氯霉素分子印跡聚合物固相微萃取課件

主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容結(jié)果與討論3研究背景12研究背景

氯霉素（CAP）是一種廣譜抗生素，因其具有抗菌性強(qiáng)、藥性穩(wěn)定、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但CAP又有抑制人體骨髓造血功能而導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用，故動(dòng)物性食品和水產(chǎn)品中的CAP殘留對(duì)人類健康構(gòu)成極大的威脅。歐盟和美國(guó)均在食品法規(guī)中規(guī)定CAP的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，隨著食品安全越來(lái)越受到世界各國(guó)及相關(guān)國(guó)際組織的日益關(guān)注，對(duì)動(dòng)物性食品中氯霉素的檢測(cè)技術(shù)也提出了更高的要求。由于獸藥殘留分析屬?gòu)?fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析技術(shù)，待測(cè)物質(zhì)濃度低，樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多,所以需要對(duì)樣品進(jìn)行分離純化和富集。整體柱(monolithcolumn)是1989年首次提出的，其制備簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定，具有比表面積大、通透性好、傳質(zhì)速度快的優(yōu)點(diǎn)。將整體柱應(yīng)用于樣品預(yù)處理，可以提高萃取容量和萃取效率，縮短萃取時(shí)間；也可應(yīng)用于水溶液樣品的提取，生物兼容性好。分子印跡技術(shù)選擇性高，去除基質(zhì)干擾效果好，是殘留分析研究領(lǐng)域的一個(gè)新的發(fā)展方向。鑒于分子印跡技術(shù)的高選擇性和整體材料的諸多優(yōu)點(diǎn)，二者結(jié)合起來(lái)是一個(gè)必然的發(fā)展趨勢(shì)，即分子印跡聚合物整體柱技術(shù)。

本文以CAP為模板分子，通過(guò)對(duì)分子印跡聚合物整體柱合成條件的優(yōu)化，首次在小移液槍槍頭里獲得了對(duì)CAP有選擇性提取的分子印跡聚合物整體微柱。并將該整體柱應(yīng)用于食品中CAP的分離富集，建立了牛奶中CAP的分析方法，具有選擇性高、富集倍數(shù)和回收率高的優(yōu)點(diǎn)。整體柱所謂整體柱,又稱為棒狀柱、連續(xù)床層、無(wú)塞柱，是一種用有機(jī)或無(wú)機(jī)聚合方法由單體、引發(fā)劑、致孔劑等混合物在色譜柱內(nèi)進(jìn)行原位聚合的連續(xù)床固定相。這種色譜柱制備方法簡(jiǎn)單,由于使用了聚合方法可以往固定相中引入各種可能的作用基團(tuán)，有十分多變的靈活性，同時(shí)用原位聚合制得的整體色譜柱要比常規(guī)裝填的色譜柱具有更好的多孔性和滲透性，具有灌注色譜的特點(diǎn)，即色譜柱中既有流動(dòng)相的流通孔又有便于溶質(zhì)進(jìn)行傳質(zhì)的中孔（幾十個(gè)納米）。因而可以對(duì)生物大分子進(jìn)行快速分離，而且色譜柱的穩(wěn)定性很好。原位聚合法原位聚合法(insitupolymerization)是一種將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑、溶劑按照一定比例混合，然后放在特定的容器(如液相色譜柱、毛細(xì)管柱等)中直接聚合。由于該法得到的聚合物，不需要研磨、過(guò)篩、沉降等繁瑣的處理步驟可以直接用于分析，所以得到了很快的發(fā)展。原位聚合法還可以與一些其他的技術(shù)如膜、整體柱等技術(shù)相結(jié)合，制備分子印跡膜(MIM)、分子印跡整體柱等。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.1

實(shí)驗(yàn)材料：氯霉素(CAP，99.4%)甲砜霉素(TAP，99%)，甲硝唑(MNZ)乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，使用前用NaOH溶液萃取，再用超純水洗后用無(wú)水MgS04干燥）偶氮二異丁腈(AIBN，使用前用無(wú)水乙醇重結(jié)晶)

4-乙烯基吡啶(4-VP，95%)丙烯酰胺(AM)，甲基丙烯酸(MAA)，丙烯酸(AA)分析純甲苯、十二醇、色譜純甲醇、乙腈等。Dionexultimate3000HPLC儀(美國(guó)Dionex公司)蘭格LSP01-1A型注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)移液槍槍頭(4*49，200μL)

2.2CAP-MIP整體柱的制備0.5mmol氯霉素0.2950g十二醇46μL甲苯0.1mmol4-VP

1mmolEGDMA8.5gAIBN混勻超聲4h混勻超聲10min用100μL進(jìn)樣針移取50μL與用甲醇處理過(guò)的一端封口的移液槍槍頭內(nèi)，槍頭用保鮮膜及硅膠封口于60℃反應(yīng)24h

除去保鮮膜及硅膠，剪開(kāi)末端封口，用甲醇將模板分子洗凈后備用。非印跡聚合物整體柱的制備：除不加模板分子外，其余步驟同上。2.3CAP-MIP整體柱吸附性考察

1mL5μg／mLCAP、TAP和MNZ的混合水溶液，以0.2mL／min過(guò)整體柱后，用100μL甲醇洗脫，收集洗脫液直接進(jìn)行HPLC分析，以考察選擇吸附性。分別將一定濃度的CAP(10μg／mL)、TAP(5μg／mL)和MNZ(5μg／mL)的水溶液以0．05mL／min過(guò)整體柱，直到流出液的峰面積與上樣水溶液的峰面積相等，記錄每種物質(zhì)總的上樣體積和流出液的相應(yīng)濃度及體積，以考察吸附容量。

2.4條件優(yōu)化

2.5分子印跡聚合物整體柱固相微萃取過(guò)程將MIP整體柱與醫(yī)用注射器組裝起來(lái)，見(jiàn)圖2-1(b)(c)，取4mL溶液，以0

.2mL/min上樣后，用500此水以0.2mL/min清洗，再用100μL甲醇以0.1mL/min洗脫，洗脫液直接進(jìn)行HPLC分析。微萃取過(guò)程見(jiàn)圖2-1(d)。合成MIP的條件優(yōu)化考察SPME-HPLC分析方法的色譜條件（a）（b）（c）（d）圖2-1分子印跡聚合物整體柱固相微萃取裝置及過(guò)程(a)分子印跡聚合物整體柱，(b)、(c)MIP整體柱與醫(yī)用注射器的組裝，(d)固相微萃取過(guò)程結(jié)果與討論本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件時(shí)均以富集因子(EF)和回收率(ER)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。EF和ER定義如下：EF=

—

ER=—×—×100％=EF×—×100％其中:C0-上樣水溶液的CAP濃度；V0-上樣水溶液的體積；Ct-過(guò)柱后的洗脫液CAP濃度；Vt-過(guò)柱后的洗脫液體積；印跡因子(IF)定義IF=—其中：EFMIP-CAP在CAP-MIP整體柱上的富集因子EFNMIP-CAP在NMIP整體柱上的富集因子CtC0CtC0V0VtV0VtEFMIPEFNMIP選擇性因子（f）定義為：

f1=—f2=—其中:QCAP-CAP在CAP-MIP整體柱上的飽和吸附量

QTAP-TAP在CAP-MIP整體柱上的飽和吸附量QMNZ-MNZ在CAP-MIP整體柱上的飽和吸附量QCAPQTAPQCAPQMNZ3.1合成條件的優(yōu)化3.1.1功能單體種類的選擇圖3-1功能單體種類的影響3.1.2交聯(lián)劑用量的影響圖3-2交聯(lián)劑用量影響從圖可看出當(dāng)CAP：EGDMA=1:20，即EGDMA為lmmol時(shí)CAP-MIP整體柱的選擇性和富集效果最佳。3.1.3功能單體用量的影響圖3-3功能單體用量的影響從圖中可看到當(dāng)CAP與4-VP的比例分別為1:2及1:4時(shí)，CAP-MIP整體柱對(duì)CAP均有較好的富集效果，但當(dāng)二有的比例為1:2時(shí)CAP-MIP整體柱對(duì)CAP的分離選擇性更好。圖3-4CAP-MIP整體柱分子識(shí)別位點(diǎn)的作用原理

因CAP與分子印跡整體柱中的三維空穴在分子大小和形狀上完全匹配，其上的羥基氫原子能與4-VP上的氮原子相作用形成氫鍵而被識(shí)別保留在柱內(nèi)。由于CAP上有兩個(gè)羥基氫原子，4-VP分子上僅有一個(gè)氮原子，即一個(gè)分子CAP恰好能與兩分子的4-VP相作用，與實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。3.1.4溶劑種類的影響表3-1溶劑種類及用量表3-2溶劑的介電常數(shù)及極性圖3-5溶劑種類的影響3.2CAP-MIP整體柱吸附性考察3.2.1CAP-MIP整體柱結(jié)構(gòu)表征圖3-6CAP-MIP整體柱掃描電鏡圖

從圖中可以看到CAP-MIP整體柱上有許多大孔，有利于增加萃取容量和加速待分析物在柱內(nèi)部的傳質(zhì)。3.2.2吸附選擇性考察圖3-7CAP(A)、TAP(B)和MNZ(C)在NMIP和MIP整體柱上的吸附性能比較1、2、3分別為5μg/mLCAP、TAP和MNZ混合溶液直接進(jìn)樣、經(jīng)NMIP萃取后進(jìn)樣和MIP-SPME后進(jìn)樣的色譜圖3.3萃取條件的優(yōu)化3.3.1上樣流速的考察將6mL0.2μg/mLCAP水溶液分別以0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mL/min的流速過(guò)CAP-MIP整體柱，用500μL水以0.2mL/min清洗，再用100μL甲醇洗脫后直接進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)富集因子（EF）與回收率（ER）無(wú)明顯的變化，即上樣流速對(duì)萃取影響不大，考慮到實(shí)驗(yàn)速度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇0.2mL/min。3.3.2清洗液種類及體積的影響圖3-8水中添加不同比例的甲醇做清洗液時(shí)對(duì)富集因子(A)和回收率(B)的影響從圖中可看到，隨著水中甲醇含量的增加，EF和ER均逐漸減小，故選擇純水為清洗液。本實(shí)驗(yàn)還考察了清洗液體積分別為500μL和lmL時(shí)對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EF和ER均無(wú)明顯變化，為了盡量的縮短萃取時(shí)間，選擇清洗液的體積為500μL。EF3.3.3洗脫液種類的影響圖3-9甲醇中添加不同比例的水作洗脫液時(shí)對(duì)富集因子(A)和回收率(B)的影響圖3-10不同比例的甲醇與乙酸作洗脫液時(shí)富集因子(A)和回收率(B)的影響從圖3-9可以看出隨著洗脫液中水比例的增加，EF和ER均降低。從圖3-10可以看出酸度對(duì)萃取效果的影響較小。因此，選擇純甲醇為最佳的洗脫液。3.3.4洗脫液流速的影響圖3-11洗脫液流速對(duì)富集因子(A)和回收率(B)的影響3.3.5上樣體積的影響圖3-12上樣體積對(duì)富集因子(A)和回收率(B)的影響

從圖中可以看出增大上樣體積可以提高富集因子，但回收率卻有所降低。綜合考慮EF、ER及萃取時(shí)間，選擇4mL為最佳上樣體積。3.3.6溶液酸度的影響圖3-13溶液的酸度改變對(duì)富集因子(A)和回收率(B)的影響

CAP在弱酸或中性溶液中較穩(wěn)定，遇堿易分解，故本實(shí)驗(yàn)只考慮酸性和中性條件下的影響。由圖可見(jiàn)，提高溶液的酸度后，萃取效果變差，因此選擇不改變樣品溶液的pH值。3.3.7離子強(qiáng)度的影響圖3-14樣品溶液的離子強(qiáng)度對(duì)富集因子(A)和回收率(B)的影響在上述優(yōu)化的萃取條件下，向溶液中加入不同量的NaCI固體(0-30％(w／v))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察樣品溶液離子強(qiáng)度對(duì)MIPM-SPME效率的影響，由圖可見(jiàn)，離子強(qiáng)度的改變對(duì)EF影響不大，但ER有些許增大?？紤]到加鹽后會(huì)使MIP整體柱的壓力增大，縮短整體柱壽命，而且在不加鹽時(shí)也有很好的回收率，故選擇不改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度。3.4方法的評(píng)價(jià)圖3-15空白牛奶樣品添加CAP(1μg/g)直接HPLC分析(1)和

CAP-MIPM-SPME-HPLC分析(2)色譜圖上圖是牛奶樣品添加1μg/g直接HPLC分析與經(jīng)過(guò)CAP-MIPM-SPME后進(jìn)行HPLC分析的色譜圖。顯然，通過(guò)CAP—MIP整體柱提取富集后牛奶中的基質(zhì)干擾大大降低，且CAP的色譜峰明顯升高，即