控制自組裝。該技術(shù)已被證明可以從用于實驗室規(guī)模制劑開發(fā)的微升級別放大到升級規(guī)模，后者可與在線分析方法集成，實現(xiàn)集成生產(chǎn)車間的重要一步。從歷史上看，交錯人字形混合器(SHM)被廣泛使用，利用數(shù)十ml/min的典型流速，這比典型的流體動力流動聚焦裝置快一個數(shù)量級。然而，交錯的人字形結(jié)構(gòu)增加了多維依賴性和實際限制，使其難以實現(xiàn)GMP規(guī)范要求的吞吐量速度，這導致需要并行排列多個SHM混合器，以實現(xiàn)更高的吞吐量，同時保持相同的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，例如粒徑、PDI和封裝效率。微流控混合器的創(chuàng)新引入了下一代環(huán)形混合器(TrM)，該類混合器保留了SHM的非湍流平流混合，但通過增加混合器尺寸，可使單個混合器的流速達到更高的級別（200mL/minvs.12mL/min），同時保持RNA-LNP的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。這保持了與發(fā)現(xiàn)和臨床前規(guī)模生產(chǎn)的兼容性，并簡化了工藝放大。mRNA-1273和BNT162b2如何生產(chǎn)用于臨床前和臨床開發(fā)物料的細節(jié)尚未完全公開；然而，Moderna發(fā)表了大量利用微流控SHM技術(shù)和乙醇-滴納米沉淀的研究，描述BNT162b2的非人類靈長類動物研究的文章表明，LNP是通過將脂質(zhì)的乙醇溶液通過洗濾轉(zhuǎn)移到水性緩沖液中形成的。Part5、未來展望

1自擴增RNA：減少RNA生產(chǎn)負擔的平臺與mRNA一樣，自擴增RNA(saRNA)不僅包含一個5'帽、一個poly-A尾以及5'和3'非翻譯區(qū)，而且還編碼形成復制酶的非結(jié)構(gòu)蛋白，以便在細胞內(nèi)遞送時進行擴增。直接比較使用相同配方的mRNA和saRNA疫苗的研究有限。在Vogel等人和Brito等人的研究中，發(fā)現(xiàn)saRNA的效力至少是mRNA的64倍。同樣，在直接研究SARS-CoV-2制劑時，我們將mRNA和saRNA與臨床前/臨床試驗中使用的相同制劑進行比較，發(fā)現(xiàn)saRNA的效力比mRNA高6-100倍。為了量化mRNA疫苗與saRNA疫苗相比的體積放大需求，假設mRNA和saRNA的IVT在相同體積和封裝效率下產(chǎn)生相同的質(zhì)量產(chǎn)量。在顆粒生產(chǎn)之后，mRNA和saRNA假定導致相同的純化效率且產(chǎn)量與體積成線性關(guān)系。根據(jù)上述研究，生產(chǎn)saRNA所需的RNA減少了6到100倍，并且由于氮/磷酸(N/P)比率保持不變，因此脂質(zhì)減少了6到100倍。因此，在大流行的情況下，理論上有可能以相同的批量生產(chǎn)6到100倍的疫苗劑量，從而降低生產(chǎn)成本和所需時間。為了強調(diào)saRNA疫苗的優(yōu)勢，我們比較了Pfizer/BioNTechmRNA疫苗和saRNA疫苗的體積放大要求。每劑Pfizer/BioNTechCOVID-19疫苗包含0.3mL，目前價格為19.50美元。假設人口總數(shù)為77億人，每人接種兩劑，總共需要154億劑或450萬升疫苗。從長遠來看，450萬升將填滿兩個奧林匹克規(guī)模的游泳池，而我們假設效力高出100倍的saRNA疫苗只需要0.02個奧林匹克規(guī)模的游泳池。假設生產(chǎn)成本（包括材料、RNA和LNP生產(chǎn)）呈線性增長，使用Pfizer/BioNTech的mRNA疫苗為整個人群接種疫苗將花費大約1500億美元。相比之下，使用saRNA，它只需花費大約15億美元。最終，使用saRNA生產(chǎn)疫苗可能會大大降低生產(chǎn)和成本負擔。2對RNA-LNP不斷演變的商業(yè)生產(chǎn)模式的觀點目前，大規(guī)模、集中式生產(chǎn)是治療藥物開發(fā)的現(xiàn)狀。由于藥品生產(chǎn)必須符合高質(zhì)量和安全標準，因此每個站點都必須具備滿足這些要求的知識、熟練的勞動力和基礎(chǔ)設施。隨著RNA的進一步發(fā)展，針對特定疾病基因型量身定制的、更加個性化藥物的趨勢也將加強。這種趨勢允許實現(xiàn)針對一小部分人群有效的治療，并且可以想象針對個人的治療。此外，尤其是在大流行期間，由于封鎖可能會出現(xiàn)供應鏈挑戰(zhàn)，如由于健康問題導致的勞動力減少以及旅行限制導致全球必要藥物供應的嚴重中斷，此外，小瓶、過濾器和注射器等產(chǎn)品的短缺都代表了前所未有的疫苗生產(chǎn)需求。圖4所示為一張公開宣布參與生產(chǎn)Moderna和Pfizer/BioNTech的SARS-CoV2mRNA疫苗的工廠的地圖。這兩種疫苗都依賴于位于美國和歐洲大陸的不同生產(chǎn)網(wǎng)絡。由于生產(chǎn)僅限于這兩個地區(qū)，這些疫苗的全球供應是從相對較少的跨國灌裝站點分發(fā)的。作為回應，包括澳大利亞、加拿大、中國、新加坡、南非和韓國在內(nèi)的幾個國家宣布了計劃和合作伙伴關(guān)系，以實現(xiàn)mRNA藥物的國內(nèi)生產(chǎn)。分散的生產(chǎn)方法將允許藥品生產(chǎn)商生產(chǎn)藥品，用于滿足當?shù)鼗蚶硐肭闆r下個人的特定需求。這種被稱為精準醫(yī)療的模型將特定患者的基因和生活方式納入療法，以提高安全性和有效性，同時減少副作用。雖然目前的生產(chǎn)不適合區(qū)域性生產(chǎn)，但規(guī)模更小、分散的生產(chǎn)基地將允許采用更加個性化的療法開發(fā)方法。這對于基于RNA的藥物來說是可以實現(xiàn)的，其中Kis等人最近的一項研究表明，RNA疫苗生產(chǎn)工藝可能比傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)工藝規(guī)模小2到3個數(shù)量級。盡管擁有多個分散的生產(chǎn)基地有潛在的好處，但這種方法需要對監(jiān)管框架進行重大改變。目前，安全性是根據(jù)大量試驗參與者的統(tǒng)計信息進行評估的。全球只有少數(shù)幾家公司獲得了生產(chǎn)基于RNA的藥物的知識和知識產(chǎn)權(quán)，分散模式可能會受到訓練有素的勞動力的區(qū)域可用性和知識分布的限制。此外，區(qū)域性疫苗生產(chǎn)中心的初始成本高于一個大型中心，因為每條生產(chǎn)線都需要一整套設備，包括分析、下游、灌裝能力，這些設備通常以集中模式共享。如果沒有集中生產(chǎn)提供的規(guī)模經(jīng)濟，分散設施可以通過生產(chǎn)多個DP來實現(xiàn)更經(jīng)濟的模式。這種方法利用了多個DP通用的模塊化技術(shù)、工藝和程序，從而分攤了基礎(chǔ)設施、原材料、人力資源和開發(fā)的成本。mRNA療法特別適合這種模型，因為mRNA核苷酸的序列可以大幅改變，同時保持DS的整體化學性質(zhì)。圖2說明了如何使用共享資源生產(chǎn)各種RNADS，以產(chǎn)生覆蓋各種適應癥的一系列RNADP。圖2.RNA藥物的多產(chǎn)品生產(chǎn)：示意圖說明了適用于各種RNA療法的典型生產(chǎn)過程，表明共享的工藝、技術(shù)和資源。隨著更多RNA療法的出現(xiàn)，資源和成本分攤有助于降低成本，使個體化療法更加可行?，F(xiàn)有或正在建設的RNA疫苗設施可以生產(chǎn)其它RNA藥物，從而提高其它基因和細胞療法的生產(chǎn)能力。圖2代表了一家RNA藥物生產(chǎn)代工廠，它類似于徹底改變計算機和集成電子行業(yè)的半導體代工廠。最初，計算機處理器設計與針對特定計劃開發(fā)的專有生產(chǎn)工藝相關(guān)聯(lián)，生產(chǎn)僅限于少數(shù)制造商。通過引入采用標準化制造工藝的半導體代工廠，其適用于生產(chǎn)任意數(shù)量的電路設計，將芯片設計與生產(chǎn)能力和基礎(chǔ)設施分離。這種“民主化”的半導體芯片設計使無晶圓廠半導體公司引發(fā)了創(chuàng)新和市場競爭的爆炸式增長。RNA藥物代工廠的概念由一次性生物反應器、微流控和在線分析能力等模塊化生產(chǎn)技術(shù)實現(xiàn)，代表著使未來RNA藥物的設計“民主化”的潛力。近期的主要瓶頸。由于COVID-19，在SARS-CoV-2基因組序列發(fā)表63天后，Moderna進入臨床試驗，mRNA療法更快的速度顯而易見。盡管開發(fā)過程迅速，但為了滿足全球需求，公司在疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)方面遇到了挑戰(zhàn)。在這種情況下，獲得充足的脂質(zhì)供應，以將mRNA遞送到體內(nèi)發(fā)揮作用，將具有不小的挑戰(zhàn)性。例如，Pfizer-BioNTech針對10億人的疫苗（20億劑疫苗）需要近1.5噸的總脂質(zhì)，這代表了脂質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)的顯著增加，以滿足全球疫苗需求。特別是，專有的可電離陽離子和PEG脂質(zhì)具有復雜的合成步驟，需要專業(yè)的生產(chǎn)知識。在全球范圍內(nèi)，生產(chǎn)脂質(zhì)的地方很少，Pfizer與Croda簽訂了為期5年的脂質(zhì)供應協(xié)議，BioNTech與Evonik和MerckKGaA達成了協(xié)議，而CordenPharma則為Moderna供應脂質(zhì)。mRNA生產(chǎn)是另一個主要障礙；例如，Pfizer-BioNTech、Moderna和CureVac疫苗分別需要60kg、200kg和24kgmRNA才能為10億人接種疫苗。一項關(guān)于生產(chǎn)mRNA疫苗技術(shù)經(jīng)濟可行性的研究表明，疫苗的年生產(chǎn)量在很大程度上取決于RNA劑量，并舉了一個引人注目的例子：通過將劑量從1μg減少到0.1μg，生產(chǎn)80億劑疫苗的時間可以從2.6個月