cab法提取紅麻總dna技術的改進

cab法提取紅麻總dna技術的改進

提取微生物矩陣dna是通過基因操作和遺傳分析進行的基礎，關系到分子標記的改善和質量。最初總DNA的提取方法是先將核蛋白體提取出來,然后再從核蛋白體上提取出DNA,這種方法稱為兩步法目前,植物總DNA的提取方法主要有兩種:即CTAB法及SDS法。SDS法操作簡單、溫和,但所得DNA含糖類雜質較多。CTAB法的最大優(yōu)點是能很好地消除糖類雜質,所以對于麻類作物含酚類物質及糖類物質較高的植物材料,采用CTAB法是比較理想的;該方法的另一個優(yōu)點是在提取的前期能得到高含量的DNA與RNA,可根據實驗的需要,分別進行純化,如只需要DNA則可用RNaseA水解掉RNA紅麻葉片中含有大量的單寧、酚類、果膠、多糖及色素,蛋白質含量也較高,較難提取出高質量的DNA。而且越老的葉片中這些雜質含量越高,易與DNA結合形成粘稠的膠狀復合物,既難溶解又影響PCR擴增效果。紅麻基因組DNA的提取質量對以PCR為基礎的ISSR、SRAP新型分子標記的效果有重要影響。如果提取DNA純度較差,不但容易導致本身的降解,而且無法擴增出條帶。同一種方法提取不同的植物材料效果也不同,所以必須優(yōu)化一種適合特定作物的總DNA提取的最佳方法,才能獲得理想的分子標記效果。為此筆者總結了周東新1材料和方法1.1試驗材料以紅麻福紅952、福紅2號、金光1號、粵743、H029、非洲裂葉等六個品種的嫩葉為材料。1.2測試試劑1.3離心+大量的提取采集供試紅麻品種苗期幼嫩葉片,稱取不帶水珠葉片5.0g,供研磨提取之用。倒入足量的液氮一次性把嫩葉研磨成粉末(保持研磨的葉片粉末不融化),迅速裝入50ml離心管后,先加入200~250mlβ-巰基乙醇,再加入15ml提取緩沖液混勻,置于4℃冰箱中保存,直到研磨完所有的樣品。加入在65℃下預熱的15%CTAB2.5ml,輕輕混勻,在65℃水浴30~40min,冷卻至室溫。加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1),溫和上下顛倒離心管20~30次,8000rpm室溫離心10min或者4000rpm室溫離心20min,充分離心可確保雜質的有效分離。取上清,轉入新的離心管,并加等體積的氯仿/異戊醇(24:1),重抽提1次,取上清,加等體積的冰冷無水乙醇,溫和顛倒3~5次,直至絮狀沉淀集結,在冰上或者室溫靜置30min~1h。鉤出絮狀的DNA沉淀,轉入1.5ml離心管中,用70%乙醇漂洗2次。在超凈工作臺吹干后加500mlTE(含10mg/mlRNaseA),65℃水浴溶解20min或室溫溶解一天。加等體積的氯仿/異戊醇(24:1),溫和上下顛倒離心管30~50次,4℃,12000rpm離心,10min,取上清,加2倍體積的冰冷無水乙醇,靜置5min,沉淀DNA;4℃,8000rpm離心,5min,棄上清。此步能對DNA起純化作用。用70%乙醇漂洗DNA沉淀2~3次,在超凈工作臺上風干,溶于TE中,于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.4srap反應程序ISSR和SRAP反應的條件:10×Buffer(MgISSR反應程序為:94℃預變性5min;94℃變性45s,55℃退火1min30s,72℃延伸1min30s,36個循環(huán);72℃延伸10min。SRAP反應程序為:94℃預變性5min;94℃變性1min,35℃退火1min,5個循環(huán);94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min30s,35個循環(huán);72℃延伸10min。4℃保存。2結果與分析2.1dna的產率采用改進后的CTAB法提取的DNA質量經紫外分光光度計檢測,結果如表1所示。從表1檢測結果顯示,6個品種的樣品DNA的平均產率達86.5%,品種樣品間雖有一定的差異,半數樣品產率達92.5%以上。由此可見,采用優(yōu)化后的技術所提取的紅麻基因組DNA具有產率高、質量好的優(yōu)點。2.2種濃度ctab緩沖液對小鼠dna的降解作用用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的紅麻總DNA,并用1.5%,2.5%和4%三種不同濃度CTAB提取緩沖液,所提取的DNA質量結果如圖1所示。從圖1可以看出,三種濃度CTAB緩沖液提取的DNA質量明顯不同,即在凝膠底部都出現了不同程度的小片斷產物(主要是降解的小分子DNA和RNA)。三種CTAB濃度相比較,1.5%提取的質量和數量較差(圖1的1、2泳道),而4%CTAB濃度提取可導致DNA降解(如圖1的7泳道),采用2.5%CTAB提取的效果較理想(如圖1的3、4泳道),經過RNaseA消化RNA和進一步純化,即可獲得質量較高的DNA(如圖1的3、4泳道)。2.3pcr擴增效果分析本研究PCR擴增及ISSR和SRAP分析電泳如圖2和圖3所示。從圖2和圖3可知,本研究采用改進后的CTAB法應用于紅麻種質資源ISSR和SRAP分子標記分析,實驗以提取的紅麻H060、H070、H076、H094、H098、H0102六份材料基因組DNA(編號分別是1~6)為模板,分別進行ISSR和SRAP分子標記實驗,電泳獲得了圖2和圖3的結果。從圖中可以看出,采用改進后的CTAB法,無論是瓊脂糖電泳或聚丙烯酰氨電泳,所提取的總DNA質量都可以獲得理想的電泳效果,具有條帶清晰、多態(tài)性豐富等特點?？蓾M足ISSR和SRAP兩種分子標記對紅麻材料間的遺傳多態(tài)性與親緣關系分析要求。由圖2和圖3還看出,本研究以2.5%的CTAB緩沖液提取的DNA作為模板,以ISSR引物816進行PCR擴增效果較理想,其條帶清晰、穩(wěn)定,引物可擴增出多態(tài)條帶。若以其他濃度的CTAB提取緩沖液則PCR結果不理想,甚至沒有結果,同樣的以2.5%的CTAB緩沖液提取的DNA為模板,以SRAP引物組合Me4Em1進行PCR擴增,同樣獲得理想的結果。而SRAP可擴增出比ISSR更豐富的多態(tài)性條帶。3討論3.1關于dna提取應注意的問題3.1.1細胞破碎法植物細胞具有細胞壁,在基因組總DNA提取時,如何使植物細胞壁有效破碎的同時,盡量保持DNA的完整性,是DNA高質量提取的重要技術環(huán)節(jié)。許多細胞破碎的方法都會引起DNA嚴重的機械斷裂,從而導致植物DNA提取時較難在產品的質量(長度)及產率之間都達到滿意的結果。在加入蛋白酶的同時加入β-巰基乙醇可使細胞壁破裂的效果更好3.1.2內源dnase在樣品研磨成粉后至加入提取緩沖液前必須保持其冷凍狀態(tài),如果融化,內源DNase會引起DNA的降解,嚴重影響提取效果。研磨的葉片比較幼嫩不宜加入PVP,因為有以β-巰基乙醇為抗氧化劑,加入PVP會影響研磨效果。3.1.3輔助提取dna提取操作應避免劇烈振蕩,物理因素主要是機械剪切力,溶液在震蕩、攪拌、轉移、反復凍融、滲透壓驟變及細胞急劇破裂內容物外泄都會產生強的機械剪切力,因而提取時的各種操作均應溫和地進行,避免劇烈震蕩。轉移DNA溶液的槍頭要剪去尖部,擴寬管口,吸取過程中避免產生氣泡,不可用反復吸打的方法助溶DNA沉淀。應盡可能避免重復的凍融步驟。3.1.4清潔和滅菌為防止DNase的降解作用,提取時使用的器具、研缽、離心管、溶液乃至植物材料等都要清潔,溶液及用品要經過高溫高壓滅菌。由于DNase是以Mg3.1.5離心溫度及離心溫度一般要用4000r/min,室溫離心20min,如果轉速不夠或者時間過短,將會產生過多的雜質。如葉綠素、雜蛋白質等其他大分子,離心溫度過低會導致CTAB沉淀,將DNA-CTAB沉淀及DNA用離心的方法分離出來時,注意離心強度不要太強,否則沉淀過分壓緊,這種沉淀極難重新溶解。最后干燥除去乙醇時,時間不要太長,過強離心會導致DNA難溶于TE。3.1.6乙醇沉淀dna選用預冷的無水乙醇沉淀DNA效果較好,室溫下用乙醇沉淀DNA時,只能有選擇地沉淀大分子量DNA,因此如果在DNA得率足夠的情況下,可以在室溫下用乙醇沉淀。另外,異丙醇不易揮發(fā),最好用70%的乙醇多洗幾次3.2分子標記的使用模板DNA的質量是PCR擴增成功的關鍵,不但影響擴增條帶的清晰度,也可影響分子標記的多態(tài)性。本研究所建立的DNA提取優(yōu)化技術,應用于ISSR和SRAP分子標記PCR擴增,可擴增出明顯的多態(tài)性條帶和較高的多態(tài)性比率,獲得較理想的效果。一般而言,用本法提取的紅麻基因組總D