基因工程的基本工具和操作程序

基因工程的基本工具和操作程序第1頁/共59頁第2頁/共59頁選修三現(xiàn)代生物科技專題致同學(xué)們專題一基因工程專題二細(xì)胞工程專題三胚胎工程專題四生物技術(shù)的安全性和倫理問題專題五生態(tài)工程第3頁/共59頁異想天開第4頁/共59頁第一講基因工程的基本工具和操作程序

【考綱解讀】考點(diǎn)考綱要求考查角度基因工程的誕生Ⅰ基因工程的理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持；基因工程的三大基本工具的特點(diǎn)及作用?；蚬こ痰脑砑凹夹g(shù)Ⅱ基因工程的操作步驟及原理，有關(guān)概念的考查；設(shè)計(jì)某一轉(zhuǎn)基因生物的培育過程，具體到目的基因的獲取方式、基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法、基因檢測與鑒定方法。第5頁/共59頁一、基因工程的誕生：

基因工程又叫做DNA重組技術(shù)。是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果實(shí)質(zhì)實(shí)例生物體外基因DNA分子水平剪切拼接導(dǎo)入表達(dá)DNA重組技術(shù)生產(chǎn)人類需要生物類型和生物產(chǎn)品基因重組（定向）我國科學(xué)家培育出的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉第6頁/共59頁科技探索之路基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程1、基礎(chǔ)理論突破：

①DNA是遺傳物質(zhì)的證據(jù)②DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的提出③中心法則的確立④遺傳密碼的破譯2、技術(shù)發(fā)明支持：

①基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)②工具酶的發(fā)現(xiàn)③DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明④DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)⑤重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功⑥第一例轉(zhuǎn)基因動物的問世⑦PCR技術(shù)的發(fā)明第7頁/共59頁二、DNA重組技術(shù)的基本工具——工欲善其事，必先利其器分子手術(shù)刀：

——限制性核酸內(nèi)切酶分子縫合針：

——DNA連接酶分子運(yùn)輸車：

——載體第8頁/共59頁1、限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀

限制性核酸內(nèi)切酶簡稱限制酶，主要是從原核生物

中分離純化出來的。如：EcoRⅠ、SmaⅠ等。限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某些特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。大多數(shù)限制酶的識別序列由

6個核苷酸組成，如：EcoRⅠ、SmaⅠ等。也有少數(shù)限制酶的識別序列由4、5或8個核苷酸組成。經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有粘性末端和平末端兩種形式。第9頁/共59頁限制酶的識別序列：第10頁/共59頁

大腸桿菌中的一種限制酶（ECORⅠ）能夠?qū)Ｒ蛔R別—GAATTC—序列，并在G和A之間將這段序列切開。平末端平末端限制酶的功能黏性末端黏性末端GCTTAAAATTCGECORⅠCGGGCCCCCGGGSmaⅠSmaⅠ能夠識別—CCCGGG—序列，并在C和G之間切開。第11頁/共59頁尋根問底:你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。第12頁/共59頁如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？要獲得某個目的基因須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？一個目的基因有幾個黏性末端？把兩者的黏性末端通過堿基配對黏合起來，這樣就真的合成重組的DNA分子了?限制性內(nèi)切酶切割的部位是哪里？要切兩個切口會產(chǎn)生相同的黏性末端實(shí)際還不夠，還需要DNA連接酶進(jìn)行連接。脫氧核糖與磷酸之間的磷酸二酯鍵思考產(chǎn)生四個黏性末端兩個第13頁/共59頁DNA連接酶2、DNA連接酶——分子縫合針

連接DNA兩條鏈骨架上的缺口，形成

磷酸二酯鍵。GCTTAAAATTCG第14頁/共59頁DNA的結(jié)構(gòu)CATGCATGCATGCATG氫鍵磷酸二酯鍵DNA連接酶DNA聚合酶DNA（水解）酶解旋酶限制酶第15頁/共59頁DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)尋根問底比較DNA連接酶與DNA聚合酶

只能將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵

在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵

以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈

將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板第16頁/共59頁3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車（1）載體的作用：將外源基因送入受體細(xì)胞（2）載體的種類：質(zhì)粒λ噬菌體的衍生物動、植物病毒（3）質(zhì)粒：

是一種

裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌

擬核DNA以外的，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。第17頁/共59頁大腸桿菌質(zhì)粒的特點(diǎn)：質(zhì)粒

有復(fù)制原點(diǎn)，能攜帶著插入的目的基因一起復(fù)制，使目的基因擴(kuò)增。

有切割位點(diǎn)，可供外源基因插入。

有標(biāo)記基因，可用于鑒定和選擇。第18頁/共59頁載體應(yīng)具備的條件：1、有切割位點(diǎn)——供外源DNA片段(基因)插入。限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外。2、能自我復(fù)制——提供大量的目的基因。3、有標(biāo)記基因——供重組DNA的鑒定和選擇。4、載體DNA必需是安全的——不能被受體細(xì)胞清除，不能傷害受體細(xì)胞，也不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5、載體DNA分子大小應(yīng)適合——以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。第19頁/共59頁基因工程的基本工具分子手術(shù)刀：

—限制性核酸內(nèi)切酶分子縫合針：

—DNA連接酶分子運(yùn)輸車：

—載體第20頁/共59頁三、基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定基因操作“四步曲”第21頁/共59頁1、目的基因的獲?。?）概念：目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。（2）獲取方法：從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成即：將需要的基因從供體生物細(xì)胞內(nèi)提取出來自然界人工第22頁/共59頁從基因文庫獲取目的基因基因文庫基因組文庫部分基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。如：cDNA文庫第23頁/共59頁基因文庫的構(gòu)建（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钤S多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成核酸酶HDNA聚合酶與載體連接導(dǎo)入受體菌群逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈DNA該生物的cDNA文庫第24頁/共59頁推測通過DNA合成儀人工直接合成目的基因DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRAN的核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。推測合成第25頁/共59頁基因文庫包括

總結(jié)mRNAPCRcDNA(互補(bǔ)DNA)生物材料DNA人工合成一定大小范圍DNA獲取目的基因基因組文庫cDNA文庫限制酶切割反轉(zhuǎn)錄第26頁/共59頁利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第27頁/共59頁P(yáng)CR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)（1）概念：PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）的縮寫,它是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，將基因的核苷酸序列不斷的加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加。因?yàn)檎麄€過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。高溫變性（90~95℃）低溫退火（55~60℃）中溫延伸（70~75℃）多次重復(fù)（2）過程：

以指數(shù)形式（2n）擴(kuò)增。（3）特點(diǎn)：第28頁/共59頁P(yáng)CR技術(shù)的過程①DNA變性：（90℃-95℃）：雙鏈DNA受熱后，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。②退火：（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，形成局部雙鏈。③延伸：（70℃-75℃）：在熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。如此循環(huán)往復(fù)，使基因成指數(shù)形式擴(kuò)增。第29頁/共59頁原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)啟動子基因間區(qū)基因間區(qū)基因間區(qū)基因B基因A基因C編碼區(qū)上游的非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)下游的非編碼區(qū)終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)基因能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)不編碼蛋白質(zhì),但能調(diào)控遺傳信息的表達(dá)第30頁/共59頁編碼區(qū)上游的非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)下游的非編碼區(qū)真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)啟動子編碼區(qū)上游的非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)下游的非編碼區(qū)終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)基因啟動子終止子外顯子內(nèi)含子真核原核編碼區(qū)中能編碼蛋白質(zhì)的序列不編碼區(qū)中編碼蛋白質(zhì)的序列第31頁/共59頁2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心（1）構(gòu)建過程：（2）基因表達(dá)載體的組成：插入基因啟動子終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)目的基因啟動子終止子復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因第32頁/共59頁3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞（大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。轉(zhuǎn)化：

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。第33頁/共59頁轉(zhuǎn)化方法：方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞思考：為什么常選用微生物作為受體細(xì)胞？第34頁/共59頁農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上第35頁/共59頁基因槍法花粉管通道法空氣加速管微彈材料注入DNA第36頁/共59頁導(dǎo)入動物細(xì)胞顯微注射儀將目的基因注射到動物細(xì)胞第37頁/共59頁導(dǎo)入微生物細(xì)胞Ca2+處理易被吸收感受態(tài)細(xì)胞原核生物：作為受體細(xì)胞。繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少。質(zhì)粒不易被吸收第38頁/共59頁細(xì)胞類型常用方法受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法體細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA動物細(xì)胞顯微注射技術(shù)受精卵將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵→受精卵→顯微注射→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→發(fā)育成為具有新性狀的動物微生物細(xì)胞Ca2+處理法原核細(xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胧荏w的方法39第39頁/共59頁DNA4、目的基因的檢測和鑒定目的基因（DNA）復(fù)制RNA轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)翻譯性狀——檢查是否成功個體水平鑒定檢測染色體的DNA上是否插入了目的基因個體水平鑒定——性狀鑒定分子水平檢測——分子雜交檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì)

分子雜交DNA—DNA

（探針）抗蟲、抗藥、抗病等接種試驗(yàn)分子雜交DNA—RNA

（探針）分子雜交抗原—抗體第40頁/共59頁DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究第41頁/共59頁原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)基因1基因2基因間區(qū)基因間區(qū)基因間區(qū)DNA編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)基因mRNA氨基酸序列蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯第42頁/共59頁

全力投入會使你與眾不同，你是最優(yōu)秀的，你一定能做的更好！

請拿出你的課本（1--16頁），雙色筆和學(xué)案，還有你的你準(zhǔn)備好了嗎？激情第43頁/共59頁1、簡述DNA重組技術(shù)所需三種基本工具的作用。2、認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。3、簡述基因工程原理及基本操作程序。4、嘗試設(shè)計(jì)某一轉(zhuǎn)基因生物的研制過程。【重點(diǎn)和難點(diǎn)】1、三種基本工具及其作用。2、基因工程載體需要具備的條件。3、基因工程基本操作程序的四個步驟。4、從基因文庫中獲取目的基因，PCR技術(shù)?！緦W(xué)習(xí)目標(biāo)】第一講基因工程的基本工具和操作程序第44頁/共59頁一、自主糾錯、瘋狂記憶（約3分鐘）對照參考答案糾正導(dǎo)學(xué)案的錯誤并理解記憶。要求：

靜心、動腦，深入思考。讓自己知道哪些懂了，哪些還不懂，不懂的要用紅筆畫出來，以便討論時重點(diǎn)突破。第45頁/共59頁溫馨提示瘋狂記憶1、基因工程的概念。2、基因工程的基本工具。3、基因操作的基本程序。全力投入會使你與眾不同,你是最優(yōu)秀的。你一定能做的更好！第46頁/共59頁二、小組合作、討論解疑（約10分鐘）要求：1、組長負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)好分層討論，先一對一討論（3-5分鐘），然后組內(nèi)討論，糾正好答案。要求每個人都有事干，注重討論的效率。2、要討論出自己的東西，討論完的同學(xué)整理總結(jié)知識，注意總結(jié)本組好的解題方法和規(guī)律，準(zhǔn)備展示。討論內(nèi)容：1、自學(xué)中不能獨(dú)立解決的問題。2、一會兒要展示的問題：（1）【自主預(yù)習(xí)】（2）【合作探究】

（3）【課堂檢測】比一比，看一看，哪個小組效率高？第47頁/共59頁三、踴躍展示、高效點(diǎn)評、大膽質(zhì)疑：展示要求：

1、口頭展示：面向同學(xué)、語言簡潔、準(zhǔn)確，聲音洪亮；書面展示：規(guī)范快速，注重總結(jié)規(guī)律方法。2、討論完畢總結(jié)整理完善，力爭全部過關(guān)。非展示同學(xué)：

在同學(xué)展示的時候繼續(xù)討論或記憶總結(jié)。并學(xué)會傾聽，學(xué)會整理自己的答案，準(zhǔn)備點(diǎn)評補(bǔ)充和質(zhì)疑。點(diǎn)評要求：1、點(diǎn)評時聲音洪亮脫稿，注重自己的“教態(tài)”。2、點(diǎn)評講究方法：先評書寫、再評對錯、后總結(jié)方法規(guī)律。3、點(diǎn)評講究效率：言簡意賅，遇不明白時及時讓給其他同學(xué)。非點(diǎn)評同學(xué)：注意傾聽、思考，關(guān)鍵內(nèi)容做好筆記，有補(bǔ)充或不明白的地方及時、大膽提出。第48頁/共59頁

踴躍展示（5分鐘）、高效點(diǎn)評（15分鐘）展示內(nèi)容（A班）展示點(diǎn)評（1）基因工程的三種基本工具及其作用（4）【課堂檢測】6、7（2）基因操作的基本程序（5）【課堂檢測】8、9（3）【課堂檢測】1、4、55組6組1組2組3組（6）【課堂檢測】104組1組2組3組4組5組6組第49頁/共59頁

踴躍展示（5分鐘）、高效點(diǎn)評（15分鐘）展示內(nèi)容（1、2班）展示點(diǎn)評（1）三種基因操作工具及其作用（4）【課堂檢測】4、5（5）【課堂檢測】6（3）【課堂檢測】1、31組2組3組4組5組6組8組9組7組（6）【課堂檢測】7（7）【課堂檢測】8（8）【課堂檢測】9（9）【課堂檢測】106組7組8組9組1組2組3組4組5組（2）基因操作的基本程序第50頁/共59頁【課堂檢測】參考答案1—9、CCADBDDDD（3）可以連接，因?yàn)閮煞N限制性內(nèi)切酶切割后所形成的黏性末端是相同的（可以互補(bǔ)的）。10、（1）（2）第51頁/共59頁【合作探究】參考答案1、不能。因?yàn)橐话慊蛴猩锨€堿基對。2、可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對（也可能