被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和電刺激對(duì)大鼠骨鈣素和抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的影響

被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和電刺激對(duì)大鼠骨鈣素和抗酒石酸鹽酸性磷酸酶的影響

根據(jù)近年來的研究，大鼠失神經(jīng)控制可導(dǎo)致扔掉骨瘦如柴。廢用性骨質(zhì)疏松癥是指由于長(zhǎng)期臥床、制動(dòng)或失重而導(dǎo)致骨量減少,骨細(xì)微結(jié)構(gòu)退化致骨脆性增加,易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼系統(tǒng)疾病,屬繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的一種特殊類型。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠失神經(jīng)方法制造廢用性骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型,通過對(duì)失神經(jīng)大鼠骨代謝生化指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)及干預(yù)的研究,探討被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和電刺激治療對(duì)大鼠失神經(jīng)所致廢用性骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。1材料和方法1.1研究主題從四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買50只2月齡純種健康雄性SD大鼠,體重為(208.4±13.44)g。1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1大鼠分組及標(biāo)記方法馴化喂養(yǎng)7d后將50只大鼠分別稱體重,按隨機(jī)設(shè)計(jì)法,將大鼠分成A、B兩組,其中A組10只為假手術(shù)組(Sham組),B組40只為造模組,待手術(shù)造模。造模后40只大鼠按完全隨機(jī)法分為去神經(jīng)組(Denervationgroup,DG);去神經(jīng)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組(Passivemovementgroup,PMG);去神經(jīng)電刺激組(Electricstimulationgroup,ESG);去神經(jīng)混合干預(yù)組(Passivemovementandelectricitystimulationgroup,PMESG)4組,每組各10只,各組內(nèi)依次編號(hào)并用不同顏色的記號(hào)筆做好標(biāo)記。所有大鼠自由進(jìn)食、飲水。1.2.2假手術(shù)組的制備B組造模組大鼠在3%的戊巴比妥鈉(25mg/kg)麻醉下,先將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái),以碘伏將左后肢股骨近段和尾部近段消毒鋪巾,觸摸到股骨大轉(zhuǎn)子后,在大腿后方靠近尾部行長(zhǎng)約1cm的切口,逐層分離,在半腱肌、半膜肌和股二頭肌之間找到左側(cè)坐骨神經(jīng),靠近上段予以切除5mm,并將神經(jīng)斷端打結(jié)處理以預(yù)防斷端包塊的形成,然后縫合切口;再置大鼠于仰臥位,正中縱切口,于腹股溝韌帶水平切斷大鼠左側(cè)股神經(jīng),游離遠(yuǎn)端5mm,同樣將神經(jīng)斷端進(jìn)行打結(jié)處理,并縫合切口。假手術(shù)組只分離顯露坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)后縫合切口,最后肌注慶大霉素(4mg/100ml)0.1ml,以預(yù)防感染。每天用酒精棉球和碘酒擦拭傷口,直至傷口愈合。1.2.3術(shù)后活動(dòng)周期去神經(jīng)支配手術(shù)分組后6h內(nèi),對(duì)PMG和PMESG組大鼠行去神經(jīng)肢體的被動(dòng)牽引。將大鼠置于自制的網(wǎng)夾內(nèi),拉出左后肢,抓住趾部,與脊柱呈45°向后外方牽拉,直至左后肢完全伸直(膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)均伸直),然后再向與牽拉方向相反的方向,將左后肢推向身體使之完全屈曲緊貼身體(膝關(guān)節(jié)完全屈曲,踝關(guān)節(jié)完全背屈),如此一個(gè)往復(fù)為一個(gè)周期。2次/d,5min/次,每側(cè)后肢每天共活動(dòng)600個(gè)周期。整個(gè)過程中動(dòng)作輕柔,速度適中,全關(guān)節(jié)幅度活動(dòng),以傷口不滲血為度。1.2.4神經(jīng)電刺激試驗(yàn)ESG與PMESG組在去神經(jīng)支配手術(shù)分組后6h開始電刺激治療,將大鼠置于自制的網(wǎng)夾內(nèi),以拉出左后肢,大鼠左小腿硫化鋇脫毛后,以雙層生理鹽水浸濕紗布包裹,采用JNR22型神經(jīng)肌肉康復(fù)儀進(jìn)行電刺激,將電極固定于皮膚表面,正極置于肢體近側(cè)(左股骨大轉(zhuǎn)子部與尾骨尖之間),負(fù)極置于遠(yuǎn)側(cè),正負(fù)兩極距離為8mm,刺激頻率為2Hz,刺激電壓為20~25V,強(qiáng)度以見到肌肉明顯收縮為標(biāo)準(zhǔn),每次刺激時(shí)間15min,上下午各1次。1.2.5去血、去血、留血實(shí)驗(yàn)6周后,各組在安靜狀態(tài)下稱重。所有動(dòng)物股動(dòng)脈放血處死,處死時(shí)由大鼠股動(dòng)脈取血,用離心管接取血液,在室溫下靜置2h后,于低速離心機(jī)離心,速度3000r/min,留取血清,置冰箱內(nèi)-20℃冷凍保存。1.2.6抗酒石酸鹽酸性磷酸酶試劑盒的制備血漿抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(Tartrate-resistantacidphosphatase,TRACP)運(yùn)用722型可見光分光光度計(jì)(上海精密儀器廠生產(chǎn))在成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理中心實(shí)驗(yàn)室測(cè)出,抗酒石酸鹽酸性磷酸酶試劑盒由上海麥莎生物科技有限公司提供,操作步驟根據(jù)使用說明書。骨鈣素(Boneglaprotein,BGP)采用雙位點(diǎn)免疫放射法(IR-MA),骨鈣素放免分析試劑盒由北京中國原子能科學(xué)研究院提供,操作步驟根據(jù)使用說明書。1.2.7數(shù)據(jù)處理及分析所有指標(biāo)均以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)理統(tǒng)計(jì)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5進(jìn)行單因素方差分析(One-wayANOVA),組間相互比較采用LSD法,對(duì)F值明顯的指標(biāo),用t檢驗(yàn)對(duì)各組均值進(jìn)行多重比較。2結(jié)果2.1大鼠反應(yīng)情況大鼠手術(shù)后30min左右清醒,左后肢無主動(dòng)屈伸功能,后爪屈曲,以腳掌支持體質(zhì)量,軀體重心減低并前移,前進(jìn)時(shí)以臀部和左肢肌群幫助行走,后退時(shí)靠腰腹部肌群收縮代償,手術(shù)后大鼠活動(dòng)量明顯減少。被動(dòng)牽引和電刺激3d后,大鼠足部腫脹減退,活動(dòng)量逐漸加大。2.2各組大鼠骨骼代謝生化指標(biāo)的比較2.2.1兩組bgp值的比較由表1可以看出,其他各組BGP值較假手術(shù)組均呈非常顯著性降低(P<0.01);與對(duì)照組比較,各干預(yù)組BGP值均明顯升高,其中混合干預(yù)組呈顯著性升高(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各干預(yù)組組間比較,混合干預(yù)組較單獨(dú)干預(yù)組BGP值雖然增加,但不具顯著差異性(P>0.05)。由表2可以看出,與假手術(shù)組比較,除對(duì)照組TRACP值顯著性升高外(P<0.01),其余各組也表現(xiàn)為升高,但差異不具顯著性(P>0.05);與對(duì)照組比較,各組大鼠TARP值均呈非常顯著性降低(P<0.01);被動(dòng)運(yùn)動(dòng)、電刺激、混合干預(yù)組各組間比較未見明顯差異(P>0.05)。3不同電刺激治療對(duì)小鼠骨的影響功能血清BGP由成骨細(xì)胞合成,是骨組織內(nèi)非膠原骨蛋白的主要成分,它是反映成骨細(xì)胞活性、骨轉(zhuǎn)換和骨形成的特異指標(biāo)。血中BGP與骨內(nèi)BGP含量呈密切正相關(guān)關(guān)系,測(cè)定血中骨鈣素濃度可以反映骨組織中骨鈣素水平。Delamas認(rèn)為當(dāng)骨形成與骨吸收耦聯(lián)時(shí),BGP是反映骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo);當(dāng)骨形成與骨吸收解藕聯(lián)時(shí),BGP是反映骨形成的特異指標(biāo)。研究亦發(fā)現(xiàn),血中BGP水平與骨的形態(tài)計(jì)量測(cè)定的骨形成指標(biāo)呈正相關(guān)。血清骨鈣素水平在高骨代謝患者中表現(xiàn)為升高。TRACP是酸性磷酸酶的第5型同工酶,主要由骨吸收功能細(xì)胞———多核破骨細(xì)胞釋放,具有很高活性,是破骨細(xì)胞功能的重要標(biāo)志,它的活性與破骨細(xì)胞呈正相關(guān)。因此可以作為鑒定骨吸收的重要指標(biāo),血清中TRACP水平能很好反映出破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,各干預(yù)組BGP值均呈非常顯著性降低(P<0.01);與對(duì)照組比較,各干預(yù)組BGP值均明顯升高,其中混合干預(yù)組呈顯著性升高(P<0.05);同時(shí)與假手術(shù)組比較,各干預(yù)組TRACP表現(xiàn)為升高,但差異不具顯著性(P>0.05);與對(duì)照組比較,各干預(yù)組TRACP均呈非常顯著性降低(P<0.01)。眾多實(shí)驗(yàn)表明,運(yùn)動(dòng)能夠防治廢用性骨質(zhì)疏松。自1989年Woff定律提出以來,已有大量研究表明負(fù)重和運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)骨形成。國外文獻(xiàn)率先報(bào)道了運(yùn)動(dòng)與廢用性骨質(zhì)疏松的關(guān)系。1948年Abrams就指出運(yùn)動(dòng)能防止截癱所致骨質(zhì)疏松。Freeman報(bào)道運(yùn)動(dòng)甚至靜立都可對(duì)預(yù)防和康復(fù)骨質(zhì)疏松有明顯作用,然而早期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)預(yù)防和減輕骨質(zhì)疏松的重要性,并沒有引起人們的廣泛重視。早期運(yùn)動(dòng)使肌肉收縮活動(dòng)產(chǎn)生對(duì)骨的壓力,可以刺激骨形成,減少骨礦物質(zhì)的損失。鐘紹芬研究發(fā)現(xiàn):早期運(yùn)動(dòng)治療組發(fā)生骨質(zhì)疏松癥病人低于非運(yùn)動(dòng)對(duì)照組,說明早期運(yùn)動(dòng)能有效地預(yù)防和減輕外傷后長(zhǎng)期臥床引起的骨質(zhì)疏松癥。電刺激對(duì)成骨細(xì)胞有增殖作用,能影響骨的代謝和重建,達(dá)到抑制骨衰退和逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥的作用。根據(jù)骨生長(zhǎng)與骨重建的力電理論,周圍神經(jīng)功能性電刺激可以產(chǎn)生類似于負(fù)重鍛煉或重力刺激所產(chǎn)生的骨壓電效應(yīng),進(jìn)而影響骨重建平衡,使骨形成大于骨吸收,有利于提高骨量和改善骨的結(jié)構(gòu)。李明等曾報(bào)道:大鼠在切斷坐骨神經(jīng)后,予以6KHz中頻電流連續(xù)刺激12d顯示,大鼠脛骨平均干、濕、灰重等指標(biāo)與正常組無明顯差異。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,電刺激組骨形成指標(biāo)BGP值顯著性升高(P<0.05),骨吸收指標(biāo)TRACP活性顯著性降低(P<0.05),也說明了電刺激能有效促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收。這與最近國外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。張遠(yuǎn)華臨床研究報(bào)道早期接受功能性電刺激治療可緩解截癱后骨鈣的丟失,而對(duì)于已經(jīng)發(fā)生的骨質(zhì)疏松則無法使其完全逆轉(zhuǎn)。被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和電刺激,是臨床康復(fù)中預(yù)防肌肉萎縮和保持關(guān)節(jié)活動(dòng)度的常用方法,而兩種方法對(duì)失神經(jīng)支配后,是否能有效地保持一定骨量尚未明確。過去研究認(rèn)為,通過電刺激可對(duì)骨產(chǎn)生壓電效應(yīng),使骨處于一定的應(yīng)力環(huán)境中。被動(dòng)運(yùn)動(dòng)則可能通過機(jī)械牽伸影響骨的微循環(huán)。然而被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和電刺激預(yù)防廢用性骨質(zhì)疏松的